Determinacion de Azucares Reductores ( DNS)

1-1-2015

DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES POR ESPECTROFOTOMETRÍA (MÉTODO DNS)


I. INTRODUCCIÓN Los azucares reductores son aquellos azucares que poseen su grupo carbonilo (grupo funcional) intacto, y que a través del mismo pueden reaccionar como reductores con otras moléculas. Todos los monosacáridos son azucares reductores, ya que al menos tienen un – OH hemiacetálico libre, por lo que dan positivo a la reacción con reactivo de Fehling, a la reacción con reactivo de Tollens, a la Reacción de Maillard y la Reacción de Benedict. Otras formas de decir que son reductores es decir que presentan equilibrio con la forma abierta, presentan mutarotación (cambio espontaneo entre las dos formas cicladas α (alfa) y β (beta)), o decir que formas osazonas. Un azúcar reductor agregado al reactivo de Smogyi, va a producir un precipitado de cobre reducido, en la forma de hidrato cuproso y oxido cuproso, que va a tener un color rojo o amarillo, en su medio básico (pH 9). En estas condiciones se oxidan en su medio ácido (pH 1,2 - 2,0) el arsenato y molibdato del reactivo de Nelson, dando origen a la formación de molibdeno azul, coloración que se mantiene estable por 24-36 horas y que puede leerse mediante un espectrofotómetro a 520nm para la determinación de la concentración (Nelson, 1944; Somogyi, 1952; Gonzales & Castellanos, 2003 Los azucares reductores poseen un grupo carbonilo formando un grupo hemiacetal que le confiere la característica de poder reaccionar con otros compuestos. El método de Miller o DNS (ácido dinitrosalicilico) como reactivo tiene la capacidad de oxidar los azucares reductores mostrando un comportamiento comportamiento diferencial hacia mono y disacáridos, dando resultados colorimétricos que se puede medir con una longitud de onda de 575 nm.

1


II.

OBJETIVOS

Establecer la longitud de anda de la máxima absorción para las diferentes soluciones coloreadas. Conocer y aplicar los principios de la curva patrón aplicada a la cuantificación de azucares reductores con el reactivo 3,5-dinitrosalcilico (3,5 DNS) Cuantificar los azucares reductores presentes en el alimento.

2

III.

FUNDAMENTO TEORICO

Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempeñan un papel relevante, por ejemplo, el sabor está dado básicamente por un balance entre azúcares y ácidos orgánicos. El sabor característico de y diferente de las frutas se debe a la gran variación en composición y concentración de los azúcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucósidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está determinada por los polisacáridos estructurales. Es importante señalar que las proporciones de los diversos carbohidratos existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia de la actividad metabólica, ya que durante la maduración se producen cambios intensos en donde los azúcares son los sustratos preferidos para la biosíntesis y suministro de energía pues son oxidados (vía glucólisis) hasta ácido pirúvico, el


cual a su vez, por descarboxilación oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, vía ciclo de Krebs, dando lugar a la formación de CO 2, H2O y ENERGÍA la cual queda disponible para la biosíntesis de otros componentes (otros azúcares, ácidos orgánicos, ácido ascórbico, proteínas, nucleótidos azucarados, glucósidos, etc.). Durante todo este proceso, el contenido de azúcares aumenta casi invariablemente básicamente por hidrólisis que experimentan los polisacáridos, aunque algunos azúcares sean utilizados como sustratos para la actividad respiratoria. Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su determinación: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, HagerdornHensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio: Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas. Una de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma. Esta técnica se llama Espectrofotometría. Se puede utilizar el espectrofotómetro para determinar la longitud de onda de la radiación necesaria para las determinaciones de la cantidad de azúcar en las muestras bajo estudio, comparándola después con la radiación absorbida por un blanco.

3


La regla específica que relaciona la cantidad de radiación absorbida por una substancia con la concentración de esa misma substancia se llama Ley de Beer y se puede establecer como sigue:

Log Io = abc I En donde:

Io = Radiación incidente o radiación transmitida por el blanco. I = Radiación transmitida por la muestra.

