UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POST GRADO SECCIÓN DE POST GRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Influencia de la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga en la producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major
TESIS Para obtener el Grado Académico de MAESTRO EN CIENCIAS MENCIÓN BIOTECNOLOGÍA AGROINDUSTRIAL Y AMBIENTAL AUTOR : Br. LUIS EDUARDO EDUARDO RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ PÉREZ PÉREZ ASESOR ASESOR : Dr. CARLOS CARLOS ALBER ALBERTO TO LEÓN LEÓN TORRE TORRES S.
TRUJ TRUJIL ILLO LO – PERÚ PERÚ
2011
1
PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado Dictaminador:
Dando cumplimiento con lo dispuesto en el reglamento de maestría de la Escuela de Post Grado de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración el trabajo de Tesis titulado: Influencia de la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor en la producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major , para obtener el Grado Académico de Maestro en Ciencias Biológicas con Mención en Biotecnología Agroindustrial y Ambiental. El mismo que dejo a vuestro criterio para su dictamen, esperando esperando reunir los requisitos para su aprobación. aprobación.
i
PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado Dictaminador:
Dando cumplimiento con lo dispuesto en el reglamento de maestría de la Escuela de Post Grado de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración el trabajo de Tesis titulado: Influencia de la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor en la producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major , para obtener el Grado Académico de Maestro en Ciencias Biológicas con Mención en Biotecnología Agroindustrial y Ambiental. El mismo que dejo a vuestro criterio para su dictamen, esperando esperando reunir los requisitos para su aprobación. aprobación.
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JURADO DICTAMINADOR
-----------------------------------------------Dr. JOSÉ MOSTACERO LEÓN PRESIDENTE
---------------------------------------------Dr. HEBER ROBLES CASTILLO SECRETARIO
----------------------------------------------Dr. CARLOS A. LEÓN TORRES MIEMBRO
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DEDICATORIA
A Dios , , creador todopoderoso, todopoderoso, por iluminar y bendecir mi vida vida y de toda mi familia.
Con todo mi amor y gratitud a mis padres Isabel y Hernán
a quienes considero mi fuente de inspiración para mi constante superación. superación.
Con amor, admiración y respecto a: IBIS
por compartir conmigo su amor, comprensión, sacrificio, penas, alegrías y sueños de superación.
A mis adorados hijos: Anghelí, Anthony, Anthony, Denil y Luis
por brindarme su su cariño y comprensión y ser mi razón de existir. A mi hermana: Liliana y mis queridas sobrinas: sobrinas: Grecia y Emiliy por regalarme su su cariño y aliento en todo momento.
iii
AGRADECIMIENTOS
·
A mi asesor y amigo Dr. CARLOS ALBERTO LEÓN TORRES, por su invalorable amistad y acertada orientación y contribución brindada durante el desarrollo de la presente investigación.
·
A mi maestro y amigo Ms. ALFREDO MARTÍN ALVA, por su incomparable amistad, estima y colaboración en el análisis estadístico de los resultados del presente estudio de investigación.
·
De manera especial a mi maestro y amigo Ms. CARLOS NOMBERTO RODRÍGUEZ , por su orientación y facilidades facilidades brindadas para el desarrollo desarrollo de esta investigación.
·
Hago extensivo mi agradecimiento a mis maestros y amigos:
Dr. HEBER ROBLES CASTILLO Ms. ORLANDO PRETTEL SEVILLANO Por su apoyo, facilidades y ayuda brindada en la realización del presente trabajo de investigación.
iv
ÍNDICE
PRESENTACIÓN ……………………………………………………………………….. i JURADO DICTAMINADOR ……………………………………………………………ii DEDICATORIA ………………………………………………………………………….iii AGRADECIMIENTO ……………………………………………………………………iv INDICE GENERAL ……………………………………………………………………...v RESUMEN ……………………………………………………………………………… viii ABSTRACT ……………………………………………………………………………. ix I. II.
