DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE AMINOACIDOS POR EL METODO DE LA NINHIDRINA
AMINOACIDO Todos los aminoácidos componentes de las proteínas son L-alfa-aminoácidos. Por lo tanto, están formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo, a un grupo amino, a un hidrógeno y a una cadena (habitualmente denominada Radical alquilo o arilo) de estructura variable, que determina la identidad y las propiedades de los diferentes aminoácidos; existen cientos de cadenas R por lo que se conocen cientos de aminoácidos diferentes, pero sólo 20 forman parte de las proteínas y tienen codones específicos en el código genético. La unión de varios aminoácidos da lugar a cadenas llamadas polipéptidos o simplemente péptidos, que se denominan proteínas cuando la cadena c adena polipeptídica supera los 50 aminoácidos o la masa molecular total supera las 5.000 uma. ESTRUCTURA GENERAL DE UN AMINOACIDO La estructura general de un aminoácido se establece por la presencia de un carbono central alfa unido a: un grupo carboxilo (rojo en la figura), un grupo amino (verde), un hidrógeno (en negro) y la cadena lateral (azul):
"R" representa la cadena lateral , específica para cada aminoácido. Técnicamente Técnic amente hablando, se los denomina alfa-aminoácidos, debido a que el grupo amino ( – NH NH2) se encuentra a un átomo de distancia del grupo carboxilo ( – COOH). COOH). Como dichos grupos funcionales poseen H en sus estructuras químicas, son grupos susceptibles a los cambios de pH; por eso, al pH de la célula prácticamente ningún aminoácido se encuentra de esa forma, sino que se encuentra ionizado.
Los aminoácidos a pH bajo (ácido) se encuentran mayoritariamente en su forma catiónica (con carga positiva), y a pH alto (básico) se encuentran en su forma aniónica (con carga negativa). Sin embargo, existe un pH específico para cada aminoácido, donde la carga positiva y la carga negativa son de la misma magnitud y el conjunto de la molécula es eléctricamente neutro. En este estado se dice que el aminoácido se encuentra en su forma de ion dipolar o zwitterión.
CLASIFICACIÓN DE AMINOACIDOS A los aminoácidos que necesitan ser ingeridos por el cuerpo se les llama esenciales; la carencia de estos aminoácidos en la dieta limita el desarrollo del organismo, ya que no es posible reponer las células de los tejidos que mueren o crear tejidos nuevos, en el caso del crecimiento. Para el ser humano, los aminoácidos esenciales son: Valina (Val, V) Leucina (Leu, L) Treonina (Thr, T) Lisina (Lys, K) Triptófano (Trp, W) Histidina (His, H) Fenilalanina (Phe, F) Isoleucina (Ile, I) Arginina (Arg, R) Metionina (Met, M) A los aminoácidos que pueden ser sintetizados o producidos mediante la síntesis de aminoácidos por el cuerpo se los conoce como no esenciales y son:
Alanina (Ala, A) Prolina (Pro, P) Glicina (Gly, G) Serina (Ser, S) Cisteína (Cys, C) Asparagina (Asn, N) Glutamina (Gln, Q) Tirosina (Tyr, Y) Ácido aspártico (Asp, D) Ácido glutámico (Glu, E)
REACCIONES DE AMINOACIDOS En los aminoácidos hay tres reacciones principales que se inician cuando un aminoácido se une con el piridoxal-P formando una base de Schiff o aldimina. De ahí en adelante la transformación depende de las enzimas, las cuales tienen en común el uso de la coenzima piridoxal-fosfato. Las reacciones que se desencadenan pueden ser:
1. la transaminación (transaminasa): Necesita la participación de un α-cetoácido. en la que el grupo amino es transferido de aquel a éste, con la consiguiente conversión del aminoácido en su correspondiente alfa-cetoácido. Un ejemplo importante de transaminación se presenta entre glutamato y oxaloacetato, que produce alfacetoglutarato y aspartato, el que puede transferir su grupo amino a otros alfacetoácidos para formar aminoácidos diferentes por reaccio nes de transaminación 2. la descarboxilación: reacción metabólica fundamental durante la oxidación de moléculas orgánicas, catalizada por enzimas del tipo descarboxilasa Los aminoácidos sufren descarboxilación a aminas; un ejemplo particular sería la descarboxilación de la histidina a histamina. 3. la racemización: Es la conversión de un compuesto L en D, o viceversa. Aunque en las proteínas de los eucariotas (animales, plantas, hongos...) los aminoácidos están presentes únicamente en la forma estructural levógira (L), en las bacterias podemos encontrar D-aminoácidos.
