CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS AMINOÁC IDOS
MANCILLA, C. G. E.; CASTREJÓN, C. R. ROSAS, T. T. M; BLANCO, E. Z.; y PÉREZ, S. L. J.; Q.F.B.; V Semestre: Universidad del Valle de México, Campus Chapultepec (Av. Constituyentes No. 151 Col. San Miguel Chapultepec. C.P. 11850 México, DF.)
Resumen………………………………………………………………..….1 Introducción……………………………………………………………..…2 I.- Separación de moléculas por cromatografía……… cromatografía…………….….…….…….. …….….…….……....2 ..2 II.-C cromatografía cromatografía de reparto…………………… reparto………………………………………….……. …………………….…….…3 …3 III. Cromatografía Cromatografía en capa fina………………..…………………………… fina………………..…………………………………3 ……3 IV. IV. Cromatografía Cromatografía de adsorción……………………. adsorción……………………..……………………….… .……………………….…..4 ..4 V. Cromatografía de intercambio iónico………………………………………..4 VI. Cromatografía de exclusión molecular………………………………………8 molecular………………………………………8 VII. Reacciones coloreadas de aminoácido………………………………………4
Objetivo………….………………………………………….……………..…..6 Hipótesis………...……………………………………………….……………6 Material………………...……………………………………….……………..6 Procedimiento………….………………………………………….…………..6 Resultados………………………………………………………………………7 Discusión de Resultados……………………………… Resultados………………………………….………… ….………… ………..8 Conclusiones…………………………………………….…………………….9 Referencias……………………………………………….……………...……..9
RESUMEN:
En esta práctica se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación de aminoácidos que fue la combinación de la cromatografía en capa fina con la reacción de la ninhidrina con la cual se peden identificar los aminoácidos por la tinción color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina la cual, da un tono amarillo al reaccionar con la ninhidrina ninhidrina debido a que no produce produce amonio al reaccionar con ella, lo que indica que los demás aminoácidos que si presentaron esta reacción. Se investigaron teóricamente algunos métodos de identificación de los aminoácidos, pero principalmente por medio de cromatografías, a que esta es la técnica principal que se empleo para la técnica, así como algunas de las reacciones coloreadas principales para los aminoácidos. Los objetivos principales de esta práctica fueron llevar a cabo la separación de aminoácidos por medio de las cromatoplacas utilizadas siendo así la fase móvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase móvil, el aminoácido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminoácidos y una proteína que fue la caseína para compararlos con ella sin embargo no se observó un factor de rendimiento igual al de la caseína, no por que no tuviera esta ninguno de los aminoácidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminoácidos e hubiera tenido que hidrolizar primero esta proteína para comparar sus residuos con los aminoácidos utilizados. Se logro concluir que el factor de retención obtenido se debía dependiendo de las características de cada aminoácido ya que dependiendo de si estos eran o no polares o incluso neutros iban a tener mayor o menor factor de retención, esto debido a que un factor de retención alto indica una gran afinidad del compuesto por el disolvent disolventee y si el eluyente eluyente es polar va a jalar consigo a los compuestos compuestos polares polares por el contrario contrario si no es polar, polar, entonces jalara a los compuestos no polares.
1
INTRODUCCIÓN
A menudo se tienen mezclas de aminoácidos que se desean analizar. Antes de poder cuantificar estas mezclas es necesario separarlas. Tres métodos de separación han sido frecuentemente empleados en los laboratorios:
segundo sistema de solventes. Los fosfoaminoácidos pueden revelarse con un reactivo de ácido fosfomolíbdico para permitir su identificación. Los sistemas en los que las placas se desarrollan en ambas direcciones (en este caso se aplica sólo una muestra por placa) se conocen como TLC bidimensional. •
•
Cromatografía de capa fina . Este método se basa
en la separación de las moléculas adsorbidas a una capa muy delgada de gel de sílice, mediante el flujo de una columna de solvente que se deja ascender mediante capilaridad. La separación se realiza en base a la polaridad de las moléculas y la mezcla de solventes más empleada ha sido butanol: agua: ac. acético (4:1:1). La fase estacionaria es la celulosa del papel y la móvil una mezcla de disolventes orgánicos y agua. La celulosa retiene una cierta cantidad de agua entrelazada entre sus fibras y puede dar lugar a un mecanismo de reparto de los componentes de una muestra aplicados sobre ella cuando se hace fluir un disolvente de polaridad distinta de la del agua. Según la solubilidad que tengan los componentes de la muestra respecto de las dos fases así será su movilidad.[1, 2] Las mezclas de aminoácidos pueden separarse en placas de capa fina de gel de sílica, empleando como fase móvil butanol:agua:ácido acético (4:1:1). Las manchas de los aminoácidos pueden detectarse sobre la placa desarrollada, si después de secarla se asperja con una solución de ninhidrina. Los aminoácidos aparecen como manchas púrpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo oscuro. Este método, aunque no es muy sensible, se empleó con frecuencia en los primeros estudios de la composición de las proteínas. En la actualidad ha sido desplazado por la cromatografía líquida de alta resolución, ya que esta última es más confiable para la cuantificación y tiene mayor sensibilidad si los aminoácidos se detectan por fluorescencia.