III. IV. V. VI. VII.
INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………..1 MATERIAL Y METODO ………………………………………………………..6 1. MATERIAL ……………………………………………………………………6 1.1.1 Material Biológico…………………………………………………….….6 2. MÉTODO ……………………………………………………………………....6 2.1 Reactivación de la cepa ……………………………………………….…..6 2.2 Tratamiento de los sustratos ………………………………………….…...6 2.2.1 Tratamiento de la cáscara de Coffea arábiga y preparación del caldo fermentativo …………………………….…6 2.3 Preparación del inóculo…………………………………………………....7 2.4 Acondicionamiento de los biorreactores ……………………………….…7 2.5 Proceso de Producción de biomasa – fermentación ……………………....8 2.6 Determinación de la Influencia de la concentración de los azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga en la producción de proteína unicelular de Candida utlis var. major ……………………...8 2.6.1 Determinación del peso seco de la biomasa ………………………...8 2.6.2 Cuantificación de los azúcares reductores totales residuales ……….9 2.6.3 Determinación del rendimiento en base a azúcares reductores totales suministrado ………………………………………………...9 2.6.4 Cálculo de la productividad………………………………………....9 2.7 Análisis estadísticos………………………………………………………10 RESULTADOS…………………………………………………………………..11 DISCUSIÓN …………………………………………………………………….18 CONCLUSION…………………………………………………………………..22 RECOMENDACIONES ………………………………………………………...23 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ………………………………………….24
v
ANEXOS Anexo 1
: “Cáscara” de Coffea arabiga var. catimor , observe el momento en el despulpado (Rioja – San Martín). Foto A : Momento del recojo del fruto de Coffea arabiga var. catimor para su despulpado. Foto B : Cáscara de Coffea arabiga var. catimor, después del
despulpado.
Anexo 2
: Composición físico –química de la “cascara” de Coffea arabiga var. catimor .
Anexo 3
: Método de Extracción de ART de la “cascara” de Coffea arabiga var. catimor por método físico –químico con agua (Bardales y Col, 2009).
Foto A: Método de extracción por acción físico – química con agua. Foto B: Filtrado de la extracción de los ART.
Anexo 4
: Preparación del caldo fermentativo a base de azúcares reductores totales de “cascara” de Coffea arabiga var. catimor . Foto A : Autoclavado por espacio de 15 minutos a 121 ºC y a 15 libras
de
presión. Foto B : Caldo fermentativo preparado, esterilizado y en concentraciones de 5, 10 , 15, 20, 25, 30 y 35 g/L de ART de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor.
Anexo 5
: Observación
microscópica y macroscópica de Candida utilis
var. Major.
Anexo 6
: Diseño del biorreactor tipo tanque agitado .
Anexo 7
: Esterilización del sistema en cámara U.V.
Anexo 8
: Producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major . Foto A : Se observa los biorreactores con sus respectivos sistemas de agitación y aireación. Foto B : Vista general del sistema trabajando, nótese la presencia de una fuente de poder y bombas de aireación.
Anexo 9
: Valores originales de biomasa neta producida “X” (g/L) de Candida utilis var. major en relación a la concentración de azúcares reductores totales (ART)
suministrados “So” (g/L) de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y sus estimadores.
vi
Anexo 10 : Valores originales de rendimiento “Y” (%) de Candida utilis var. major en relación a la concentración de azúcares reductores totales (ART) suministrados “So” (g/L) de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y sus estimadores.
Anexo 11 : Valores originales de productividad del sistema “P” (g/L.h) de Candida utilis var. major en relación a la concentración de azúcares reductores totales (ART)
suministrados “So” (g/L) de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y sus estimadores.
Anexo 12 : Valores promedio originales y estimados de biomasa neta producida, rendimiento y productividad de Candida utillis var. major a diferentes concentraciones de azúcares reductores totales (ART) suministrados de de “cáscara” de Coffea . arabiga var. catimor
vii
RESUMEN Se determinó la influencia de la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor en la producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major . Se diseñó un biorreactor tipo tanque agitado de 16 cm de altura, con turbina
Rushton. El inóculo fue preparado a partir de una cepa de Candida utilis var. major , el medio de cultivo fue elaborado a partir de diluciones de azúcares reductores totales (ART) extraídos de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor desde 5 hasta 35 g/L en intervalos de cada 5 unidades. El bioproceso de fermentación aeróbica se llevó a cabo a 25 +/- 3ºC; a pH de 5,0 – 5,5 y durante un periodo de 50 horas. Se encontró que la biomasa y la productividad aumentan progresivamente desde 1 hasta 14 g/L y desde 0,02 hasta 0,28 g/L.h respectivamente, tal como se incrementa la concentración de “ART” de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor. A la concentración de 20 g/L de ART, se alcanzó el rendimiento máximo (55,19 %) de Candida utilis var. major , muy cercano al rendimiento teórico de 56,79 %.
