Informe de laboratorio: desnaturalización de proteínas de la clara de huevo mediante diversos agentes capaces de inducir alteraciones en su conformación nativa y reconocimiento de aminoácidos con pruebas de identificación comunes. Mónica Antolínez, 1 Facultad de ciencias naturales e ingeniería, programa de ingeniería química, universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano, Bogotá D.C.
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Objetivo: identificar los diversos factores que afectan la estructura y estabilidad de las proteínas y reconocer las pruebas más comunes en el reconocimiento de aminoácidos.
Resumen Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas, el estudio de la estructura tridimensional de estas, permite comprender la importancia de la distribución espacial en sus diversas funciones. Para la desnaturalización de proteínas (clara de huevo), se aplican factores como el calor, PH extremos, precipitación por sales, solventes orgánico y metales pesados. El reconocimiento de aminoácidos se realizó con las reacciones de acetato de plomo alcalino, xantoproteica, Hopkins Cole, Biuret y ninhidrina. Con cada una de estas pruebas es evidente el desdoblamiento de las proteínas, la perdida de solubilidad, la precipitación y coagulación debido al rompimiento de las fuerzas que estabilizan la estructura tridimensional o nativa de la proteína y conllevan a la pérdida de su función. De igual manera en las reacciones de reconocimiento de aminoácidos se presentan diferentes coloraciones, las cuales dependen de la estructura y conformación de la cadena lateral de los diferentes aminoácidos y péptidos. Abstract Amino acids are the building blocks of proteins, the study of the three-dimensional structure of these, can understand the
importance of the spatial distribution in its various functions. For denaturation of proteins (egg white), factors such as heat, pH extremes, precipitation are applied salts, organic solvents and heavy metals. Recognition of amino acids was performed with ethyl reactions alkaline xantoproteica lead, Hopkins Cole, biuret and ninhydrin. With each of these tests clearly the splitting of proteins, loss of solubility, precipitation and coagulation due to the breaking of the forces that stabilize the three-dimensional or native protein structure and lead to the loss of its function. Similarly in the amino acid recognition reactions occur different colors, which depend on the structure and conformation of the side chain of different amino acids and peptides. Palabras claves: proteína, aminoácido, péptido, desnaturalización, reacción. Introducción Las proteínas son las macromoléculas más versátiles de los seres vivos y desempeñan funciones cruciales en los procesos biológicos. Funcionan como catalizadores, transportan y almacenan otras moléculas como el oxígeno, proporcionan apoyo mecánico y protección inmunológica, generan movimiento, trasmiten impulsos nerviosos, y controlan el crecimiento y la diferenciación.
Las proteínas son polímeros lineales construidos a partir de cadenas de monómeros llamados aminoácidos, y contienen ciertos grupos funcionales tales como alcoholes, tioles, tioeteres, acidos carboxílicos, carboxiamidas, y grupos básicos. La mayoría de estos grupos son químicamente activos, siendo los responsables de las funciones de la proteína. Estas macromoléculas pueden interaccionar entre sí para formar asociaciones complejas. Los aminoácidos son los constituyentes de las proteínas, un α-aminoácido consiste en un grupo de carbono α unido a un grupo amino, un ácido carboxílico y una cadena lateral ® característica. Solo los L-aminoácidos son constituyentes de proteínas y habitualmente se encuentran 20 tipos de cadenas laterales que varían en tamaño, forma, carga, capacidad de formar puentes de hidrogeno, carácter hidrofóbico y reactividad química. (Berg, Tymoczo & stryer 2009, pg 25-27). Los aminoácidos son un grupo heterogéneo de moléculas que poseen unas características estructurales y funcionales comunes. Estos se unen mediante enlaces covalentes y formando largas cadenas de péptidos y polímeros. La disposición lineal concreta de los aminoácidos de una proteína constituye su secuencia primaria, y esta determina la estructura tridimensional. Esto hace que los grupos amino y carboxilo de todos los aminoácidos estén unidos por enlaces peptídicos, por esto la naturaleza química de la cadena lateral es la que va a condicionar su solubilidad en agua, su reactividad y el tipo de interacciones que se pueden establecer. El estudio detallado de la estructura tridimensional de las proteínas permite comprender la importancia de esta
distribución espacial en las diversas funciones de las proteínas como son la función catalítica, estructural, recepción y trasmisión de señales. Cada proteína tiene una estructura tridimensional característica indispensable para realizar su función. Esta estructura es mantenida por interacciones débiles formándose la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria.
