PRACTICA N° 1 Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre Mtodo de !anger"
INTR#D$CCI%N El método de Sanger para la determinación de aminoácid aminoácidos os terminales terminales es un método método útil y tardado para determinar el N-terminal de los polipepti polipeptidos, dos, fue descrito descrito por Sanger, Sanger, quien enco encont ntró ró el grup grupo o alfa alfa ami amino libr libre e de la insu insuli lina. na. El 1-fl 1-fluo uoro ro- -,! ,!-d -din init itro robe benc ncen eno o "#N$%& reacciona con péptidos protonados , form forman ando do deri' deri'ado ados s ,!,!-di dini nitr trof ofeni enila lado dos. s. (uan (uando do tale tales s deri deri'a 'ado dos s de un pépt péptid ido o se somete someten n a )idról )idrólisi isis s con *(l +N, todos todos los enla enlace ces s pept peptid idic icos os se )idr )idrol oli ian an,, pero pero el enlace enlace entre entre el grupo grupo ,!-di ,!-dinit nitrof rofeni enilo lo y el grupo alfa amino del aminoácido N-terminal es esta establ ble e fren frente te a la )idr )idról ólis isis is acid acida, a, por lo cons consig igui uien ente te,, el )idr )idrol oli iad ado o del del pépt péptid ido o dinitrofe dinitrofenila nilado do contiene contiene todos los restos restos de aminoácidos de la cadena peptidica en forma de aminoácidos libres, a ecepción del resto N-term N-termina inal, l, el cual cual aparec aparece e como como deri'a deri'ado do ,!-di ,!-dinit nitrof rofeni enilad lado, o, de color color amari amarillo llo,, este este resto resto puede puede separa separarse rse e identi identific ficars arse e por medi medio o de una una crom cromat atogr ograf afa a en pape papell en dond donde e se )ace )ace la comp compar arac ació ión n con con los los aminoácidos conocidos.
#&'(TI)# /dentific /dentificar ar el aminoáci aminoácido do alfa-ami alfa-amino no terminal terminal de las cadenas de la molécula de )emoglobina mediante el método de Sanger.
con el *(l al +N ya que rompe los enlaces peptidicos aplicando temperatura y presión. En la crom romatog atogrrafa, fa, se comp compar arar ar los aminoácidos conocidos con nuestro problema para para lle' lle'ar ar a cabo cabo la iden identi tifi fica caci ción ón de Nterm termin inal al,, al igua iguall se col coloca oca #N$% #N$% para para autenticar que el problema quedo sin residuos de este reacti'o.
R(!$*TAD#!
+ig"1"1 (s,uema de la Cromatograf-a en papel de aminoácidos conocidos comparados con la muestra problema . DN+&"
CA*C$*#! 4esultados de los 'alores de 4f obtenidos #istancia del frente 5 21cm
INT(RPR(TACI%N D( R(!$*TAD#! R(!$*TAD#! $órmula6 En la dete deterrmina minaci ción ón de 0mino minoac aciidos dos terminales se usa el #N$% para que pueda reaccionar con el N-terminal, acondicionando el medio, el cual se le agrega Na*(2 para tener cond ondiciones alc alcalinas y pode oder desp despro roto tona narr el grupo grupo amino amino,, el cual cual al enla enlaa ars rse e con con el #N$% #N$% gene genera ra la dinitr dinitrofe ofenil nilaci acion, on, el *(l *(l proton protonara ara al grupo grupo amino y reforara el enlace del #N$% con la )emoglobina, se elimina el eceso de reacti'o con las etracciones de éter y el ba3o maria, el tercer paso es la )idrólisis y se lle'a a cabo
Rf
Distancia Distancia recorrida recorrida de Fasemovil Fase movil Distancia Distancia recorridadel recorridadel producto producto
=
PRACTICA N° 1 Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre Mtodo de !anger" AN/*I!I! D( R(!$*TAD#!
Sustitución
En el esquema de la cromatografa podemos obser'ar que los patrones de los aminoácidos se 'en con una sola banda a cierta distancia, en el problema se obser'an bandas, una a ni'el del #N$%, lo cual indica que no se lle'o correctamente las etracciones con éter, y por ello, quedaron residuos del reacti'o, la otra banda esta a ni'el de la
#N7-7*E
•
Rf
=
20.2 cm 31 cm
4f 5 8.+9 •
Rf
=
#N7-0:0
21.4 cm 31 cm
C#NC*$!I%N(!
4f 5 8.+; •
Rf
=
#N7-<0:
-
El método de Sanger es un método inespecfico y tardado para la determinación de a.a terminales
-
:a determinación de aminoácido Nterminal con el método de Sanger se resume en ! pasos.
-
En la dinitrofenilacion, el reacti'o de Sanger se une a la protena
-
El *(l al 2N refuera el enlace del #N$% con la )emoglobina además detiene la reacción de dinitrofenilacion
0
El *(l al +N )idrolia la protena
-
El aminoácido N-terminal encontrado en )emoglobina fue 'alina.
21.9 cm 31 cm
4f 5 8.=8
Rf
=
16.5 cm 31.5 cm
•
Rf
=
7roblema
21.8 cm 30 cm
Compuesto
Rf
4f 5 8.=8
&I&*I#RA+2A DNP-PHE
0.65
DNP-ALA
0.69
DNP-VAL
0.70 •
PROBLEMA
0.70
DNFB
0.49
>40N? >regory 0., (ran@s)aA Bar@ C., >or@a Do)n. Edman sequencing as tool for c)aracteriation of syntretic peptides. Bet)ods in Enimology. "1;;=&. 7ags. F;62;9-!1! :e)ninger, 0lbert, Nelson, #a'id :. "1;;2&. 7rincipios de bioqumica. Segunda edición, ediciones mega, %arcelona, Espa3a.