En conclusión, el incremento de la concentración de azúcares reductores de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor influye significativamente aumentado la producción de proteína
uniceluar de Candida utilis var. major .
Palabras claves: Proteína unicelular: Células muertas y deshidratadas de microorganismos, empleados con fines alimenticios por su alto valor proteico.
ART: Azúcares Reductores Totales. Candida utilis: Levadura utilizada en la producción de proteína unicelular.
viii
ABSTRACT
The influence of the concentration decided of sugar reductors totals of "rind" of Coffea arabiga var. catimor in the production of single-cell protein of
Candida utilis var. major . A
biorreactor was designed type waved tank of 16 cm of height, with turbine Rushton. The preparation of the inoculo was carried out starting from Candida utilis var. major , the way of culture was elaborated from dilutions of sugar reductors totals (ART) extracted from "rind" of Coffea arabig a var. catimor from 5 up to 35 g/L in intervals of every 5 units. The bio process of
aerobic fermentation was carried out to 25 +/- 3ºC; to pH of 5,0 - 5,5 and during a period of 50 hours. One thought that the biomass and the productivity increase progressively from 1 up to 14 g/L and from 0,02 up to 0,28 g/L.h respectively, as increases the concentration of "ART" of "rind" of Coffea arabiga var. catimor . To the concentration of 20 g/L of ART, there was reached the maximum performance (55,19 %) of Candida utilis var. major , very near to the theoretical performance of 56,79 %.
In conclusion, the increase of the concentration of sugar redactors totals of "rind" of Coffea arabiga var. catimor influences significantly increased the production of single-cell
protein of Candida utilis var. major.
Key words: Single-cell protein: Cells dead and dehydrated of microorganisms, used with food ends for his high multifaceted value.
ART: Sugar Reductors Totals. Candida utilis: Yeast used in the production of single-cell protein.
ix
x
INTRODUCCIÓN
Durante las últimas décadas pasadas se ha presentado un incremento de la población a nivel mundial; a esto se acompaña el patrón decreciente de la producción agrícola lo que ha originado un importante déficit de alimentos a nivel mundial, sobre todo en aquellos en vías de desarrollo, especialmente de Latinoamérica. Se estima que cada año, más 12 millones de personas mueren de inanición y por enfermedades relacionadas con la malnutrición, causadas principalmente por el bajo y deficiente consumo de alimentos de construcción como las proteínas (Organización Mundial de las Salud, 2005).
Esta deficiencia de proteínas en el consumo humano pone cierto apremio en el incremento de la productividad agrícola. Pero esto requiere de la modernización de la agricultura, lo cual, se ha convertido en una misión casi imposible por la falta de recursos económicos para implementar técnicas apropiadas, el empobrecimiento gradual del suelo, fenómenos climatológicos adversos y escasez de agua (Box, 1993).
En ese sentido, en las últimos años, en el mundo han surgido diversas propuestas y técnicas para producir proteínas de consumo humano y animal por métodos no convencionales. Una de esas vías más prometedoras es incrementar la disponibilidad de proteínas de origen microbiano o unicelulares mediante la fermentación de residuos agroindustriales (Scragg, 1996).
Por tanto las proteínas unicelulares o monocelulares son células muertas y deshidratadas de microorganismos tales como: levaduras, bacterias, hongos y algas, los cuales crecen en diferentes fuentes de carbono y se emplean con fines alimenticios debido a su alto valor proteico (Frazier y Westhoff, 1991; García y Col, 1993). Estas presentan 1
grandes ventajas comerciales con respecto a otras fuentes de proteínas convencionales, así como características nutricionales que tienen un efecto directo sobre los costos y tecnologías usados para su producción especialmente a nivel industrial (Iraelidis y Coduonis, 1982).
