INFORME LABORATORIO RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS EN ALIMENTOS

FACULTAD DE CIENCIAS AGROINDUSTRIALES, PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS, LABORATORIO DE BIOQUÍMICA.

RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS EN LA LECHE, HUEVO Y HARINA DE TRIGO. RECOGNITION OF AMINOACIDS IN THE MILK, EGG AND FLOUR OF WHEAT. Estudiantes: Maricela Valencia, Diego Rodríguez, Diana Milena Álzate. Quindío, Colombia. Noviembre 2009 Resumen En el desarrollo de esta práctica se realizaron diferentes ensayos cualitativos (ninhidrina, Millon, Xantoproteico, prueba de coagulación, prueba del sulfato de amonio, prueba de Biuret, reacción de Sakaguchi, reacción de Ehlrich, reacción de Hopkins Coles y reacción con acetato de plomo alcalino) con el objetivo de identificar aminoácidos presentes en muestras conocidas como la leche, el huevo y la harina de trigo, de igual forma se siguió una marcha analítica para caracterizar una muestra problema la cual finalizó en el reconocimiento de albúminas; debido a la especificidad de cada una de estas pruebas y a las características estructurales de cada aminoácido se consiguió reconocer la presencia o ausencia de ellos en las muestras analizadas. Palabras clave: marcha analítica, reacción de Hopkins, aminoácidos, albúmina, cisteina, acetato de plomo, ensayo de millón, aminoácido. Abstract In the development of this practice different qualitative tests(essays) were realized (ninhidrina, million, Xantoproteico, test(proof) of coagulation, test(proof) of the sulfate of ammonium, Biuret's proof, Sakaguchi's reaction, Ehlrich's reaction, Hopkins Coles's reaction and reaction with acetate of alkaline lead) with the aim(lens) to identify present amino acids in samples known as the milk, the egg and the flour of wheat, of equal form an analytical march followed to characterize a sample problem which I finish in the recognition of albumens; due to the specificity of each one of these proofs and to the structural characteristics of every amino acid one managed to recognize the presence or absence of them in every analyzed sample. Keywords: Analytical march, reaction of Hopkins, amino acids, albumen, cistern, acetate of lead, test(essay) of million, amino acid.


1. Introducción Los aminoácidos que constituyen a las proteínas, son substancias que tienen como característica general el hecho de poseer un carboxilo libre y un grupo amino, situado en el carbono alfa con respecto al carboxilo. En todos los aminoácidos alfa que forman a las proteínas, el grupo amino alfa es un grupo primario, es decir que no tiene sustituyentes. La única excepción ocurre con la prolina, que es un iminoácido, ya que su grupo es secundario. Los aminoácidos difieren entre sí únicamente por las características del resto de su molécula o cadena lateral (R), de manera que su formula general es

Las propiedades de cada aminoácido dependen tanto de su grupo carboxílico como de su grupo amino alfa, y de su cadena lateral (R). En un polímero lineal de aminoácidos o polipéptido, de todos los grupos carboxilo alfa y amino de los aminoácidos que intervienen, solo quedan libres un grupo amino alfa, el grupo terminal y un grupo carboxilo alfa, el grupo carboxilo terminal. Así pues, en una proteína las cadenas laterales de los aminoácidos que la constituyen, son las que influyen de manera directa en las propiedades de

cada zona a lo largo de la cadena polipeptídica y, en consecuencia, determinan también en gran medida su comportamiento. Una de las propiedades más importantes de las cadenas laterales de los aminoácidos, es su capacidad de interacción con los solventes acuosos o con los reactivos que permiten su identificación, es decir su grado de polaridad o no polaridad. [1] 2. Metodología Para el desarrollo de la práctica se realizaron 9 pruebas diferentes a las muestras de leche evaporada, clara de huevo y harina de trigo diluida como se muestra a continuación: Nota: la muestra problema no aparece en todas las pruebas, pues a esta se le realizó una marcha analítica (figura 1) para su reconocimiento. A. Ensayo con ninhidrina: Para esta prueba se usaron seis tubos de ensayo cada uno con 1 ml de agua destilada, solución de alanina al 0.5%, leche previamente evaporada al 60%, albumina de huevo diluida al 10%, muestra problema y solución de harina de trigo al 10%; posteriormente se adicionó a cada uno de los tubos 1 mL de Ninhidrina, para luego calentar en baño de maría a ebullición por 10 minutos, finalmente se realizaron las respectivas observaciones.