Figura 1. Estructura de las proteínas
Según el nivel de organización se suelen considerar como globulares y fibrosas. Las primeras se caracterizan por su forma esférica, su solubilidad en medios acuosos y presentar diferentes estructuras secundarias en una misma molécula. Las proteínas fibrosas presentan una única estructura secundaria que disponen en forma de largas hebras y son insolubles en agua. (Feduchi, Blasco, Romero & Yañez 2011, pg 78-85)
Figura 2. Proteínas globulares y fibrosas
(Berg, Tymoczo & stryer 2009, pg 46). Como la estructura tridimensional se mantiene mediante interacciones débiles, si se alteran las condiciones que mantienen
estas fuerzas de atracción se produce la desnaturalización de la proteína. La desnaturalización de una proteína implica la alteración de su estructura tridimensional, la proteína nativa pierde su actividad biológica o función. En algunos casos el proceso de desnaturalización es reversible. La desnaturalización de proteínas ocurre por su exposición a diversos factores como la agitación, la temperatura, la luz ultravioleta, la adición de sustancia s acidas o básicas, disolventes orgánicos, sales, metales pesados y reactivos con grupos tiol, estos agentes alteran las fuerzas de dispersión, los puentes de hidrogeno y los enlaces iónicos. (Acuña, 2008, pg. 315)
Figura 3. Desnaturalización de las proteínas.
El albumen es una solución acuosa de numerosas proteínas globulares y una proteína fibrosa, la ovomucina, que le confiere la textura gelificada.
Figura 4. Estructura primaria de la albumina. (Pertierra, pg 166).
La ovoalbúmina es la proteína más abundante del albumen, es una fosfoglicoproteina cuyo
número de moles de fosfato ligados a los residuos de serina varia de 2 a 0; la ovoalbúmina A1 representa cerca del 80% de la ovoalbúmina total. La molecula contine 3,5% de glúcidos bajo forma de una unidad glucídica de masa molar 1,570, comprendiendo 5 residuos de D-mannosa y 3 residuos de D-glucosamina. La molecula encierra cuatro grupos SH y dos uniones disulfuro (aumenta durante el almacenamiento), formándose una Sovalbúmina mas termoestable que l proteína original. La desnaturalización térmica de la ovalbúmina ocurre a 72-84°C. Esta es muy sensible a la desnaturalización superficial.
Figura 5. Estructura tridimensional de la ovoalbúmina. Tomado de: http://www.cienciaexplicada.com/2010/11/por-que-la-clara-de-huevose-vuelve.html
La conalbúmina es una glicoproteína que contiene 0,9% de D-mannosa y 1,7% de Dglucosamina y está formada de dos subunidades. Esta proteína es muy sensible a la desnaturalización térmica y menos sensible a la desnaturalización superficial que la ovoalbúmina. Particularmente compleja cationes metálicos y trivalentes tales como 𝐶𝑢2+ , 𝑍𝑛2+ , 𝐴𝑙 3+ , 𝐹𝑒 3+ . A un PH próximo a 6 una molécula de conalbúmina, puede fijar dos iones metálicos; según la naturaleza del catión fijado, los complejos pueden resultar coloreados (rojos con 𝐹𝑒 3+ y amarillos con 𝐶𝑢2+ . Los complejos metálicos de conalbúmina son más estables que la proteína natural.