Existen tres ventajas para la producción de proteína unicelular: el rápido crecimiento de los microorganismos, la alta eficiencia o productividad alimenticia y el bajo costo de la materia prima o sustrato (Lifthield, 1986). Las dos primeras están en relación directa con el corto tiempo de generación de 20 minutos y sin ningún factor limitante, una sola bacteria con una biomasa de solamente 10 -12 g, puede producir 2,2 x 10 25 toneladas de biomasa (4000 veces la masa de nuestro planeta en un periodo de 2 días). Eso implica que una sola bacteria en un ambiente no restringido, puede producir 10 11 veces su propia biomasa de proteína en un solo día (Israelidis y Evangelopoulos, 1980).
Respecto al sustrato empleado, en un inicio se centro en el uso de hidrocarburos y otros derivados del petróleo como metanol y etanol; recientemente, el interés se ha dirigido hacia
recursos
renovables
como
residuos
agrícolas
y subproductos
industriales (García, Quintero y López, 1993). La factibilidad económica de producir proteína unicelular depende básicamente del uso eficiente de un sustrato de bajo costo, aprovechado por el microorganismo, el cual debe proceder de actividades agroindustriales propias de la zona en donde se desea producir la proteína unicelular, por ejemplo zonas de producción de café, esto logra que el sustrato empleado sea barato y que su proceso contribuye a limpiar el medio ambiente de los desechos agroindustriales; lo cual hace de esta actividad una
alternativa
económica, social y ecológicamente viable y de rentas
altas (Carter, 1996).
2
En Cuba, Brasil, Colombia y México en los que la industria azucarera es muy desarrollada, se han aplicado tecnologías para producir proteína unicelular empleando como sustrato melaza y bagazo con resultados exitosos en ambos casos, la misma que puede ser reemplazado por la cáscara de café; que posee un mucílago que contiene alrededor de 30 % de azúcares reductores, para la preparación de los abonos orgánicos fermentados, la cascara de café se constituye en una excelente fuente de celulosa, lignina, sílice y cenizas ( Restrepo, 1978). Por otro lado cuando la cáscara del café, cuando se humedece con un poco de suero de leche y se mezcla con levadura y melaza de caña o aguas mieles provenientes del propio beneficio del grano, éste constituye un excelente medio de cultivo para la multiplicación diversificado de microorganismos en constantes sucesiones biológicas, para la obtención de proteína unicelular (Restrepo, 1978).
La cáscara del café se encuentra constituida por la cascarilla, la pulpa y el mucilago que envuelven a la semilla (grano), que en su conjunto están constituidos por un 42,4 % de azucares reductores totales, los que se pierden al ser eliminados durante el despulpado y que estos productos y subproductos, constituyen una fuente grave de contaminación y problemas ambientales en los países productores de café. Por ese motivo, desde mediados del siglo pasado se ha tratado de inventar métodos de utilizarlos como materia prima para producción de bebidas,
vinagre,
biogás, cafeína, pectinas, enzimas pécticas, proteína y abono
(Bresanni, 2005).
Las levaduras comúnmente más utilizadas son Saccharomyces cereviceae y Candida utilis, sin embargo la mayor experiencia en la producción de proteína unicelular se ha dado
con C. utilis conocida por la mayoría de los investigadores como “torula” y cuya composición química es aproximadamente: 9,0 % de nitrógeno, 55 % de proteína, 7 % de 3
grasas, 5 % de fibra, 8,0 % de cenizas, además contiene elevada cantidad de lisina y vitaminas del complejo B (Marchand, 1997).
Se reporta el uso dos variedades especiales de C. utilis variedad major y variedad temophila. Sin embargo las células de C. utilis variedad termopila son, por lo general son
pequeñas que dificultan su separación y el rendimiento resulta muy escaso, por lo que se utiliza la variedad major que son células más grandes que la otra cepa y mejora la productividad y el rendimiento (Frazier y Westhoff, 1991; Wainwright, 1995).