B. Prueba de Biuret: Para esta prueba se usaron seis tubos de ensayo cada uno con 1 ml de agua destilada, solución de alanina al 0.5 %, leche previamente evaporada al 60 %, albumina de huevo diluida al 10 %, muestra problema y solución de harina de trigo al 10%; posteriormente se adicionó a cada uno de los tubos 1 mL de hidróxido de sodio (NaOH) al 10% y se mezclo, continuando con la adición gota a gota de sulfato cúprico ( CuSO4) al 0.5 % hasta la aparición de una coloración violeta o amarilla, finalmente se tomó nota de lo observado en cada tubo.

E. Ensayo de Millon:

C. Prueba de coagulación: En seis tubos de ensayo se adicionó 1 mL de agua destilada, solución de alanina al 0.5 %, leche previamente evaporada al 60 %, albumina de huevo sin diluir, muestra problema y solución de harina de trigo al 10% respectivamente, a cada uno de estos se agregó 1 mL de disolución saturada de cloruro de sodio (NaCl) y 4 gotas de acido acético al 30%, seguidamente se mezclo y se sometió cada tubo por 1 minuto a calor de llama. Finalmente se tomaron las observaciones correspondientes. D. Prueba amonio:

del

sulfato

previamente evaporada al 60 %, albumina de huevo sin diluir, muestra problema y solución de harina de trigo al 10%; posteriormente se adicionó a cada uno de los tubos 1 mL de solución de sulfato de amonio al 50% se mezclo y se dejo reposar por 10 minutos, al pasar este tiempo se observo presencia o ausencia de precipitado; finalmente se centrifugaron a 3000 r.p.m. durante 10 minutos los tubos que contenían leche evaporada, albumina y solución de harina de trigo. Se tomaron las observaciones pertinentes en cuanto a la presencia o ausencia de precipitación.

de

En diferentes tubos de ensayo se adicionó 1 mL agua destilada, solución de alanina al 0.5 %, leche

Para este ensayo se usaron 5 tubos de ensayo, al primero se adicionó 2 mL de agua destilada, al segundo solución de tirosina, al tercero leche evaporada, al cuarto albumina de huevo sin diluir y al quinto solución de harina de trigo al 10%; a cada uno de los tubos se les adicionó 1 mL de reactivo de Millon. Los tubos fueron sometidos a un baño de agua en ebullición durante 10 minutos. Después de este tiempo se tomaron observaciones en cuanto a los cambios de color. F. Ensayo Xantoprotéico: Se usaron de igual forma 5 tubos con las mismas muestras que el ensayo anterior a diferencia que se uso albumina de huevo diluida, posterior a estas adiciones a cada tubo, se


agregó 2 mL de acido nítrico concentrado. Después se sometieron a un baño de agua en ebullición hasta observar un cambio de coloración. G. Reacción de Sakaguchi Para esta prueba se usaron cinco tubos de ensayo cada uno con 5 mL de agua destilada, solución de arginina al 0.5%, leche previamente evaporada al 60%, albúmina de huevo diluida al 10% y solución de harina de trigo al 10%; a continuación se enfriaron en un baño de hielo por 10 minutos, posteriormente de les adiciono 1 mL de NaOH 40% y nuevamente se pusieron 10 minutos a enfriar en el baño de hielo, para adicionar 5 mL de α – naftol y 3 gotas de reactivo Sakaguchi. Se observaron los cambios de color en cada tubo. H. Reacción de Ehlrich: Se rotularon 5 tubos de ensayo de la siguiente manera, tubo 1 blanco (agua destilada), tubo 2 (triptófano), tubo 3 (albumina de huevo diluida) y tubo 4 harina de trigo diluida 10 %, a cada uno de estos se adicionó 1 mL de acido sulfanílico 0.5 % y 1 mL de nitrito de sodio 0.5 %, se mezclo y se dejaron en reposo durante 15 minutos, para así adicionar1 mL de las muestras correspondientes según el rotulo para cada tubo, se mezclo y se termino adicionando 0.5 mL NH4OH 10 % se tomaron las observaciones correspondientes.

