Cabrera Rendón Citlalli Odaliz y Plata Ortiz Mario Alberto Grupo: 4QM2 Sección:4
Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Laboratorio de Bioquímica General Práctica: Curva tipo de azucares reductores Objetivos
Se realizó una curva tipo para medir los micromoles de azúcar reductor con base a su absorbancia, para así medir la actividad de la enzima invertasa en experiencias posteriores para evaluar la cinética enzimática. Presentación de resultados
Como resultado de la experiencia se obtuvo la siguiente tabla con las abso rbancias de cada problema y su cantidad de cada uno de los reactivos importantes en la reacción ( FIg.1 FIg.1)) y en seguida se representa como se obtuvieron los μmol/2ml de azúcar reductor de uno de los tubos.
Reactivos
Blanco Blanco
1
2
0
0.1
0.2
0.5 0 0
0.5 0.056 1
0.5 0.139 2
Glucosa 0.005 M (mL) Fructosa 0.005M (mL) Sacarosa 0.2 M (mL) Absorbencia Azucar reductor (μM/2mL)
Problema 3
4
5
0.4
0.8
1
0.5 0.288 4
0.5 0.805 8
0.5 0.898 10
Observación Fig. 1. Tabla de resultados experimentales, representando el contenido de cada tubo, su absorbancia y su concentración en μM/2mL.
Cálculos realizados: Conversión a μM/2mL de tubo 4. Glucosa + Fructosa = 0.005 + 0.005 = 0.01 mol/L 0.01 moles – 100mL α – 0.8mL α = 8x10-6 mol. 1 mol – 1000000 μmol β = 8 μmol 8x10-6 mol – β Representando gráficamente la curva tipo de la absorbancia (nm) contra concentración de azúcar reductor en μmol/2mL queda la siguiente recta, con la ecuación y=a+bx y una r 2 de 0.98 (Fig.2 (Fig.2). ).
Absorbancia contra μmol/2ml 1 y = 0.9138x R² = 0.9805
0.9 0.8 0.7
) m n 0.6 ( a i c n 0.5 a b r o 0.4 s b A
Absorbancia contra μmol/2ml Linear (Absorbancia contra μmol/2ml)
0.3 0.2 0.1 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
μmol/2mL
Fig. 2. Gráfica tipo de la concentración de azucares reductores en μmol/2mL respecto a su absorbancia.
Reacción química llevada a cabo en la práctica:
Fig. 3. Reacción para identificar la formación de azucares reductores.
Discusión
De acuerdo a los resultados se pudo obtener la curva tipo de azucares reductores que se muestra en la fig. , en la cual se observa la relación entra la concentración del azúcar reductor con respecto a la absorbancia, basándose en la existencia de una relación en principio lineal entre dichas relaciones (absorbancia y concentración) pues los valores de absorbancia fueron aumentando conforme aumentaron las concentraciones en micromoles de los carbohidratos, que aunque en la gráfica no se observa la formación de una recta como tal podemos deducir que si se trata de una, puesto que el valor de r que se obtuvo en los cálculos realizados en la regresión lineal es cercano a 1, esto indicándonos que se trata de una recta. Así también pudimos observar la reacción en medio alcalino que se llevó acabo entre los azucares reductores (glucosa y la fructosa) y el 3,5 DNS (Ácido dinitrosalicílico) que es de color amarillo originalmente, el cual se reduce en presencia del grupo reductor de la glucosa, formando el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico provocando un vire de color rojo, mientras que el grupo aldehído reductor se oxida, para formar un grupo carboxílico. Dicho DNS se encentraba en exceso frente a los grupos reductores de tal forma que mayores concentraciones de azúcares reductores provocan una mayor coloración de la muestra. Estas diferencias de coloración se pudieron determinar por espectrofotometría visible, a la longitud de onda de máxima absorbancia de 540 nm. Esto pudo comprobarse en el tubo de ensayo donde estaban los dos azucares reductores, la glucosa y la fructosa, que si bien, este carbohidrato por sí solo no es un azúcar reductor, tiene un equilibrio llamado ceto- enol, que es por definición un equilibrio entre dos isómeros que se defendían en la posición de un grupo funcional, donde el isómero ceto es el mayoritario con respecto al enol (NOTA: todos los carbonilos son capaces de tener esta tautomería, pero como la concentración del enol es tan baja no lo nombran); no obstante, mediante una catálisis básica uno desplaza el equilibrio a la forma enol. Con respecto a la D-fructosa, cuando se encuentra frente a una base, se forma un tautomero ceto, que cuando se reordena puede formar al isómero estructural de la fructosa, que es la D -glucosa.
Fig. 4. Reacción La reacción por la cual se lleva a cabo la coloración roja en el tubo con 3,5- DNS y el azúcar reductor como lo es la glucosa y la fructosa en condiciones básicas, es la siguiente, donde el 3,5-DNS cambia un grupo nitro por un grupo amino, siendo así que por cada molécula de azúcar reductor solamente reaccionaba una molécula de 3,5-DNS, desarrollando color que se puede observar en la longitud de onda de la luz visible.
Conclusiones:
La curva tipo de azucares reductores es un método empleado para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida.se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible "absorbancia” y la variable a determinar "concentración”.
El método de DNS nos permite obtener valores de las concentraciones totales de azucares reductores en una muestra problema determinada, esto mediante la comparación de una reacción testigo y su dicho nivel de absorbancia presentado. La velocidad de una reacción catalizada por un encima depende de:
-La concentración de moléculas de sustrato -La temperatura -La presencia de inhibidores -El pH del medio que afecta que afecta a la conformación de la molécula enzimática. Bibliografía:
Nelson D.L. & M. Cox. 2000. “Principios de bioquímica” 3ra edición. Editorial omega. 113-242 paginas consultadas. Bibian L. & R.M. Rojas.2014. “manual de métodos generales para determinación de ca rbohidratos”
UPTC. 7-10 paginas consultadas.