DETECCION Y MEDICIÓN CUANTITATIVA La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis, también es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos. Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido. La reacción con la ninhidrina produce colores que sirven como base para la cuantificación de todos los aminoácidos primarios se evalúa midiendo la absorción de la luz con la longitud de onda de 540 nm. Aminoácidos secundarios como la prolina forman productos ligeramente distintos; estos son amarillos tienen su máxima absorción a 440 nm. El cálculo de la concentración se basa en la relación de Beer-Lambert. El orto-ftaldehído (OPA, del ingles orto-ptaldehyde, también llamado fluoraldehído) es un nuevo reactivo de revelado, más sensible, con el cual puede detectarse concentraciones de aminoácidos de orden de picomoles (10E-12) a femtomoles (10E-15). Esta enorme diferencia en sensibilidad se debe a los productos intensamente fluorescentes. Después de la reacción, la exposición a una radiación de 360 provoca una emisión fluorescente a 445 nm, cuya intensidad se relaciona con la concentración del aminoácido. Esta reacción ocurre con rapidez si se trata de aminoácidos primarios, pero no cuando son secundarios. No obstante, la prolina puede detectarse oxidándola primero a una amina primaria. Los derivados de la feniltiohidatoina que absorbe la luz ultravioleta, los derivados fluorescentes del densilo y los derivados amarillos del dinitrofenilo son útiles no son solo para la detección cuantitativa de aminoácidos, sino también para su identificación.
CROMATOGRAFIA EN PAPEL. Esta técnica se basa en el principio de que un compuesto se reparte o distribuye entre dos fases líquidas. En un ambiente que contiene vapor de agua, el papel de cromatografía absorbe una cantidad de agua que mantiene entre las fibras de la celulosa del papel. Esta agua se considera como uno de los disolventes y constituye la fase estacionaria. Si se permite que un disolvente no acuoso ( la fase móvil) se traslade por el papel impulsada por la acción capilar, tan pronto como el disolvente alcance a cualesquiera moléculas de soluto en el papel, estas se distribuirán entre las dos fases en una proporción característica de sus coeficientes de reparto. Cuanto más soluble sea un soluto en la fase móvil, tanto más se trasladara el compuesto por el papel en la dirección del flujo del disolvente y viceversa Podemos citar como ejemplo del procedimiento de cromatografía en papel la separación de aminoácidos en fracciones por cromatografía descendente en papel Whatman No. 1, empleando la elución fenol saturado con agua. Los aminoácidos aparecen como manchas coloridas después de revelar el cromatograma rociándolo con reactivo de ninhidrina. Se desconoce con certera el mecanismo de la cromotagrafía en papel. Es probable que los constituyentes de la muestra probablemente sean retenidos por el papel a causa de su solubilidad en el agua que el papel absorbe, o por absorción de los propios constituyentes de la muestra o por una combinación de ambos. SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Tabla No.1 AMINOÁCIDOS ANALIZADOS POR CROMATOGRAFÍA EN PAPEL TUBO AMINOÁCIDO DISTANCIA RECORRIDA (cm) RF OBSERVACIONES 1 Isoleucina 6.5 cm 0.76 cm Mancha color morado larga y recorrió bastante. 2 Arginina 1.0 cm 0.12 cm Mancha color morado fuerte ancha y recorrió la mitad de la anterior. 3 Histidina 0.5 cm 0.05 cm Mancha color morado fuerte pequeña y recorrió poca distancia. (Fuente: Datos experimentales) DISCUSIÓN DE RESULTADOS La cromatografía en papel es un método de separación y aislamiento de sustancias. Se basa en dos fases; la fase móvil que es una capa de solvente orgánico que asciende por la capilaridad por el papel, en este caso el butanol, y la fase estacionaria que es papel filtro. La ninhidrina nos revela las posiciones de los aminoácidos (Isoleucina, Arginina, Histidina), utilizadas en la prueba como manchas de color violeta. La polaridad relativa establece la movilidad cromatografía. Los aminoácidos con grandes grupo R no polares en este caso la Isoleucina migran más lejos que aquellos con grupo R no polares más cortos o con grupos R polares en este caso la Arginina y la Histidina. La proporción entre la distancia a la cual viaja un aminoácido y la distancia a la cual viaja el frente del solvente es el valor Rf que es la movilidad relativa respecto al frente del solvente. Dando como resultados
del Rf: la Isoleucina 0.75, Arginina 0.12, la Histidina 0.05. Los valores Rf para un aminoácido determinado pueden variar según las condiciones experimentales como por ejemplo el solvente utilizado. (Murray, 2001)