Respecto a C. utilis, desarrolla rápidamente en un medio compuesto por melaza puesto que tiene la capacidad de asimilar una amplia variedad de sustratos carbonados; sin embargo durante la producción de biomasa de C. utilis es necesario controlar cuidadosamente diversos factores como temperatura, pH, aireación, formación de espuma y en especial la concentración del tipo de sustrato que se emplea (Kirk y Othmer, 1998).
En una investigación de producción a nivel industrial de cultivo de C. utilis, empleando melaza diluida al 2 %, se han obtenido rendimientos de 45 % de levadura y 92 % de masa seca, teniendo en cuenta un rendimiento teórico de 56,7 %, comparado con un 55 % en rendimiento real que se obtuvo al trabajar con una concentración de 15 g/L de ART de melaza; razón por la cual es necesario poner especial énfasis en los efectos que tiene la concentración del sustrato ART de cáscara de café sobre los rendimientos finales, considerando a este factor un punto crítico a tener en cuenta al inicio del proceso, en especial si se conoce que la composición química de la cáscara del café no siempre es la misma por variedad u otros factores y por tanto la concentración de azúcares totales puede variar regularmente (Estévez, 1998; León, 2005). 4
En ese sentido, cuando se toma cuenta que la información
sobre la relación
rendimiento-concentración del sustrato, vital importancia, ya que desde el punto de vista técnico – económico las ofertas de instalaciones industriales a disposición se sitúa ante la alternativa de tecnologías de fermentación a altas y bajas concentraciones y además que la oferta y demanda de proteína unicelular destinada al consumo humano y animal en las últimas décadas, estuvo liderada por la levadura C. utilis tanto en Estados Unidos, La Unión Europea y Asia, es necesario realizar trabajos de investigación orientados a determinar la influencia de la concentración de los azúcares reductores totales extraídos de la “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor en la producción de proteína unicelular de Candida utilis
“torula” var. major en un biorreactor tipo tanque agitado.
5
I.
MATERIAL Y MÉTODOS
1. MATERIAL 1.1 Material biológico ·
Se ha utilizado una cepa liofilizada de Candida utilis var. major , obtenido de la Colección Española de Cultivos Tipo (C.E.C.T) 1430.
·
Azúcares reductores totales extraídos de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor , proveniente del distrito de Rioja, departamento de San Martín-Perú.
(Anexo 1 y 2).
2. MÉTODO 1.1 Reactivación de la Cepa: La cepa se reactivó siguiendo el protocolo según Bailón en Caldo Sabouraud (Manual Difco, 1984).
1.2 Tratamiento de los sustratos: 1.2.1 Tratamiento de extracción de los azúcares reductores totales de la “cáscara” de Coffea arábiga var. catimor y preparación del caldo fermentativo: La extracción de los azúcares reductores totales de la “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor se llevó a cabo utilizando la técnica de extracción
por acción físico – química con agua por ser una técnica adecuada en la obtención
de
estos
azúcares
para
el
caso de este residuo
agrícola (Bardales y Col, 2009)(Anexo 3), luego se determinó la concentración de “ART” azúcares reductores
totales
por el método de Folin-Wu 6
(Folin, O y H, Wu. 1920). Dicha concentración fue diluida con agua destilada estéril preparándose las concentraciones siguientes: 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 35 g; las mismas que constituyeron el caldo fermentativo. A este caldo fermentativo se la añadió 0,70 g de sulfato de amonio q.p (Bailón, 2001) y posteriormente se esterilizó en autoclave a 121 ºC durante 45 minutos (Anexo 4).
1.3 Preparación del inóculo: El cultivo de la cepa de Candida utilis var. major fue sembrada en el medio de mantenimiento (agar sabouraud) e incubada durante 24 horas a 30ºC (Marchand, 1997). De este cultivo se hizo un traspaso al medio de propagación compuesto por 700 mL de caldo sabouraud – oxitetraciclina (Manual Difco, 1985), el cual se incubó a 37 ºC durante 24 horas. La pureza del cultivo se verificó por observación directa al microscopio (Anexo 5). El inóculo inicial de levadura tuvo una concentración celular de 1 x 10 6 cel/mL (Gómez, 1999) (Anexo 5).