I. Reacción de Hopkins Cole: A cinco tubos diferentes se adicionó en su orden 2 mL de agua destilada, 2 mL de triptófano 0.5 %, 2 mL albúmina de huevo diluida y 2 mL harina de trigo diluida 10 %, a cada uno de estos se les agrego 2 mL del reactivo de Hopkins Cole, se mezclo y posteriormente se añadió 1 mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) cuidadosamente por las paredes del tubo y finalmente se observó la aparición de un anillo.

J. Reacción con plomo alcalino

acetato

de

Para esta prueba se usaron cinco tubos de ensayo cada uno con 1 ml de agua destilada, solución de metionina al 0.5%, leche previamente evaporada al 60%, albúmina de huevo sin diluir y solución de harina de trigo al 10%; posteriormente se adicionó a cada uno de los tubos 2 mL NaOH 10 %, estos se calentaron levemente, seguidamente se les adicionó de 0.5 mL de acetato de plomo al 10 % y se calentaron en baño a ebullición por 5 minutos, finalmente se observaron los cambios ocurridos en cada tubo.

MUESTRA PROBLEMA


Ensayo con Ninhidrina

P sulfato de amonio

(+) Violeta proteína, polipéptido o aa.

(-) no precipita albúminas.

Prueba Biuret

(+) Violeta proteína, polipéptido o

Figura 1. Esquema de marcha analítica para muestra problema.

P Coagulació

3.

(+) Coagula albuminas o RESULTADOS globulinas.

Y DISCUSIÓN

Tabla 1. Resultados obtenidos en la práctica.

Nº muestra Prueba 1 P. Ninhidrina 2 P. Biuret 3 P. Coagulación 4 P. Sulfato amonio 5 P. Millón 6 P. Xantoprotéica 7 P. Sakaguchi 8 P. Ehlrich 9 P. Hopkins-Cole 10 P. Acetato de plomo alcalino

Tubo1

Tubo2

Tubo3

-

+ + + + + + -

-

-

+ + + + + + + + N/A -

Tubo 4 Tubo 5 + + + + + + + +

Tubo 6

+ + N/A N/A N/A N/A N/A N/A

+ + + + + + +

Tubo 1 Blanco; Tubo 2 Aminoácido; Tubo 3 Leche evaporada; Tubo 4 Albúmina de huevo; Tubo 5 Muestra problema; Tubo 6 Solución de harina de trigo.; N/A: No aplica

A. Ensayo con ninhidrina Al realizar este ensayo se encontró que el reactivo ninhidrina reaccionó con el grupo alfa-amino libre (al ser sometidos a calentamiento) de los aminoácidos presentes en la leche (+ +), la solución de albúmina de huevo diluida (++), la muestra problema (+ +), la solución de harina de trigo (+) y la alanina (+++) mostrados en la

Figura 2. Reacción general de la ninhidrina con los aminoácidos [2]


tabla 1, produciendo complejos coloreados violeta- azuloso (figura 2) en diferentes intensidades (figura 3) la cual es proporcional a la concentración de este aminoácido, indicando de esta forma la presencia de aminoácidos en todas las muestras y obviamente la ausencia en el blanco. Para la intensidad del color producido en cada una de las muestras analizadas se denominó de la siguiente manera: (+) Violeta tenue. (++) Violeta intenso. (+++) Violeta muy intenso.

Figura 4. Coloraciones obtenidas en la prueba de Biuret.

Esta prueba es general para polipéptidos y proteínas (características que cumplen las muestras analizadas) esta reconoce las uniones peptidicas y lo hace mediante la reacción que se da cuando se forma un complejo entre los iones Cu2+ (característico de uno de los componentes del reactivo CuSO4) y los pares no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos, lo que genera el cambio de color y estructuralmente se visualiza en la figura 5.

Figura 3. Coloraciones obtenidas para la reacción de ninhidrina.

B. Prueba de Biuret: de acuerdo a la tabla 1 los resultados para esta prueba fueron positivos para la muestra de alanina (+), leche evaporada (++), albúmina (+++), muestra problema (++), harina de trigo diluida (+), de acuerdo a las coloraciones obtenidas en una escala violeta. (figura 4).

Figura 5. Esquema reacción Biuret.

