Universidad de sonora. Laboratorio de bioquímica I. Practica # 3 Reacciones de color para la identificación de aminoácidos. Equipo #2. Presenta: Zuleth Romero. Siria Calderón. Azucena García. García. 1 de octubre del 2014.
Introducción.
Las proteínas son polímeros de aminoácidos. Todos los aminoácidos tienen la misma estructura fundamental que consiste en un carbono central unido a cuatro grupos funcionales distintos: un grupo amino nitrogenado ( —NH2); un grupo carboxilo ( —COOH); un hidrógeno; y un grupo que varía entre los diferentes aminoácidos (R) Los aminoácidos difieren entre si en la estructura de sus cadenas laterales distintivas llamadas grupos R. Se han propuesto varios métodos para clasificar los amino ácidos sobre la base de sus grupo R. El más significativo se funda en la polaridad de los grupos R. Existen cuatro clases principales: 1) Grupos R no polares; 2) Polares, pero sin carga; 3) Grupos R con carga positiva y 4) Grupos R con carga negativa. Los aminoácidos difieren en sus propiedades químicas y físicas, como tamaño, solubilidad en agua, carga eléctrica, debido a sus diferentes grupos R. Por lo tanto, en gran parte la secuencia de aminoácidos determina las propiedades y la función de cada proteína —si es soluble en agua, y si es una enzima, una hormona o una proteína estructural. En algunos casos, basta un error en un aminoácido para que la proteína no funcione correctamente. Al igual que los lípidos y los polisacáridos, las proteínas se forman como resultado de la síntesis por deshidratación. El nitrógeno del grupo amino ( —NH2) de un aminoácido se une al carbono del grupo carboxilo ( —COOH) de otro aminoácido, con un enlace covalente sencillo. Este enlace se llama enlace peptídico y la cadena resultante de dos aminoácidos se conoce como péptido. Se agregan más aminoácidos, uno por uno, hasta que se completa la proteína. Las cadenas de aminoácidos en las células vivas varían en cuanto a longitud, desde tres hasta miles de aminoácidos. La palabra proteína o polipéptido se reserva a menudo para las cadenas largas, digamos, de 50 o más aminoácidos de longitud; en tanto que el término péptido se utiliza para referirse a cadenas más cortas. En los microorganismos, plantas y animales se encuentran alrededor de 300 aminoácidos. En la mayoría de los seres vivos solamente 20 aminoácidos son codificados por el ADN para formar las proteínas . Los aminoácidos que se encuentran en las proteínas tienen una configuración L.
Objetivo: Identificar aminoácidos según su grupo funcional R llevando a cabo diferentes reacciones Materiales: Gradilla 20 tubos de ensaye de 18x150 Vaso de precipitado de 600ml Vaso de precipitado de 250 ml 7 vasos de precipitado de 50 ml 2 pipetas de 5 ml 3 pipetas de 1 ml 2 pinzas para tuvo de ensaye Mechero, tripie y tela de asbesto Escobetilla
Procedimiento. Reacción de la ninhidrina.
1.- Con su mechero, tripie, te la de asbesto y vaso de precipitado de 250 ml prepare un baño de agua hirviendo. No llene de agua totalmente el vaso de precipitado si no más o menos a la mitad. Use agua destilada. 2.- Con masking tape o con plumón graso titule siete vasos de precipitados de 50 ml con los nombre de las muestras que van a contener y que son: albunina, alanina, tirosina, triptófano, aspártico, arginina y gelatina. 3.- Con los vasos titulados vaya a la mesa de reactivo y tome más o menos 15 ml de cada una de las muestras. Estas soluciones estarán en su mesa de trabajo para facilitar la práctica. Si al final algo sobrara se podrá regresar al frasco original, teniendo mucho cuidado de identificar bien las sustancias. 4.- coloque e n sus gradillas los 7 tubos de ensaye identificados de alguna manera con los nombre de las sustancias que se va a probar. 5.- pipetee 3 ml de cada una de las muestras a sus correspondientes tubos, cuide de no perder la identificación de las muestras. Las muestras tienen ya en sus vasos de precipitados en su lugar de trabajo. 6.- Con papel indicador cheque el pH de las muestras, si no está neutro ajústelo con mucho cuidado.