Cromatografía líquida en columnas intercambio aniónico. En este caso,
de
los aminoácidos se hacen pasar por una columna de resina con un grupo catiónico. Los aminoácidos, según su carga se van a unir a la columna y luego, mediante un cambio gradual en el pH del solvente que se aplica a la columna, se va eluyendo cada aminoácido a un pH distinto (según su punto isoeléctrico). Como algunos aminoácidos son más dificiles de separar que otros, a menudo es necesario emplear una columna corta para separar un grupo de aminoácidos y una columna larga para separar los aminoácidos restantes. •
Cromatografía líquida de alta resolución en columnas de fase reversa. Este método consiste en
aplicar los aminoácidos disueltos en una fase acuosa acidificada a una columna de sílice unida a una cadena hidrocarbonada. Los aminoácidos, según su polaridad se van a unir a la columna y entonces el eluyente se mezcla gradualmente con cantidades cada vez mayores de un solvente menos polar que el agua. Los aminoácidos van siendo lavados de la columna conforme la polaridad del solvente baja lo suficiente.[1] La cromatografía se engloba dentro de las llamadas técnicas de separación y permite el análisis de mezclas complejas de compuestos muy estrechamente relacionados químicamente. Son varias las modalidades usadas y se clasifican según la fase móvil (de gases, líquida) y por el tipo de soporte (columna, capa fina, papel) usados. La separación se lleva a cabo según la distinta interacción que presenta cada uno de los componentes de una muestra respecto a dos fases: una estacionaria y otra móvil que fluye sobre ella. Esta interacción puede ser de varios tipos que a su vez dan lugar a distintas subclases de cromatografía: de absorción, de reparto, de cambio iónico, de afinidad, etc. [2]
Sin embargo, la cromatografía de capa fina se sigue empleando para determinar fosfoaminoácidos, ya que de esta manera es posible identificar si una determinada fosfoproteína, se encuentra fosforilada en Separación de moléculas por cromatografía serina, treonina o tirosina. Para ello, la proteína debe degradarse hasta liberar los aminoácidos que la El estudio y caracterización de las distintas componen y luego esto se separan en una placa de gel biomoléculas (azúcares, lípidos, proteínas, ácidos de sílica. La placa se gira 90o y se desarrolla con un nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su
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aislamiento y purificación a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biológico. Una de las técnicas bioquímicas más clásicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografía. La cromatografía incluye una amplia gama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento físico-químico en el que se basa la separación (cromatografía de adsorción, de reparto, de cambio iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatografía en papel, capa fina, en columna y de gases).[3] Cromatografía de reparto
En la cromatografía de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almidón, celulosa, gel de sílice, óxido de aluminio, etc. Aunque en teoría se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorción, por lo que la separación ocurrirá también, en parte, debido a la interacción entre las moléculas a separar con dicho soporte, la cual actuaría como fuerza de frenado. La fase estacionaria se forma suspendiendo o embebiendo el soporte con el solvente adecuado; éste recubre las partículas del soporte y es retenido por adsorción y/o capilaridad. El espacio entre las partículas del soporte será utilizado por la fase móvil para su desplazamiento.[6]
En la presente práctica llevaremos a cabo una Debemos de tener en cuenta que como fase móvil se cromatografía de reparto, en capa fina, para la suelen utilizar solventes hidrófobos cuando haya que separación de aminoácidos. En la cromatografía de separar compuestos no polares y solventes acuosos reparto los componentes de una mezcla se separan en cuando haya que separar sustancias polares. Por su base a una distribución diferente entre la fase móvil y parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos la fase estacionaria. El movimiento relativo de las parcialmente inmiscible con la móvil, suele ser por lo moléculas a lo largo del sistema cromatográfico es el general hidrofílica, aunque también pueden utilizarse resultado de un equilibrio entre las fuerzas de compuestos hidrófobos.