1.4 Acondicionamiento de los biorractores: Se instalaron 9 biorreactores de 1 L. de capacidad; con 16 cm de altura, 10 cm de diámetro y 10 cm de base, adaptándoseles una tapa a presión de jebe microporoso de 2 pulgadas (Anexo 6). Cada reactor fue equipado con un sistema de aireación y agitación previamente desinfectado en la cámara UV durante tres tiempos de 1 hora cada una, con un descanso de 5 minutos entre ellos (Anexo 7).
7
2.5 Proceso de producción de biomasa: Fermentación En cada biorreactor se colocó 630 mL del caldo fermentativo a las concentraciones de estudio (5, 10, 15, 20, 25, 30 y 35 g/L de ART), la fuente nitrogenada (sulfato de amonio al 1 %) y 70 mL del inóculo previamente preparado.
El proceso se llevó a cabo a un pH entre 5,0 – 5,5. El proceso de fermentación se llevó a cabo durante un periodo de 50 horas a una temperatura de 25 ºC +/- 2ºC (Anexo 8).
Además se realizó un ensayo blanco (630 mL de agua destilada estéril y 70 mL de inóculo) y un testigo (630 mL caldo sabouraud y 70 mL de inóculo). Repitiéndose
posteriormente
los
tratamientos 2 veces más
(Torres, 1995; León, 2005).
2.6 Determinación de la Influencia de la concentración de los azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga en la producción de proteína unicelular de Candida utlis var. major . 2.6.1 Determinación del peso seco de la biomasa: La producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major se llevó a cabo durante 50 horas (Bailón, 2001; León, 2005). Transcurrido dicho tiempo se tomaron 10 mL de cada biorreactor como muestra. Se colocaron en placas petri de peso conocido y llevados a estufa a 70 ºC hasta peso constante, las cuales posteriormente fueron pesadas nuevamente con la finalidad de obtener el peso seco de la biomasa (Gómez, 1999; León, 2005).
8
2.6.2 Cuantificación de los azúcares reductores totales residuales: Finalizado el proceso de fermentación, se centrifugó 10 mL de caldo fermentativo de cada biorreactor a 3 500 rpm por 20 minutos, luego en el sobrenadante se determinó la concentración residual de azúcares reductores totales mediante el método de Folin – Wu (Folin, O y H, Wu, 1920).
2.6.3 Determinación del rendimiento en base a azúcares reductores totales suministrados ( Y x/s) Se determinó según (Hebert, 1999). XF - Xo Yx/s = ------------So - S F Donde:
Xo : Biomasa inicial (g/L) XF : Biomasa final (g/L) So : Azúcares reductores totales inicial (g/L) SF : Azúcares reductores totales final (g/L)
2.6.4 Cálculo de la productividad ( P g/L.h) Se determinó según (Hebert, 1999). XF - Xo X P = ------------------ = ----t t Donde:
X : Biomasa neta producida (g/L) T : Tiempo de fermentación en horas (h) Xo : Biomasa inicial (g/L) XF : Biomasa final (g/L)
9
2.7 Análisis estadístico: Los resultados obtenidos de las variables biomasa, rendimiento y productividad fueron evaluados mediante estimación de medidas de tendencia central y dispersión; comparación de medias según el método de “t”, correlación y regresión lineal, cuadrática, logarítmica y exponencial (Freese, 1988).
10
III. RESULTADOS
Los resultados del trabajo de investigación respecto a la influencia de la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor en la producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major , se muestra en las siguientes tablas y figuras.
En la tabla 1 se indica la relación de las variables (correlación y regresión) de la concentración de azúcares reductores totales de la “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor con la biomasa, el rendimiento y la productividad de Candida utilis var. major, lo cual demuestra la dependencia de las variables biomasa y productividad y la no dependencia del rendimiento con respecto a la concentración de azúcares reductores totales.
La Figura 1 muestra la relación entre la concentración de azúcares reductores totales suministrados de la “cáscara” de Coffea arabiga y la biomasa neta producida de Candida utilis var. major . Observándose que existe dependencia o regresión lineal,
cuadrática, logarítmica y exponencial en dichas variables. La biomasa aumenta progresivamente desde 0,20 g/L hasta 14,00g/L (Anexo 9 y 12) tal como se aumenta la concentración de azúcares reductores totales extraídos de la “cáscara” de Coffea arabiga var . catimor.