7.- Añada 1.5 ml de la solución de ninhidrina al 0.1 % a cada uno de los siete tubos. 8.- Cuando ya esté hirviendo el agua del baño que preparo coloque ahí los siete tubos al mismo tiempo y déjelos unos minutos. Vaya sacando los tubos del agua hirviendo a medida que vayan reaccionando positivamente. Si algún tubo después de 10 minutos no ha dado la reacción positiva sáquelo y considere en ese tubo una reacción negativa. 9.- Observe el color desarrollado y anote en su hoja de datos. Las características de tiempo, color de la reacción para cada tubo. La reacción que en esta parte ha practicado es la Reacción de la ninhidrina. Reacción de Millon.
1.- Coloque en su gradilla 4 tubos de ensaye y numérelos o identifíquelos de acuerdo a las muestras que va a probar que son: tirosina, alanina, albumina y gelatina. 2.- pipetee 3 ml de las soluciones correspondientes a los tubos así identificados. 3.- Coloque los tubos en el baño de agua hirviendo y déjelos por cinco minutos. 5.- saque del baño de agua hirviendo los tubos y observe el color desarrollado en algunos tubos. Identifique las muestras que estaban en los tubos de la reacción positiva. 6.- En su hoja de cálculo anote sus observaciones y resultados. Lo que acaba de realizar es la prueba llamada reacción de millón. Reacción Xandroproteica.
1.- Coloque en su gradilla 5 tubos de ensaye y numérelos o identifíquelo de alguna manera los siguientes nombres: tirosina, triptófano, alanina, albumina y gelatina. 2.- pipetee 2 ml de las soluciones en los tubos correspondientes. 3.- Con mucho cuidado añada a cada uno de los cinco tubos 1 ml de ácido nítrico concentrado. 4.- Lleve los tubos al baño de agua hirviendo y déjelos ahí por cinco minutos. 5.- Saque los tubos de ensaye del baño de agua hirviendo y enfríelos con agua corriente.
6.- Con sumo cuidado resbale lentamente con una pipeta por la pared de cada tubo 2 ml de hidróxido de amonio concentrado. 7.- Observe el resultado si la reacción es positiva se desarrollara un anillo de color naranja. 8.- Anote sus observaciones en su hoja de datos. La prueba que acaba de demostrar es la reacción xandroproteica. Resultados y observaciones:
Reacción Ninhidrina Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7
Muestra Albumina Tirosina Triptófano Gelatina Alanina Aspártico Arginina
Color Morado violeta Morado violeta Violeta Morado violeta Violeta Violeta
Tiempo 8:00 min 6:30 min 1:30 min 3:00 min 5:50 min 7:40 min
Reacción Millon Tubo No 1 2 3 4
Muestra Tirosina Albumina Gelatina Alanina
Color Rojo ↓ Amarillo- cafe↓ -
Tiempo 35 s 1:10 min -
Reacción +
Color Anillo amarillo naranja. Anillo amarillo naranja.
Reacción Xantoproteica Tubo No Muestra 1 Triptófano 2
Tirosina
+
3 4 5
Albumina Gelatina Alanina
-
Fundamentos de las reacciones. Reacción de la Ninhi drina
Esta reacción es universalmente empleada para detectar cualitativa y cuantitativamente a los aminoácidos. Esta es la única reacción verdaderamente importante. La ninhidirina es un agente oxidante poderoso y lleva a cabo de aminación oxidativa de los grupos α -amino. Libera amoniaco, bióxido de carbono, el aldehído correspondiente y la forma reducida de la ninhidirina.
El amoniaco más una molécula de ninhidrina reducida, y otra molécula de ninhidrina oxidada, al calentarse se una para producir un pigmento purpureo. La intensidad del color producido en la reacción es proporcional a la concentración del aminoácido. La reacción la dan positiva todos los aminoácidos, péptidos y proteínas que contengan un grupo amino libre.
Reacción de Millon
Es una reacción específica para grupos hidroxifenilos que puedan nitrarse fácilmente. De los aminoácidos, la tirosina es el único que da positiva la reacción. El reactivo es mercurio disuelto en ácido nítrico. El producto de la reacción es la formación de un complejo del mercurio con los derivados de nitrofenol, de un color rosa característico. Cuando se añade el reactivo a una solución proteica, se forma primero un precipitado blanco, que corresponde a la proteína coagulada por el calor, pero si la proteína contenía tirosina, ese coagulo se pondrá de color rosa rojo al prolongar un poco el calentamiento. Si la solución que se prueba es alcalina, tendrá que neutralizarse primero con un poco de clorhídrico, pues de lo contrario se precipitaría el mercurio del reactivo.