[7] transmisión o arrastre ejercido por la fase móvil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas Cromatografía en capa fina que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en En la cromatografía en capa fina, CCF o TLC ("thincriterios de solubilidad) como de adsorción. [4] layer chromatography, en la terminología inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que La teoría de la cromatografía de reparto se basa en que, pueda dividirse en partículas finas y distribuirse en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en uniformemente en forma de láminas. Esto incluye contacto una con otra y si una de las dos fases contiene sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, un soluto, éste se distribuirá entre ambas de acuerdo tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y con sus solubilidades relativas. Dicho fenómeno se orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La denomina reparto y viene determinado por el utilización de soportes hidrófobos facilita la separación coeficiente de reparto, que es la relación entre las de compuestos no polares (lípidos, por ejemplo). En la concentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dos CCF, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50 fases. En la cromatografía de reparto tenemos un mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la soporte inerte al que está unida la fase estacionaria superficie de una placa de vidrio o plástico. Aunque líquida. La mezcla a separar junto con la fase móvil se muchas casas comerciales suministran placas ya hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio con capilaridad. En dicho avance, la fase móvil arrastrará aparatos especiales que permiten extender sobre la consigo un porcentaje de moléculas de cada placa de vidrio o plástico la “papilla” formada por la componente a separar de acuerdo con los respectivos suspensión del material en un disolvente adecuado coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada (generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antes uno de los componentes de la muestra dependerá de la de su utilización. [8] cantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si éstos son Para el desarrollo de la cromatografía, las muestras, en diferentes aquélla también lo será, siendo posible la un disolvente adecuado, se aplican puntualmente con la separación si se utiliza el volumen de eluyente ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un apropiado. En su desplazamiento, las moléculas de extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es soluto se distribuirán no puntualmente, sino formando crítico, ya que va a afectar a la resolución (separación un área debido a que son parcialmente solubles en las de los componentes de una mezcla compleja), y dos fases y a otros fenómenos tales como la difusión. depende de la concentración del compuesto o [5] compuestos de interés en la muestra. Para soluciones
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concentradas bastará una cantidad muy pequeña (rango de los vértices de la placa y se eluye dos veces, de μl) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a normalmente con solventes diferentes, y en direcciones separar sin llegar a saturar la capacidad de resolución perpendiculares.[11] de la placa cromatográfica. Para soluciones muy diluidas, deberá aplicarse un volumen suficiente (de La CCF presenta una serie de ventajas respecto a hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable cromatografías alternativas, como es la de papel, tales de soluto o solutos de interés. En este caso conviene como las siguientes: hacer la aplicación en pequeños volúmenes fraccionarios, no procediéndose a una nueva adición i) Una mayor resolución, obteniéndose por lo general hasta haberse secado totalmente la precedente (de lo manchas más pequeñas. contrario la superficie de aplicación se haría muy ii) Una mayor velocidad de separación. grande, distando mucho de la situación ideal de iii) Pueden utilizarse un gran número de materiales concentración de la muestra en un solo punto de como soportes y disolventes. aplicación). Una vez aplicada y seca la muestra, la iv) Los compuestos pueden ser detectados con facilidad placa se introduce en un recipiente cerrado (tanque y su recuperación es muy simple. cromatográfico) y uno de los extremos (el más próximo a la línea de aplicación) se sumerge en un disolvente La mayor resolución obtenida por CCF se debe a que apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el fondo del pueden formarse partículas muy finas del soporte, por tanque debe quedar por debajo de la línea de lo que la relación superficie/volumen es muy elevada, aplicación. El solvente se desplaza a través del soporte proporcionando una gran área superficial por unidad de por capilaridad provocando un reparto de los solutos longitud. Esto se traduce en que la cantidad de muestra entre él y la fase estacionaria de acuerdo con sus que se puede aplicar es mayor y la difusión es mucho solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Una menor. La ventaja respecto a la cromatografía en papel vez que el solvente haya alcanzado un punto próximo es que éste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad al otro extremo de la placa, ésta se saca del tanque y se asociada a las fibras tiende a aumentar la difusión de seca. [9] las moléculas.