La Figura 2 muestra la relación entre la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara ” de Coffea arabiga var. catimor suministrados y el rendimiento de
11
C. utilis var. major , notándose claramente que no existe dependencia o regresión lineal,
cuadrática, logarítmica ni exponencial de las variables. El rendimiento es máximo a la concentración de 20 g/L de ART (55,83%) (Anexo 10 y 12).
La figura 3 muestra la relación entre la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y la productividad de C. utilis var. major , observándose que existe dependencia o regresión lineal, cuadrática, logarítmica y
exponencial entre las variables. La productividad aumenta progresivamente desde 0,02000 hasta 0,28000 g/L.h (Anexo 11 y 12), tal como se incremente la concentración de azúcares reductores totales de “cascara” de Coffea arábiga var . catimor y la biomasa neta producida respectivamente.
La figura 4 muestra la comparación del valor del rendimiento teórico, valor del testigo y experimental de C. utilis var. major a diferentes concentraciones de azúcares reductores totales suministrados de la “cascara” de Coffea arabiga var. catimor, obteniéndose el valor de rendimiento más alto a la concentración de 20 g/L. ART cercano al testigo y al valor teórico; y el valor más lejano 5 g/L.
12
Tabla 1: Relación de las variables (correlación y regresión) de la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y la biomasa neta producida, el rendimiento y la productividad de Candida utilis var. major .
VARIABLES
CONCENTRACIÓN
*
BIOMASA
RENDIMIENTO
PRODUCTIVIDAD
r
0,996
0,632
0,996
a
1,057
2,343
0,021
b
-3,964
20,802
-0,079
g.l
4
4
4
α/2
1%
1%
1%
tc
15,708*
1,554
15,708*
tt
2,7765
2,7765
2,7765
Fc
314,734**
1,856
314,734**
Ft
5,7861
5,7861
5,7861
Diferencias altamente significativas (1 % error).
** Diferencias muy altamente significativas (1 % error).
13
X (g/L)
X (g/L)
So (g/L)
Figura 1: Relación entre la concentración de azúcares reductores totales (ART) suministrados “So” (g/L) de “cáscara de Coffea arabiga var. catimor y la biomasa neta producida X (g/L) de Candida utilis var. major . (Programa Estadístico SPSS). 14
Y (%)
So (g/L)
Figura 2: Relación entre la concentración de azúcares reductores totales (ART) suministrados “So” (g/L) de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y el rendimiento “Y” (%) de Candida utilis var. major . (Programa Estadístico SPSS). 15
P (g/L.h)
So (g/L)
Figura 3: Relación entre la concentración de azúcares reductores totales (ART) suministrados “So” (g/L) de “cáscara de Coffea arabiga var. catimor y la productividad “P (g/L.h) de Candida utilis var. major . (Programa Estadístico SPSS). 16
RENDIMIENTO TEÓRICO (56,7 %)
60
) % ( Y
55.96
55.19 53.54 50.34
50
48.14
43.42
42.94
30
35
40
30
20.35 20
10
0 T
B
5
10
15
20
25
So
Figura 4: Comparación del rendimiento “Y” (%) Teórico y Experimental de Candida utilis var. major a diferentes concentraciones de azúcares reductores
totales (ART) suministrados “S” (g/L) de “cáscara” de Coffea arabiga var.catimor (Programa Estadístico SPSS). 17
IV.
DISCUSIÓN
Para la producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major , es indispensable la adición de fuentes nitrogenadas como fuente de material de construcción celular, y fuentes carbonadas como material energético en el crecimiento microbiano. En ese sentido en esta investigación se ha utilizado sulfato de amonio 1 g/L (Bailón, 2001; León, 2005), de no ser así, por falta de nitrógeno el crecimiento y la producción de Candida utilis var. major es baja (Israelidis y Evangelopus, 1980); de igual forma en el
cultivo y producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major constituye un factor influente
la
concentración
de
azúcares
presentes
en el medio de
fermentación (Estévez, 1998; León, 2005).