El ovomucoide es una glicoproteína que contiene 0,5- 4% de D-galactosa, 7-8% de Dmannosa, 10 al 18% de D-glucosamina y 0,03 a 2,2% de ácido salicílico. Las unidades glucídicas están ligadas a la molécula proteica a nivel de residuos de asparragina. La molecula está constituida de tres subunidades, las zonas estructurales en αhélice representan 22% de las cadenas polipeptídicas; la proteína es muy resistente al calor salvo en medio alcalino. Posee una actividad antitrípsica. La lisozima contiene 129 residuos de aminoácidos, el PH isoeléctrico de esta molecula es muy elevado (cerca de 10). Esta proteína posse una actividad enzimática βglucosaminidasica, se trata de un mucopéptido N-acetilmuramoilhidrolasa. La lisozima puede separarse de la clara por una precipitación en cloruro de sodio (5%) a PH isoeléctrico. La ovomucina es una glicoproteína constituida de dos subunidades, de contenido en glúcidos cerca al 30%, con 6-23% de hexosas, 6-16% de hexosaminas y 1-14% de ácido sálico. Su estructura es alargada y fibrosa, y es la responsable de la viscosidad de la capa espesa gelificada del albumen. Es insoluble en agua y soluble en soluciones salinas a PH >= 7. Es termorresistente pero sensible a la desnaturalización superficial. Forma con la lisozima un complejo insoluble en agua. Las ovoglobulinas G2 y G3 poseen un poder espumante elevado. La avidina está compuesta de tres constituyentes (A, B, C) siendo capaz de formar un complejo con la biotina. El ovoinhibidor es una proteína que inhibe la actividad de la tripsina y de la quimotrípsina. La flavoproteína puede fijar la riboflavina. (Cheftel 1989, pg 167-177).
Tabla 1. Concentración de aminoacidos en la albumina.
Tomado de: clara-huevo.
http://alimentos.org.es/aminoacidos-
Metodología 1. Desnaturalización térmica
2. Desnaturalización por PH extremo
3. Precipitación por sales
4. Desnaturalización por presencia de solventes orgánicos
8. Reacción de Hopkins Cole
5. Desnaturalización pesados
por
metales
9. Reconocimiento de proteínas con el reactivo de Biuret
6. Reacción con acetato de plomo alcalino 10. Reaccion con nidria
7. Reacción xantoproteica
Tablas de datos y resultados 1. desnaturalización térmica muestra
clara huevo
de
temperatura
observaciones
Se sometió a una temperatura aproximada al punto de ebullición del agua en Bogotá.
se formó una precipitación formación de coloide Resultado: positivo para desnaturalización térmica.
4. desnaturalización por presencia de solventes orgánicos muestra clara de huevo
reactivo
Resultado: positivo para desnaturalización por presencia de solventes orgánicos.
etanol
5. desnaturalización por metales pesados muestra
reactivo
clara de huevo
2. desnaturalización por pH extremo muestra
clara huevo
pH
de
observaciones
pH en su punto isoeléctrico.
sulfato de cobre
se formó una precipitación Resultado: positivo para desnaturalización por pH extremo.
clara de huevo muestra clara de huevo
reactivo
observaciones
sulfato de amonio
se formó una precipitación Resultado: positivo para desnaturalización por sales.
observaciones se formó una precipitación de un color azulverdoso Resultado: positivo para desnaturalización por metales pesados.
6. reacción de acetato de plomo alcalino muestra
3. precipitación por sales
observaciones se formó un anillo de color blanco
temperatur a
Se sometió a una 1. temperatur a aproximada al punto de 2. ebullición del agua en Bogotá.
reactivos
hidróxid o de sodio NaOH acetato de plomo alcalino
7. Reacción Xantoproteica
observacione s
se formó una coloración gris-oscura Resultado: positivo para reacción de acetato de plomo alcalino.
muestra Clara de
reactivos
observaciones -Se formó una coloración naranja.
-Ácido Nítrico
Resultado: Positivo para reacción xantoproteica.
Ninhidrina
8. Reacción Hopkins Cole reactivos de -Ácido Sulfúrico -Reactivo de Hopkins Cole
observaciones Formación de un anillo precipitado color violeta-azul Resultado: Positivo para reacción de Hopkins Cole
9. Reconocimiento de proteínas con el reactivo de Biuret muestra Clara Huevo
reactivo
observaciones
de Se formó una coloración violeta Reactivo de Biuret
Resultado: Positivo para reconocimiento de proteínas con reactivo de Biuret.
10. Reconocimiento de proteínas con la reacción de Ninhidrina muestra
reactivo
Ninhidrina
-Formación de complejo.