[12] Las manchas correspondientes a cada compuesto, si no Cromatografía de Adsorción: son visibles, se pueden revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se determina la posición de cada Está basada en la diferente adsorción y posterior mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, desorción de sustancias contenidas en un disolvente calculándose el correspondiente valor de Rf. La móvil (líquido o gas) sobre un sólido estacionario. No detección de los compuestos una vez realizada la se debe confundir la adsorción que es un fenómeno de cromatografía se puede llevar a cabo en base a sus superficie que se manifiesta por el aumento de propiedades espectroscópicas, fluorimétricas, concentración de la interfase que rodea al medio haciéndolos reaccionar con reactivos específicos, estacionario, con la absorción que consiste en la radioisotópicamente, etc. La identificación de tales penetración de una sustancia en el seno de otra. compuestos se suele realizar comparando sus Rf con Ejemplos de cromatografía de adsorción son la los de compuestos de referencia (patrones) de cromatografía en columna de alúmina y de carbón naturaleza química conocida. Alternativamente, los activado, la placa de sílica gel.[13] diferentes compuestos, una vez localizada su posición por un método no destructivo, pueden eluirse de la Cromatografía de Intercambio Iónico: placa raspando las zonas correspondientes y extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado. [10] La fase estacionaria es una matriz polimérica porosa que posee grupos iónicos unidos covalentemente y Uno de los factores más críticos en este tipo de contraiones móviles que pueden ser intercambiados por cromatografías es la elección de la fase móvil, que, iones arrastrados por la fase móvil (líquido).[14] básicamente, suele estar formada por una mezcla de un solvente orgánico con agua y algunas sustancias Cromatografía de Exclusión Molecular: adicionales tales cómo ácidos, bases, agentes acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o Las moléculas pueden ser separadas también sobre la disminuir la solubilidad de algunos compuestos. base de sus diferentes tamaños al pasar a través de una Además de en una sola dirección, la CCF puede columna que contiene partículas hidratadas de geles también realizarse bidimensionalmente. En este caso porosos. Se encuentra en el mercado un buen número sólo se aplica una única muestra, que se dispone en uno de materiales para estos fines, cuya composición y
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porosidad son controladas cuidadosamente, de modo que moléculas de tamaño relativamente parecido puedan ser separadas mediante la adecuada selección del tamaño del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta de partículas pequeñas de dextrano formadas por una red tridimensional de cadenas de polisacáridos ramificados. Es altamente polar debido a su alto contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha considerablemente cuando se coloca en agua. La mezcla de moléculas grandes y pequeñas se colocan sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende por la columna, las moléculas pequeñas difunden dentro del gel teniendo que recorrer un camino más largo, mientras que las moléculas grandes pueden ser completamente excluidas de los poros del gel. Eventualmente se obtiene una separación completa en la que las moléculas grandes salen primero de la columna y por último las más pequeñas. El resultado de la columna cromatográfica se expresa en la forma de un diagrama de elución que muestra la variación de la concentración del soluto en el eluyente versus el volumen del eluyente que ha pasado por la columna. De este diagrama se obtiene el volumen de elución. El volumen de elución (Ve) no es un criterio para definir el comportamiento de un compuesto, ya que varía con el volumen total de la columna ( Vt) y la forma como la columna ha sido empaquetada. Para ello se utiliza la constante K av K av
v v
e
t
v v
presente. Para cada prueba se utilizará un control negativo, también denominado blanco de la reacción, en el que el reactivo se añadirá a agua destilada (o solvente adecuado). Aunque en la presente práctica se llevará a cabo la determinación cualitativa de aminoácidos (ausencia o presencia de dichos compuestos), las reacciones coloreadas pueden también ser utilizadas para la determinación cuantitativa de dichas biomoléculas. Hay una amplia gama de métodos colorimétricos que permiten la determinación cuali- y cuantitativa de aminoácidos. Aunque son métodos muy generales, algunos de ellos permiten discriminar entre diferentes tipos de estos compuestos. Así, hay métodos de determinación de aminoácidos con el grupo amino libre (método de la ninhidrina), de aminoácidos con núcleos aromáticos (reacción xantoproteica), de los que poseen un grupo indólico (triptofano; reacción con el ácido glioxílico), un anillo fenólico (tirosina; reacción de Millon), de aminoácidos azufrados (cisteína; reacción con nitroprusiato sódico). En todos los métodos, el aminoácido reacciona con otro compuesto formando derivados coloreados que se pueden determinar cuantitativamente por espectroscopia visible. De todos los métodos reseñados, el más general y utilizado es el de la reacción con la ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina.
