ARBEZ EVANGELISTA EVANGELISTA CRISTIAN ULISES
LABORATORIO DE DE BIOQUIMICA
ELECTROFORESIS DE AMINOACIDOS OBJETIVO: Llevar a cabo la determinación cualitativa de aminoácidos conocidos y desconocidos.
INTRODUCCIÓN: Las proteínas son moléculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de aminoácidos (fundamentalmente ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e histidina) y del grado de ionización de éstos al pH considerado. En los soportes no restrictivos (en los que el entramado no interfiere en la migración, ya que el tamaño de las proteínas es muy pequeño en comparación con el tamaño de poro del soporte), la separación depende de la densidad de carga de las moléculas y, así, cuanto mayor sea la densidad, mayor será la velocidad de migración en un campo eléctrico hacia el polo que determine su carga neta. La primera etapa del proceso es la aplicación de la muestra. En papel o acetato de celulosa, esto se puede efectuar de forma puntual (permite el análisis de varias muestras simultáneamente en pequeñas cantidades) o longitudinalmente (permite el estudio de una sola muestra pero en mayor cantidad). La muestra se aplica disuelta en el tampón de electroforesis, del que está impregnado el soporte y que se encuentra en los reservorios de la cubeta, y se deposita en una pequeña zona, lo más estrecha posible, en el centro o en un extremo del soporte (si se conoce cuál va a ser la dirección de desplazamiento de la misma) y de forma perpendicular a la dirección del campo eléctrico. Conviene evitar la proximidad de los bordes del papel, ya que allí el campo eléctrico no es homogéneo y se distorsionan las bandas según avanzan. El volumen que se aplica suele ser inferior a 10 µL y si se necesitan mayores volúmenes porque la muestra se encuentre muy diluida, pueden hacerse aplicaciones sucesivas sobre la misma zona, dejando secar entre aplicación y aplicación. Es necesario humedecer el soporte (papel o acetato de celulosa) para que sea conductor; para ello, se impregna el soporte de tampón de electroforesis por ambos extremos y de forma simultánea para que por capilaridad se desplace hacia la zona de aplicación de la muestra. En los geles de agarosa, se perfora el gel con ayuda de un troquel o una pipeta de diámetro adecuado y se elimina esa porción por succión. La perforación puede ser cilíndrica o rectangular, dependiendo del número y cantidad de muestra a analizar y la muestra se deposita en el orificio practicado sin que llegue a rebosar. En este caso, el tampón está embebido en el soporte (agarosa). En todos los casos, la zona de aplicación debe ser lo más estrecha posible, para aumentar la resolución y evitar solapamientos entre bandas que migren en posiciones cercanas.
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La electroforesis termina cuando se haya producido la máxima separación de los componentes de la muestra, pero sin sobrepasar los límites del soporte. Para evitar que se sobrepasen estos límites, se utilizan los marcadores electroforéticos que son moléculas coloreadas con una movilidad electroforética superior a cualquier componente de la muestra (poseen elevada carga respecto a su tamaño). Entre los marcadores más utilizados se encuentran la dinitrofenil-lisina (DNP-Lys) y el azul de bromofenol. Una vez acabada la electroforesis, se procede a la etapa de tinción. El soporte se retira de la cubeta y se sumerge en un recipiente que contiene una disolución de un colorante que se une de manera específica a los componentes de la muestra y que precipita a los componentes separados en la posición en la que se encuentren. Las disoluciones más utilizadas en el caso de proteínas son el Negro Amido al 1% (p/v) en ácido acético y el Azul de Coomasie al 0.1% (p/v) en metanol/agua/ácido acético (9:9:2 v/v/v). Si la electroforesis se pretende desarrollar a escala preparativa, ha de utilizarse un papel de mayor grosor (175 gr/cm2), en lugar del utilizado en la electroforesis analítica (85-100 gr/cm2; 0.15mm de espesor), lo que permite la aplicación de una mayor cantidad de muestra (50-100µL)
Reactivos Lisina Isoleucina Glicina Muestra problema 1 Muestra problema 2 Equipo Pipetas Papel filtro estufa o parrila
Procedimiento Debido a que no se contaba con el equipo de electroforesis se procedio una identificación a la flama:
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Colocando las muestras a corres como en un cromatografía con piridina se seca y se corre con el revelador la ninhidrina y se calienta en la estufa y parrilla y se identifica comparando con los controles que son aminoácidos conocidos.
OBSERVACIONES:
colocación de aminoácidos
corrimiento de la muestra con piridina
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revelación con ninhidrina
Revelado
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Muestra 1:___________________________________________________________________________________ Muestra 2:__________________________________________________________________________________