-NaOH al 40%
muestra Clara huevo
La serina obtuvo un color violeta
Clara de Huevo
huevo
observaciones
Resultado: Positivo para la prueba de Ninhidrina en aminoácidos libres de serina. La prolina obtuvo un color amarillo Resultado: Positivo para la prueba de Ninhidrina en aminoácidos libres de prolina
Análisis de resultados Proteínas de la clara de huevo: Ovoalbúmina, Ovomucina, Conalbúmina, lisozima, Ovoglobulinas y Ovomucoides. 1. Desnaturalización térmica Cuando la muestra de clara de huevo se sometió a una temperatura aproximada al punto de ebullición del agua (90 °C – 100 °C), las proteínas presentes se desestabilizaron por el efecto del calor sobre los enlaces de la estructura terciaria (en gran parte enlaces de hidrogeno), causando así un desdoblamiento de la proteína y una disminución progresiva de su solubilidad. “El calentamiento de una solución proteica causa un incremento en la energía de vibración y rotación que pueden rebasar el equilibrio de las interacciones débiles que estabilizan la conformación plegada y funcional.” (Virginia Melo, Oscar Cuamatzi, 2007, p.98).
al ser una sal neutralizó las interacciones (puentes de hidrogeno) de la estructura terciaria de la proteína, causando así un desdoblamiento de la misma, la cual se precipitó a consecuencia.
Esquema de la reacción:
2. Desnaturalización por pH extremo La muestra de clara de huevo se precipitó al momento de adicionar ácido clorhídrico. A partir de esto, por el carácter acido del reactivo se presentó un cambio abrupto en las cargas formales de los grupos esenciales de las proteínas presentes, esto afectó las interacciones de la estructura terciaria, produciendo la desactivación y posterior degradación de las proteínas. Esto se puede explicar de otra forma: Las proteínas en un pH Isoeléctrico se precipitan, debido a que en este punto la carga neta es cero y se eliminan las interacciones electrostáticas, lo que permiten la separación selectiva de estas.
4. Desnaturalización por presencia de solventes orgánicos La muestra se precipitó en presencia de etanol, debido a que el reactivo es un solvente orgánico polar produce agregados de moléculas proteicas que causan la desestabilización de los enlaces de hidrogeno presentes en la estructura de las proteínas de la clara.
Desnaturalización acido base
3. Precipitación por sales Al mezclar la muestra de clara de huevo con Sulfato de Amonio ((𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4), este último
La adición de un solvente orgánico como el etanol produce agregados de moléculas proteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una constante dieléctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en las fuerzas de atracción entre cargas opuestas y una disminución en el grado de ionización de los radicales de las proteínas, y en consecuencia
una disminución en la solubilidad de ésta. (Calvo, 2004)
Ecuación de la reacción:
azufrados (principalmente Cisteina y Metionina) de las proteínas (en especial Ovoalbumina) presentes en la clara de huevo y el acetato de plomo, debido a que estos se presentara una separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo y cualitativamente un olor característico fuerte y un precipitado negro, que permite su reconocimiento en el laboratorio (Aguirre & Edwin).
Ecuación de la reacción:
Desnaturalización por alcohol
7. Reacción Xantoproteica
5. Desnaturalización por metales pesados
La interacción entre ácido nítrico y la clara de huevo produjo una solución con coloración naranja, esto producto de la reacción del ácido nítrico con los aminoácidos aromáticos de las proteínas de la clara, los cuales formaron posteriormente nitroderivados de anillos aromáticos. Lo aminoácidos aromáticos que se reconocieron y dieron positivo durante la prueba son la Tirosina, Fenilalanina y Triptófano los cuales están considerablemente presentes en proteínas de la clara como la Ovoalbúmina.
Cuando se adicionó Sulfato de cobre en la muestra de clara de huevo se formó una precipitación de coloración azul, esto a causa de la presencia de Cobre (metal pesado) en el reactivo, por tanto al haber presencia de iones metálicos se neutralizaron las cargas anicónicas de los grupos esenciales de la proteína causando una precipitación debido a la desestabilización de esta.