C. Prueba de coagulación: Esta prueba permitió confirmar y reconocer diferentes tipos de proteínas presentes en: la


leche, esto se evidencio debido a la coagulación, en la albúmina de huevo sin diluir se confirmo debido a la coagulación total en el tubo (color blanco) debido principalmente a la aplicación de calor ya que por encima de 60º C estas son inestables haciendo disminuir su solubilidad y generando la precipitación

centrifugación (figura 7). Para la muestra problema no se observaron precipitados indicando de esta forma que las proteínas que se encontraron en esta eran albúminas como se indica en la figura 7.

[3].

Teniendo en cuenta que en esta prueba se utilizaron 3 agentes (calor, acido y sales) capaces de desnaturalizar proteínas no se comprende porque en la muestra de solución de harina de trigo el resultado es negativo. D. Prueba del sulfato de amonio: En los resultados de esta prueba podemos encontrar que se reconoció proteínas en la leche, en la albúmina de huevo sin diluir y en la solución de harina de trigo ya que estas formaron un precipitado de color gris (figura 6) al entrar en contacto con el sulfato de amonio esto se debe a que al adicionar una sal soluble a las muestras se disminuye la interacción proteína-agua y entonces predominara la interacción proteína-proteína y producirá precipitación [4], después de haber realizado

Figura 6. Resultados obtenidos en la prueba sulfato de amonio antes de centrifugación.

Figura 7. Resultados obtenidos en la prueba sulfato de amonio después de centrifugación.

E. Ensayo de Millon: como se observa en la tabla 1 el ensayo fue positivo para tirosina (color rojo + +), leche evaporada (color rojo +), albúmina de huevo (rojo claro +) y harina de trigo (amarillo-rojo +); indicando la presencia de tirosina en dichas muestras, ya que la prueba es especifica para este aminoácido, el cual contiene un anillo de


benceno al que se une un grupo hidroxilo (figura 8). En esta prueba los compuestos mercúricos en medio fuertemente ácido (ácido nítrico del reactivo) se condensan con el grupo fenólico formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. Figura 9. Coloraciones obtenidas en el ensayo Xantoproteico.

Al generarse estos cambios de coloración se confirma la presencia de alguno de los aminoácidos aromáticos dentro de las proteínas de las muestras evaluadas. Figura 8. Estructura tirosina.

.

[5]

F. Ensayo Xantoproteico: en la tabla 1 se presentaron los resultados positivos de las diferentes muestras (tirosina, leche evaporada, albúmina y harina de trigo) se evidenció que inicialmente la coloración fue la esperada para dicha prueba y de igual forma para la confirmación con el NaOH (figura 9), este cambio se debe a que se produce la nitración del anillo bencénico presente en los aminoácidos aromáticos como lo son tirosina (figura 8), fenilalanina y triptófano (figura 10), obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjado en medio fuertemente alcalino (formación de ácido picrámico o trinitrofenol) [2]

Fenilalanina

triptófano

Figura 10. Aminoácidos aromáticos

G. Reacción de Sakaguchi: puesto que la reacción positiva de esta prueba se generó debido a la presencia de un grupo guanidinio (figura 11) el cual reaccionó con la solución de α – naftol en la presencia de bromo (componente del reactivo de sakaguchi) en medio alcalino, la muestra de arginina obviamente arrojo un resultado positivo por hacer parte de ella dicho grupo, sin embargo para el resto de muestras los resultados en cuanto al cambio de


la coloración no fueron muy claros (figura 12.), particularmente en el caso de la leche se vio un tono casi violeta, quizás la coloración fue enmascarando por el color característico de la leche. E igual forma se asumió este resultado como positivo por ser la arginina un aminoácido de fácil presencia en los lácteos.

Figura 11. Estructura Arginina. [6]

nitrito de diazonio.

sodio

forman

sales

Figura 13. Coloraciones obtenidas en la reacción de erhlich.

Las sales de diazonio aromáticas son muy estables, se pueden manejar en el laboratorio y en la industria y dan reacciones que han permitido desarrollar importantes aplicaciones [7]. Estas son importantes intermedios en síntesis orgánicas y encuentran amplio uso en la preparación de una clase de compuestos conocida con el nombre de colorantes azoicos [8].

Figura 12. Coloraciones obtenidas en la reacción de Sakaguchi.

H. Reacción de ehrlich: las muestras sometidas a esta prueba a excepción del blanco presentaron resultados positivos de acuerdo las coloración obtenida (figura 13) lo que indico la presencia de tirosina (figura. 8) e histidina (figura 14), los cuales contienen una anillo aromático y un anillo nitrogenado respectivamente como radical, estos al reaccionar con el acido sulfanilico adicionado y el

Figura 14. Estructura de histidina.