Reacción Xantop roteica
Consiste en la nitración del anillo benceno con ácido nítrico concentrado, dando derivado de nitrobenceno que son de color amarillo. Si entonces se añade hidróxido de amonio, el color se vuelve anaranjado. En las condiciones en que se hace el experimento solo la tirosina y el triptófano dan positiva la reacción. Para nitrar la fenilalanina se requiere de sulfúrico como catalizador. Si se prueba una
solución de proteína que contenga tirosina o triptófano, se formara primero un precipitado blanco al añadir el nítrico concentrado. Al calentar, ese precipitado se vuelve amarillo, y si la solución se hace alcalina, el precipitado finalmente se torna anaranjado.
Conclusión.
Las reacciones utilizadas en el proceso experimental arrojaron como resultado la correcta identificación de aminoácidos con sus determinadas características de color y precipitados. Por ejemplo en la reacción de ninhidrina fueron oxidados los grupos amino de los aminoácidos liberando asi amoniaco y algunos otros gases pero el amoniaco principalmente es unos de los participantes de la reacción de color azul violeta resultante. En el caso de la reacción de millón la identificación es especifica para los grupos que puedan nitrarse fácilmente. Y en este caso el color rosado que dio la reacción con la tirosina y el reactivo se cree que es debido a un complejo de mercurio y derivados de nitrofenol. Por ultimo con la reacción xandroproteica se dieron solo dos aminoácidos con reacciones positivas ya que estas se efectúan gracias a la nitración del anillo de benceno con el ácido nítrico concentrado para dar como productos de color amarillo o naranja.
Cuestionario: 1.- ¿ Cúal de las dos configuraciones de aminoácidos se e ncuentran en la estructura de las proteínas? En las proteínas encontramos aminoácidos con configuración L. Solamente los L-aminoácidos se fabrican en las células y se incorporan a las proteínas. Algunos D-aminoácidos se encuentran en las paredes de las células de las bacterias, pero no en proteínas bacteriales.
2.- ¿Cuales son las características de solubilidad de los aminoácidos?
Apolares: Los grupos R hidrocarbonados son apolares e hidrofóbicos. Polares: los grupos R de estos aminoácidos son más solubles en agua, o hidrofílicos, que los aminoácidos apolares, debido a que contienen grupos funcionales que forman puente de H con el agua. Aquí se incluyen la serina, treonina, cisteína, metionina, asparagina y glutamina. Aromáticos: La fenilalanina, tirosina y el triptófano con sus cadenas laterales aromáticas son relativamente apolares. Todos ellos pueden participar en interacciones hidrofóbicas, las cuales son especialmente fuertes cuando los grupos aromáticos se apilan los unos sobre los otros. El grupo –OH de la tirosina puede formar puentes de H y actúa como un grupo funcional importante en la actividad de algunas enzimas. La tirosina y el triptófano son significativamente más polares que la fenilalanina. Los aminoácidos son compuestos orgánicos, unos son más solubles que otros en agua y en solventes orgánicos. 3.- En sus cursos de química inorgánica ¿Recuerda haber tocado ácido nítrico? ¿Qué pasó y qué reacción era? Se genera una mancha amarilla en la zona con la que se entró en contacto. El fenómeno que ocurre es lo que se conoce como desnaturalización, o sea básicamente se alteran algunas de las estructuras secundaria, terciaria o cuaternaria de las proteínas y precipitan, esto puede ocurrir por varias causas: alteración del pH, calor, presencia de sales, etc.
Bibliografías: Bioquímica I Eva Irma Véjar Rivera, Jesús Rubén Garcilaso Pérez. Hermosillo, Sonora, Editorial Universidad de Sonora 2010. AminoácidosReacciones de Identificación, pág. 172-174 Prácticas de Bioquímica Descriptiva Eva Irma Véjar Rivera. Hermosillo, Sonora, Editorial UniSon 2005. Lectura 7 - Reacciones de color para aminoácidos, pág. 165-168 Audesirks T, Audesirk G., Byers, Biología en la Vida en la Tierra, octava edición, Pearson educacion.
http://acemucsc.galeon.com/articulos/Bioquimica/aminoacidos.htm
Lehninger, Bioquimica, cuarta edición
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