Cuantificación de azúcares reductores por el método de DNS Este procedimiento se fundamenta en la reacción de los grupos reductores de los azúcares con el reactivo oxidante ácido dinitrosalicílico (DNS). El reactivo consiste en una disolución formada por los siguientes compuestos: ácido dinitrosalicílico (ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzóico), que actúa como oxidante; Sal de Rochelle (tartrato sódico-potásico), que impide la disolución de oxígeno en el reactivo y hidróxido sódico, que aporta el medio requerido para que se produzca la reacción redox. De esta forma, el ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzóico se reduce, en presencia del grupo reductor de la glucosa, formando el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, mientras que el grupo aldehído reductor se oxida, para formar un grupo carboxílico. En este método analítico el DNS está en exceso frente a los grupos reductores y en todas las muestras se adiciona la misma cantidad, de tal forma que mayores concentraciones de azúcares reductores provocan una mayor coloración de la muestra. Estas diferencias de coloración pueden determinarse por espectrofotometría visible, a la longitud de onda de máxima absorbancia de 540 nm. Preparación del reactivo del ácido 3,5 dinitrosalicílico en caliente
Se pesan 5 g de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS), 150 g de Tartrato de Na-K y 8 g de NaOH. Se disuelve el NaOH en 200 mL de agua destilada y se añade en agitación el Tartrato de Na-K lentamente. Se completa con agua destilada hasta 400 mL y se comienza a añadir lentamente el ácido 3,5 dinitrosalicílico. Se deja en agitación toda la noche, se enrasa a 500 mL y se filtra. Se guarda en frasco color ambar, bajo refrigeración. La preparación del reactivo DNS en caliente se hace con agitación magnética y calentamiento (Bello et al ., ., 2006).
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Preparación de solución Buffer Mcilvaine, 0.1 M, pH 5
Pesar 2.548 g de C 6H8O7.H2O (ácido cítrico monohidratado) y 3.656 g de Na 2HPO4 (Fosfato de sodio dibásico) y enrrasar a 250 mL con agua destilada con agitación constante hasta disolución total. Solución patrón de Glucosa:
Preparar una solución de glucosa con una concentración de 1 g/L, para la cual se disuelve 0.1 g de glucosa en 100 mL de solución tampón Mcllveine, pH 5 (tabla a). Tabla a. Curva patrón. Volumen de solución patrón y agua destilada agregados a cada tubo, así como la concentración de cada uno.
Tubo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
mL de solución patrón de glucosa 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
mL de agua destilada 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
Volumen total 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Concentración de glucosa (mg/L)* 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
* (0.1 mL de solución patrón) (1000 mg/L <1 g/L>) = 100 mg/L * (0.2 mL de solución patrón) (1000 mg/L) = 200 mg/L * (0.3)(1000)= 300 mg/L
Curva patrón de glucosa
A partir de la solución patrón de glucosa y agua destilada se preparan 10 tubos con diferentes concentraciones como se indica en la tabla a. Realizar por triplicado.
A cada uno de los tubos se le agrega 1 mL del reactivo DNS y se agita en vortex.
Calentar en agua hirviendo por 5 minutos.
Dejar enfriar y agregar 8 mL de agua destilada.
Utilizar como blanco una solución de agua destilada más el reactivo DNS*.
Leer absorbancia de cada tubo a 540 nm. 2
*Se prepara un el blanco para lectura en el espectrofotómetro, en un tubo se agrega 1 mL de agua destilada y 1 mL de DNS, se introduce en agua hirviendo 5 min, se agregan 8mL de agua destilada, se lee en el espectrofotómetro y se registra la absorbancia a la longitud de onda de 540 nm.
Preparación de las muestras
La técnica de DNS cuantifica como máximo una concentración de azúcar de 1 mg/mL, por lo tanto, la solución estándar deberá tener esa concentración.
Es importante mencionar, que si se tiene la sospecha de que la muestra problema posee una concentración mayor a 1 mg/mL, será necesario realizar una dilución de la misma, previa a la determinación, para asegurar que las lecturas podrán ser interpoladas en la curva patrón.
1. De las muestras se toma 1 mL ( se le agrega 27 mL de agua destilada
volumen se obtiene una dilución de 1000 veces> dilución al décimo ) Ejemplo: a.
1 mL de muestra se agrega en 9 mL de agua (dilución 10 veces)
b.
1 mL de dilución a se agrega en 9 mL de agua (dilución 100 veces)
c.
1 mL de dilución b se agrega en 9 mL de agua (dilución 1000 veces)
2. Posteriormente se prosigue la metodología igual que los estándares. 3. Los tubos deberán leerse a 540 nm, calibrando con el blanco, el cual contiene todos
los reactivos, excepto el problema. Es decir, contiene 1 mL de agua destilada y 1 mL de DNS.
Bello, G. D., Carrera, B. E., y Díaz, M. Y. 2006. Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico. ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar . 2:45-50.
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