En cromatografía de exclusión el volumen de la fase La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y móvil se llama volumen intersticial ( V0). El valor de V0 otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de se determina haciendo pasar por la columna una adición doble que presenta una coloración azulmolécula grande e inerte de peso molecular superior al púrpura, con la excepción de la prolina que da una límite de exclusión del gel. El azul de dextrano 2000, coloración amarillenta (recordar que en la prolina el un colorante con peso molecular de 2*10 6, se utiliza grupo amino está sustituido). El derivado coloreado generalmente con este propósito. Cuando no se dispone presenta máximo de absorción en torno a 570 nm. La de la información adecuada para este cálculo, el V se reacción se lleva a cabo en caliente y a valores de pH puede estimar como el 35% del volumen total de la comprendidos entre 4 y 8. columna (V t) . El volumen total de la columna se calcula a partir de las dimensiones de la columna (Vt = Las aminas primarias (R-CH2 –NH2) dan también 2 positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso π · r · h ).[15] no se libera CO2 La técnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar concentraciones bajas de Reacciones coloreadas de aminoácidos aminoácidos, utilizándose para revelar su presencia en Los métodos colorimétricos de determinación de cromatogramas y fracciones procedentes de otras aminoácidos se basan en la reacción específica de éstos técnicas de separación. La presencia de aldehídos con determinados compuestos, dando derivados resultantes de la degradación de la ninhidrina por coloreados. La formación de color se toma como reacción con los aminoácidos modifica, bajo ciertas resultado positivo e indica su presencia, mientras que el condiciones, el color formado, lo que sirve para no desarrollo de color es indicativo de que no está identificar el tipo de aminoácido.[17] o
5
Reacción de aminoácidos con la ninhidrina.[6]
OBJETIVOS
Se llevará a cabo la separación de mezclas de aminoácidos mediante cromatografía en papel. Se revelará la presencia de los mismos en el papel mediante reacción con ninhidrina y se identificarán en el cromatograma por comparación con la posición de los correspondientes patrones preparados al efecto.
HIPÓTESIS
Si se preparan soluciones de aminoácidos a las cuáles se les separa por medio de cromatografía de capa fina, se podrán estudiar estas de acuerdo al rendimiento que nos proporcionen además de aprender una técnica de cromatografía con ninhidrina, la cual les da una coloración para revelarlas. MATERIAL
Gradillas con tubos de ensayo. Juego de pipetas (0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 ml). Probetas (100 y 250 ml). Vasos de precipitado (100 y 150 ml). Piseta Papel de filtro. Capilares para aplicar muestras. Papel de parafilm. Rotulador de vidrio. Pipetas Pasteur Cromatoplacas Vidrio de reloj
valina fenilalanina isoleucina caseína leucina triptofano Agua destilada Ninhidrina N-butanol Ácido acético Acetona
EQUIPO
Balanza analítica estufa
PROCEDIMIENTO
1.- Preparar: 25ml de lisina al 0.4% 25ml de arginina 0.4% 25ml de acido aspártico al 0.4% 25ml de glicina al 0.4% 25ml de prolina al 0.4% 25ml de valina al 0.4% 25ml de fenilalanina al 0.4% 25ml de isoleucina al 0.4% 25ml de leucina al 0.4% 25ml de histidina al 0.4% 25ml de triptofano al 0.4% 2.- Tomar 5ml de cada aminoácido por equipo 3.- Poner en una cromatoplaca una muestra de cada aa. y una muestra de caseína al 0.1% Nota: las cromatoplacas miden 3x5 cm. 4.- utilizar como eluyente una muestra de n-butanol, acido acético y agua en relación (4:1:5) 5.- Cuando se eluyan las muestras dejar secar las cromatoplacas y rociarlas con nihidrina al 0.5% en acetona. Preparar para todo el grupo 100ml de solución de nihidrina al 0.5% en acetona y ponerla en un frasco atomizador
SUSTANCIAS
lisina arginina acido aspártico glicina prolina
[18]
6
¡Cuidado la acetona disuelve el frasco atomizador, así que hay que ponerla en un frasco con tapón esmerilado, mientras se espera para utilizarla! ¡Precaución utilizar guantes de látex para prepararla y para aplicarla, pues mancha la piel, ya que se une a las proteínas de la piel! 6.- revelar las cromatoplacas por calentamiento en una estufa a 90ºC por 10 minutos. Colocar las placas en un vidrio de reloj
Elución de las cromatoplacas 7.- Marcar con un lápiz el frente de disolvente y las manchas 8.- calcular el Rf de cada a.a e identificarlos a.a de la caseína.