I. Reacción Cole

de

[9]

Hopkins

Los resultados para esta prueba nos indican que el reactivo de Hopkins Cole se encontró en malas condiciones ya que no reconoció el anillo indólico del aminoácido


triptofano (figura 15) presente en las muestras analizadas, pues en la figura 17 se muestra la ausencia del anillo coloreado. Sin embargo este resultado no indica que estas no contienen tal aminoácido esencial [10] el cual podría manifestarse positivo para la leche ya que esta contiene caseína [11]. Nota: esta prueba se realizo 2 veces para verificar este resultado. Figura 16. Reacción del triptofano presencia del reactivo Hopkins Cole

Figura 15. Estructura aminoácido triptofano

La reacción que debía de ocurrir para determinar la positividad en esta prueba como la formación de un anillo de color violeta-rojizo en un medio ácido se puede observar en la figura 16.

Figura 17. Resultados reacción de Hopkins Cole.

obtenidos

en

en

la

J. Reacción con acetato de plomo alcalino: en cuanto a los resultados obtenidos para esta prueba la metionina siendo un aminoácido azufrado no presentó precipitación de sulfuro de plomo, quiere decir que este ultimo no reaccionó con el acetato de plomo en medio alcalino al cual se expuso, esto pudo ser ocasionado por las condiciones del reactivo o quizás un error durante la realización de la practica.


agar ya que esta debía estar sometida a calentamiento constante para evitar su solidificación.

Metionina

Cisteina

Figura 18. Aminoácidos azufrados.

Mientras que para el caso de la albúmina de huevo y la harina de trigo se confirmó la presencia de metionina y/o cisteína (figura 18) en sus proteínas con la aparición del precipitado color gris (figura 19). En este caso si se presento la reacción esperada del sulfuro de plomo con el acetato.

4. CONCLUSIONES Indicamos la presencia de proteínas en diferentes muestras de alimentos mediante pruebas cualitativas, del mismo modo identificamos algunos de los aminoácidos presentes en ellas por medio de las reacciones que ocurrieron en cada caso de acuerdo al radical o al grupo que caracteriza al aminoácido. Identificamos estructuralmente diferentes aminoácidos presentes en determinadas proteínas o en su defecto como aminoácidos libres. Por medio de la marcha analítica, identificamos, que la muestra problema en su composición contiene albúminas.

Figura 19. Coloraciones obtenidas en la reacción de acetato de plomo alcalino.

En los resultados obtenidos durante el desarrollo de la marcha analítica identificamos que la muestra problema contenía polipéptidos y proteínas estas ultimas a través de pruebas mas especificas se manifestaron como albúminas, de acuerdo a estos resultados y a las características físicas de la muestra posiblemente podría tratarse de un

La leche (colanta) es una fuente de proteína y por lo tanto de aminoácidos muy importante comparado con la harina de trigo ya que según los resultados contiene varios tipos de aminoácidos. Las pruebas realizadas no permitieron reconocer aminoácidos esenciales tales como la metionina y el triptófano al parecer por errores durante la realización de la práctica o por el estado de los reactivos. 5. BIBLIOGRAFIA


[1] Peña A (2004), Bioquímica. Segunda edición. México: Editorial LIMUSA, Pág. 66-67 [2] Mancilla, C; Blanco E; Pérez, S; Rosas, T y Castrejón, C. (2009) Propiedades químicas y fisicoquímicas de las proteínas. México. Consultado el 30 de Octubre de 2009 en: http://www.scribd.com/doc/15958125/1PROPIEDADES-QUIMICAS-Y-FISICOQUIMICASDE-LAS-PROTEINAS

[3] De la vega. G (2009) Propiedades de la harina de trigo: Clasificación y propiedades funcionales. Consultado el 4 de Noviembre de 2009 en: http://www.utm.mx/edi_anteriores/Temas38/2 NOTAS%2038-1.p

[4] Universidad Nacional de Rio Cuarto (2008) Química biológica 2110. Microbiología y técnico de laboratorio. Reacciones de precipitación de proteínas. Consultado el día 3 de noviembre de 2009 en: http://dbm.exa.unrc.edu.ar/

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