Log Io = absorbancia de la muestra I

En donde:

a = coeficiente de absorbancia (absortividad) – las unidades dependen de las unidades utilizadas para la determinación de la concentración. b = longitud de la celda usualmente en centímetros. c = concentración de la muestra en las unidades apropiadas.

Los carbohidratos también llamados azúcares, osas o sacáridos, son polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas o compuestos poliméricos que por hidrólisis producen polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas. Según el número de unidades de azúcares sencillos que posean se clasifican en:



MONOSACÁRIDOS o azúcares sencillos, que a su vez pueden ser ALDOSAS cuando contienen el grupo aldehído o CETOSAS cuando contienen el grupo cetona. Los monosacáridos naturales pertenecen a la serie D de los azúcares y pueden tener entre tres y hasta siete átomos de carbono.

4




DISACÁRIDOS que están formados por dos monosacáridos unidos entre sí por enlaces glucosídicos.



OLIGOSACÁRIDOS que tienen entre tres y diez monosacáridos unidos también por enlaces glucosídicos.



POLISACÁRIDOS que son polímeros naturales con varios miles de unidades de azúcar sencillo ligadas entre sí.

5 De acuerdo con lo anterior, además de reconocer si un compuesto pertenece a la familia de los carbohidratos, es necesario diferenciar si se trata de un monosacárido tipo aldosa o cetosa, si es fácilmente oxidable o no, es decir si es un AZÚCAR REDUCTOR o no lo es, si es de cinco átomos de carbono (pentosa) o de seis átomos de carbono (hexosa), si es disacárido o polisacárido.



ENSAYO DE MOLISCH: Este ensayo es un ensayo para reconocimiento general de carbohidratos en el que los polisacáridos y disacáridos se hidrolizan con ácido sulfúrico concentrado hasta monosacáridos y se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural los cuales reaccionan con α-naftol formando un color púrpura violeta.



ENSAYO DE BENEDICT: El ensayo de Benedict permite el reconocimiento de carbohidratos reductores, al igual que el reactivo de Felhing, el de Benedict contiene ion cúprico en medio alcalino que se reduce hasta óxido cuproso en presencia de azúcares con el hidroxilo hemiacetálico libre.



ENSAYO DE BARFOED: Esta prueba permite diferenciar entre monosacáridos y disacáridos reductores, también contiene ion cúprico que se reduce hasta óxido cuproso más rápidamente con los monosacáridos que con los disacáridos.



ENSAYO CON LUGOL: El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de yodo y yoduro, permite reconocer polisacáridos, particularmente el almidón por la formación de una coloración azul- violeta intensa y el glicógeno y las dextrinas por formación de coloración roja.

DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES POR ESPECTROFOTOMETRÍA (MÉTODO DNS) 

ENSAYO DE SELIWANOFF: Este ensayo es específico para cetosas y se basa en la conversión de la cetosa en 5-hidro-metil-furfural y su posterior condensación con resorcinol formando así complejos coloreados.



ENSAYO DE BIAL: El reactivo de Bial contiene orcinol en ácido clorhídrico, el cual forma complejos de coloración sólo con las pentosas.

De otro lado una propiedad importante que permite identificar los carbohidratos, y determinar el grado de pureza de los mismos, particularmente monosacáridos es la rotación óptica ocasionada por la presencia de centros asimétricos o quirales en la estructura molecular, los cuales desvían el plano de luz polarizada. Esta propiedad no es exclusiva de los carbohidratos pues la presentan todas aquellas sustancias denominadas óptimamente activas, por tener en su estructura centros quirales. Para la medición de la rotación óptica los factores importantes a tener en cuenta son: La longitud de onda de luz polarizada, la cantidad de material óptimamente activo, y la naturaleza del solvente cuando se usa. Los cambios en la temperatura ocasionan solo pequeñas variaciones en las medidas de la rotación.