[19]
RESULTADOS:
Revelado de las cromatoplacas
7
Rf =
1.9 3.4
=
0.5588
12. - Histidina
Rf =
0.5 3.4
=
0.1471
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Cálculo del factor de retención 1.- Prolina:
Rf =
1.7 3.2
=
0.5213
2.- Glicina
Rf =
1.1 3.8
=
0.2895
3.- Isoleucina
Rf =
1.1 0.3548 3.1 =
4.- Caseína
Rf =
0.6 3.1
=
0.1935
5. - Lisina
Rf =
0.7 3.2
=
0.2188
6. - Arginina
Rf =
0.5 0.1613 3.1 =
7.-ácido Aspártico
Rf =
0.9 3.4
=
Se utilizó la técnica de cromatografía en capa fina, la cual se basa en la separación de las moléculas absorbidas a la capa de gel de sílice de la cromatoplaca mediante el flujo de la columna de la mezcla de solventes de agua, butanol y ácido acético. La fase estacionaria es la celulosa y la móvil los disolventes. Según la solubilidad que tienen los aminoácidos de la muestra respecto de las dos fases así fue su movilidad Las manchas de los aminoácidos se observaron sobre la placa desarrollada, por la una solución de ninhidrina rociada y al después ponerla en la estufa. Los aminoácidos aparecieron como manchas púrpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo oscuro. Se utilizó la ninhidrina debido a que sirve para la determinación de aminoácidos con el grupo amino libre .La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul púrpura. La ninhidrina reacciona con los aminoácidos formando aductos coloreados según la reacción:
0.2647
8. - Valina
Rf =
0.9 3.6
=
0.25
9. - Leucina
Rf =
1.2 3.4
=
0.3529
10. - Fenilalanina
Rf =
1.8 3.6
=
0.5
11. - Triptofano
8
El reparto de los aminoácidos en el papel se debe a por lo cual es importante esta técnica ya que de esta su naturaleza química. Las fórmulas de los manera se nos facilitaran saber las características del aminoácido que se este utilizando. compuestos usados como patrón son: REFERENCIAS
El reparto que se obtiene es el siguiente: los aminoácidos apolares son los que mejor interaccionan con el solvente y son arrastrados por él; la lisina presenta la menor movilidad debido a que al pH del solvente, este aminoácido presenta sus dos grupos amino cargados positivamente por lo que interacciona mal con el solvente, mayoritariamente apolar (n-butanol). Los demás aminoácidos se separan entre los aminoácidos apolares y el básico. Al determinar los factores de retención se puede observar que el triptofano es el que mayor factor de retención obtuvo, esto debido a que es el que tiene mayor afinidad por el disolvente y el de menor factor de retención fue la histidina, es decir, tuvo menor afinidad por el disolvente.
CONCLUSIONES
Esta técnica de separación cromatográfica es de las más simples, además de que nos permitió estudiar esta técnica y cualitativamente observar la reacción producida por medio de la ninhidrina que permite identificar aminoácidos ya que la reacción de los aminoácidos con ninhidrina se debe a la presencia del grupo α–NH2 en los mismos observándose así una coloración morada o magenta. La prolina no tiene dicho grupo libre, sino –NH- ya que forma parte del anillo de pirrolidina, y al reaccionar con ninhidrina se forma un color amarillo…. El factor de retención depende de la afinidad de los aminoácidos con el disolvente o eluyente utilizado y esto mismo depende del tipo de aminoácido que se utilice, es decir si son polares, apolares, neutros, etc.,
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