UNIVERSIDAD DE NARIÑO PRACTICA DE BIOQUIMICA No. 2 RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS Y PROTEÍNAS Docente: Claudia Sofía Guevara A. Reacción de la ninhidrina La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con el grupo amino de aminoácidos libres y con los grupos amino de la molécula proteínica para dar un compuesto azul violeta. Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina también reaccionan con la ninhidrina pero en este caso se obtiene un color amarillo en lugar de violeta. La reacción es muy sensible por lo cual se utiliza en cromatografía y en la detección de aminoácidos y proteínas en muestras biológicas.
Técnica: 1. Rotular 5 tubos de ensayo como glicina, metionina, prolina, albumina (clara de huevo) y muestra biológica (algún producto vegetal que contenga proteínas) 2. Añadir a cada tubo 1 ml de la sustancia correspondiente de acuerdo a su rotulo 3. Agregar a cada tubo 1 ml de ninhidrina 4. Calentar los tubos en un baño maría a ebullición durante 5 minutos, 5. Observar las coloraciones presentadas y registrar los resultados
Reacción Xantoproteica Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos o los llamados aromáticos como la tirosina, triptófano y fenilalanina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro.
Técnica 1. Poner en el tubo de ensayo 2 ml de solución albumina (clara de huevo), muestra biológica, glicina, triptófano, fenilalanina y tirosina. 2. Añadir 1 cc. de HNO3 concentrado. 3. Calentar al baño maría a 100: C.. 4. Enfriar en agua fría 5. Añadir gota a gota una disolución de sosa al 40%.
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Reacción de Biuret La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret, de fórmula: Que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida, da una coloración violeta característica.
Técnica 1. Poner en diferentes tubos de ensayo de 2 cc. de albúmina de huevo (clara de huevo), de glicina, de alanina y muestra biologica 2. Añadir 2cc. de solución de hidróxido sódico al 20%. 3. A continuación 4 ó 5 gotas de solución de sulfato cúprico diluida al 1%. 4. Debe aparecer una coloración violeta-rosácea característica.
Reacción de los aminoácidos azufrados Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo.
Técnica 1. Poner en diferentes tubos de ensayo de 2 cc. de albúmina de huevo (clara de huevo), de glicina, de cisteína, metionina y muestra biológica. 2. Añadir 2 cc. de solución de hidróxido sódico al 20%. 3. Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%. 4. Calentar el tubo hasta ebullición. 5. Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo, utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que nos sirve para identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre.
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Reacción de Millón Esta reacción se debe a la presencia, de un grupo fenólico, presente en el radical de tirosina. Este grupo por calentamiento con el reactivo de Millos (una mezcla de nitrato y nitrito mercúrico disueltos en ácido nítrico concentrado), produce una coloración roja que se debe a la formación de la nitrotirosina que, por una reacción de adición con el mercurio en el curso del calentamiento, se transforma en una sal mercúrica de color rojo.
Técnica: 1. Poner en diferentes tubos de ensayo de 2 cc. de albúmina de huevo (clara de huevo), de glicina, tirosina y muestra biologica. 2. Añadir 1 cc. de reactivo de Millon y agitar. 3. Calentar los tubos en un baño maría durante 5 minutos y agregar 0,5 ml de nitrito de sodio 5%. 4. La aparición de una tonalidad roja indica la presencia de tirosina.
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Reacción de Hopkins Cole El anillo indólico presente en la cadena lateral de los alfa-aminoácidos libres o haciendo parte de péptidos y proteínas se puede reconocer mediante reacción con el ácido glioxílico a pH ácido, puesto que forma complejos de coloración violeta o amarillo violeta, permitiendo así identificar al triptófano.
Técnica: 1.
Poner en diferentes tubos de ensayo de 2 mL de albúmina de huevo (clara de huevo), triptófano, albúmina de huevo, glicina y muestra problema. 2. Adicione a cada uno 2 mL. del reactivo de Hopkins Cole. 3. Mezcle bien el contenido y adicione a cada tubo por las paredes lenta y cuidadosamente, sin mezclar 1 mL. de ácido sulfúrico concentrado, la formación de un anillo violeta en la interfase es prueba positiva para el triptófano.
Desnaturalización de Proteínas Las proteínas, debido al gran tamaño de sus moléculas, forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con formación de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 70:C o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan por la destrucción de su estructura terciaria y cuaternaria
Técnica Para ver la coagulación de las proteínas se puede utilizar clara de huevo, para conseguir más volumen puede prepararse para toda la clase una dilución de clara de huevo en agua, de forma que quede una mezcla aún espesa. 1. Colocar en un tubo de ensayo una pequeña cantidad de clara de huevo. 2. Añadir 5 gotas de ácido acético y calentar el tubo a la llama del mechero.
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