Ecuación de la reacción:
Ecuación de la reacción: Reacción con Aminoácidos aromáticos
6. Reacción de acetato de plomo alcalino La reacción de acetato de plomo alcalino con la clara de huevo se tornó de un color oscuro a causa de la reacción entre los aminoácidos
Ejemplo: Tirosina:
8. Reacción de Hopkins Cole La reacción de Hopkins Cole con la muestra de clara de huevo dio como producto una muestra con color violeta, esta característica se formó debido a la reacción del derivado del indol presente en el triptófano de las proteínas de la clara con el ácido glioxílico, en presencia de ácido sulfúrico concentrado. En gran medida el análisis cualitativo dio positivo en la prueba por la riqueza de aminoácidos de triptófano en las proteínas de la muestra trabajada.
Ecuación de la reacción:
9. Reconocimiento de proteínas con el reactivo de Biuret Se formó una coloración violeta al reaccionar la muestra de clara de huevo con el reactivo de Biuret, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los cationes cúpricos (𝐶𝑢2+ ) en medio alcalino con las uniones peptídicas (los pares de electrones no compartidos del nitrógeno).
10. Reconocimiento de proteínas con el reactivo de Ninhidrina Al momento de reaccionar la muestra de Serina y de Prolina se formaron complejos coloreados de violeta y amarillo respectivamente. La causa principal de este comportamiento en la prueba se debe a que durante la reacción se consumen dos equivalentes de Ninhidrina por cada aminoácido. En el primer paso de la reacción el aminoácido se oxida, descarboxilandose y liberando amoniaco, mientras que uno de los equivalentes de Ninhidrina se reduce a Hindrindantina. En el segundo paso la Hindrindantina formada y otro equivalente de Ninidrina reaccionan con el amoniaco formando un complejo de color purpura (Purpura Ruhemann). La Prolina produce un complejo color amarillo. (Maria de la Luz Velasquez Monroy, 2013)
Ecuación de la reacción: Primer paso:
Ecuación de la reacción:
Segundo paso:
Bibliografía BERG, Jeremy; TYMOZCO, Jhon y STRYER, Lubert. Bioquímica. 6 ed. España: Reverté, 2007. En el caso de la prolina se producirá un complejo de color amarillo Conclusiones
La desnaturalización de proteínas se da por cambios bruscos del medio donde esta se encuentra. Los factores tales como temperatura, pH, sales, ácidos minerales fuertes y metales pesados afectan las interacciones de la estructura terciaria de la proteína de manera reversible o irreversible disminuyendo así la solubilidad de la misma. El desdoblamiento de la proteína no solo desnaturaliza su estructura, sino que inactiva considerablemente la función biológica que tiene la misma, por ejemplo, el impacto de las temperaturas altas que estén por encima de los 40°C o los 50°C hacen que la proteína sometida se vuelva instable e inactiva. La ovoalbúmina presente en la clara de huevo es una proteína con diverso contenido de aminoácidos, por lo tanto en todas las reacciones de reconocimiento realizadas los resultados fueron positivos.
FEDUCHI CANOSA, Elena. Et al. Bioquímica. Conceptos esenciales. Madrid: Médica Panamericana, 2010.380 p. ACUÑA. Química Orgánica. Costa Rica: Universidad Estatal a Distancia. 2008 CHEFTEL. Proteínas alimentarias. España: Acribia, S.A. 1989
Calvo, D. J. (2004). Homepage del Dr Juan Carlos Calvo. Obtenido de Homepage del Dr Juan Carlos Calvo: http://www.calvo.qb.fcen.uba.ar/Prec ipitacion%20por%20desnaturalizacio n%20selectiva.htm Maria de la Luz Velasquez Monroy, M. A. (7 de Junio de 2013). Slide Share. Obtenido de Proteínas: http://es.slideshare.net/OswaldoAnge les/protenas-22595188 Ochoa, S. H. (s.f.). UAM-Iztapalapa. Obtenido de Precipitación: http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/u ami/sho/Precipitacion.pdf Virginia Melo, O. C. (2007). Desnaturalización de las proteínas. En O. C. Virginia Melo, Bioquímica de los procesos metabólicos (pág. 98). Barcelona: Reverte.