La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada

6


desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido. Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede estar en fase líquida, sólida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagnético, la muestra es generalmente disuelta para formar una solución. Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que muestra la cantidad de energía radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a una determinada longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto (Fig. 1).

IV.

4.1.

EXPERIMENTACION

MATERIALES.

A) Materiales: Materiales de vidrio: Fiolas, pipetas, vasos de precipitados

7


B) Reactivos DNS 

Tartrato de Sodio y Potasio



Hidróxido de Sodio  Metabisulfito de Sodio 

Reactivo DNS

8 C) Equipos 

Espectrofotómetro UV-Vis-NIR JASCO, MODELO v-670



Centrifuga digital Sigma



Agitador para tubos de ensayos.


METODOLOGÍA.

4.2.



PREPARACIÓN DEL REACTIVO DNS Se prepara según el método propuesto por Coughlan y Moloney. Se añade 10 g de ácido dinitrosalicílico (DNS) y 300 g de tartrato de sodio y potasio (sal de Rochelle) a 800 ml de NaOH 0,5 N y se calienta suavemente para disolver los reactivos. El volumen se completa hasta 1,0 L con agua destilada (MP Coughlan, AP Moloney, 1988).



PREPARACIÓN DE LA CURVA PATRÓN Se implementa el mismo método para realizar la curva patrón, como se describió en el método fenol-sulfúrico. Empleando una solución patrón de glucosa con una concentración de 1.0 g/L, para la cual se disuelve 0.1 gramos de glucosa en 90 ml de agua y se lleva a volumen a 100 ml. Esta solución patrón se prepara a diferentes concentraciones adicionando a cada tubo 1 ml del reactivo DNS con agitación constante. Posteriormente se lleva a baño maría durante 15 minutos se deja enfriar y se añade agua destilada hasta completar el volumen respectivo. Se determina la absorbancia de cada tubo a 575 nm en el espectrofotómetro UV.



PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Se toma 1 ml de la solución acuosa de la muestra, enseguida se adiciona 1ml del reactivo de DNS y se calienta por 15 minutos en baño maría. Se deja enfriar y se diluyen con 10 ml de agua destilada. Se procede a leer la absorbancia junto con el blanco a la misma longitud de onda que las muestras para la curva patrón.

9


V.

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN MADRE. 0.2gr de Glucosa (99.9%)

10

2gr/l Solución madre

500ul mad

400ul

300ul

200ul

100ul

50ul

madre +

madre +

madre +

madre +

madre +

100ul h2O

200ul h2O

300ul h2O

400ul h2O

450ul h2O

500ul de DNS

500ul H2O


T°= 100 °C DURANTE: 5min

TODOS LAS SOLUCIONES

11

T°= 4 °C DURANTE: 3min

Solución

Solución

Solución

Solución

Solución

Solución

Solución

+ 5ml de

+ 5ml de

+ 5ml de

+ 5ml de

+ 5ml de

+ 5ml de

+ 5ml de

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

LLEVAR LA SOLUCIÓN HACER ANALIZADA EN EL ESPECTOFOTOMETRO


PESO (Jugo): 52.5259

PESO (Jugo): 70,87

12 Extracción del jugo

4 tubos - Naranja

3 tubos - Mandarina t= 20 min

Solución

Solución

50 + 450ml

20

de H2O

Solución 50 +

Solución 20 +

480ml

450ml

480ml de

de H2O

de H2O

H2O

+

Adicionar DNS 500  c/u


13

EN CALOR : En un tiempo de 5 min

EN FRIO : En un tiempo de 3 min

Agregar 5ml de agua destilada a c/u

HOMOGENIZAR


GRUPO C

VI.

Volumen Solución Madre (µl) 500 400 300 200 100 50 -

1 2 3 4 5 6 7

RESULTADOS

Volumen H2O (µl)

g/L

Absorbancia

100 200 300 400 450 500

2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0

0.6467 0.5247 0.4316 0.2326 0.1216 0.0714 0

Abs Vs C 2

0.69 0.66 0.63 0.6 0.57 0.54 0.51 0.48 0.45 0.42 0.39 0.36 0.33 0.3 0.27 0.24 0.21 0.18 0.15 0.12 0.09 0.06 0.03 0

1.6

1.2

0.8

0.4

0.2

0 0.6467

0.5271 0.4316

0.2326

0.1216 0.0714 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

14


GRUPO A

Volumen Solución Madre (µl)

1 2 3 4 5 6 7

500 400 300 200 100 50 -

Volumen H2O (µl) 100 200 300 400 450 500

g/L

Absorbancia

2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0

0.6895 0.5343 0.4411 0.2713 0.0964 0.0551 0

15

0.8 0.7

y = 0.1204x - 0.063 R² = 0.9695

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 -0.1 -0.2

1

2

3

4

5

6

7


GRUPO B


1 2 3 4 5 6 7

500 400 300 200 100 50 -

Volumen H2O (µl) 100 200 300 400 450 500

0.8

g/L

Absorbancia 16

2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0

0.7239 0.5729 0.4350 0.2835 0.1344 0.0737 0

y = 0.124x - 0.0542 R² = 0.9797

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 -0.1

1

2

3

4

5

6

7


GRUPO D


1 2 3 4 5 6 7

500 400 300 200 100 50 -

Volumen H2O (µl) 100 200 300 400 450 500

g/L

Absorbancia

2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0

0.7244 0.5735 0.4328 0.2826 0.1368 0.0551 0

0.8 y = 0.1255x - 0.062 R² = 0.9801

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 -0.1 -0.2

1

2

3

4

5

6

7

17


RESULTADOS Naranja – Mandarina Volumen Solución Madre (µL)

Volumen H2O (µL)

g/L

Absorbancia

50 µL

450 µL

20

0.9601

20 µL

480 µL

50

0.2785

50 µL

450 µL

20

0.8041

20 µL

480 µL

50

0.3211

NARANJA

MANDARINA

Naranja 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 20

50 Absorbancia

Mandarina 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 20

Absorbancia50

18


VII.

DISCUSIONES



Los azucares reductores también pueden variar en su porcentaje según el tipo de fruta por lo que la cantidad de azucares reductores va a estar influenciada por las condiciones de la fruta, (Silveira et al, 2007).



Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+ Hg+Cu2+ y Fe (CN) 63- y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.



Es importante señalar que las proporciones de los diversos carbohidratos existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia de la actividad metabólica, ya que durante la maduración se producen cambios intensos en donde los azúcares son los sustratos preferidos para la biosíntesis y suministro de energía pues son oxidados (vía glucólisis) hasta ácido pirúvico, el cual a su vez, por descarboxilación oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, vía ciclo de Krebs, dando lugar a la formación de CO2 H2O y ENERGÍA la cual queda disponible para la biosíntesis de otros componentes (otros azúcares, ácidos orgánicos, ácido ascórbico, proteínas, nucleótidos azucarados, glucósidos, etc.)



El sabor característico de y diferente de las frutas se debe a la gran variación en composición y concentración de los azúcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucósidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está determinada por los polisacáridos estructurales.

19


VIII.



CONCLUSIONES

Con esta práctica pudimos determinar de manera cuantitativa la concentración de azucares en determinadas muestras con concentraciones conocidas para poder obtener la curva patrón de la absorbancia en la muestra y muestras de concentraciones y/o disoluciones como se observa en la gráfica de los resultados, con la curva obtenida se realiza una gráfica de tendencia lineal que se ajusta a los datos.



El método DNS es un técnica colorimétrica que emplea 3.5-ácido dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación espectrofotométrica a 540nm de los azucares reductores



Comprobamos que la espectrofotometría es el método de análisis óptico más adecuado para la determinación de una concentración en una muestra. Dicho de otro modo es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia en este cado la glucosa.

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Determinacion de Azucares Reductores ( DNS)

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