Según la Tabla 1 se observa la relación de variables (correlación y regresión) las que demuestran dependencia de la biomasa neta producida y la productividad y la no dependencia respecto al rendimiento de Candida utilis var. major , respecto a la concentración de los azúcares reductores totales de la “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor . Investigaciones anteriores demuestran que la producción de proteína unicelular de Candida utilis var, major está en influenciada por factores como la composición del medio
de
cultivo,
condiciones
ambientales
y
tipo
de
microorganismo (Estévez,
1998; León, 2005); en esta investigación los parámetros ambientales y el microorganismo ha sido mantenidos constantes; en ese sentido la producción de proteína unicelular de C. utilis ha dependido exclusivamente de la composición del medio de cultivo,
específicamente de la concentración de los azúcares reductores totales extraídos de la “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor . 18
Respecto a biomasa neta y productividad de C. utilis var. major , existe diferencias altamente significativas ( 1 % error), frente a diferentes concentraciones de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor , como se observa en las figuras 1 y 3 y anexos 9 y 11, según la regresión y la comparación de medias ( 1 % error) por el método “t”, sin embargo, el rendimiento no muestra diferencias tal
significativas,
como se aprecia en la figura 2 y anexo 10 (Freese, 1998, León, 2005). De
acuerdo a esto la biomasa neta producida de C. utilis var. major , se incrementa progresivamente conforme se incrementa la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor ; de igual forma ocurre con la productividad, debido al control de ciertos factores como la eficiente homogenización, suministro de oxígeno y disponibilidad del sustrato en el medio fermentativo (Estévez, 1998; León, 2005).
El estudio demuestra que el rendimiento aumenta hasta una concentración de 20 g/L de azúcares reductores totales, decayendo en forma progresiva conforme sigue aumentado la concentración del sustrato, difiriendo este resultado de lo obtenido por León (2005), quien encontró un rendimiento máximo a 15 g/L, utilizando azúcares reductores totales de melaza de caña de azúcar. Dicho comportamiento tiene que ver con el metabolismo de los azúcares a nivel endocelular, donde los sitios activos de las enzimas transforman a estas moléculas en otros metabolitos energéticos, para el desarrollo y crecimiento celular, indicando que 20 g/L es una concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor , en la que se alcanza una mejor producción, rendimiento y productividad de C. utilis var. major (Hebert, 1999, León 2005).
19
Existen varios factores que explican el comportamiento observado, debido a que la efectividad y eficacia del metabolismo del cultivo está en relación a ciertas condiciones físico-químicas a la cual fue sometida esta población de C. utilis var. major , por ejemplo: Presencia de ciertas sustancias coloidales, taninos, alcaloides, etc, propias de la “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor , capaces de incrementar el metabolismo celular; efectos de metabolitos secundarios sobre el crecimiento de la levaduras; sin embargo, la densidad poblacional influye sobre el rendimiento de las levaduras sobre el consumo del sustrato, así como inhibición de la actividad enzimática por saturación y sobresaturación sustrato
u
otros
de
parámetros; existencia de ciertos gradientes de concentración dentro
del cultivo a causa de mezclado y aireación eficiente; además la presencia de otros nutrientes no azúcares en el sustrato (Leandro, 1981; Quintero, 1981; Torres, 1995; Estévez, 1998 y León, 2005).
Estudios realizados a nivel industrial, en el cultivo de C. utilis var. major , emplearon melaza de caña de azúcar diluida al 2 % (20 g/L), obteniendo un rendimiento de 45 % (Estévez, 1998), el mismo que se encuentra muy por debajo del rendimiento teórico 56,7 %; en ese sentido comparando los resultados obtenidos en la presente investigación, con los valores obtenidos por Estévez (1998) y León (2005), se observa que el rendimiento de C. utilis var. major , obtenido (55,19 %) es muy superior a 45 % y cercano al encontrado
por León (2005) de (55 %) y mucho más cercano al valor teórico (56,7 %).
En ese sentido la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor , influenció significativamente en forma positiva en la producción de C. utilis var. major , siendo 20 g/L la concentración máxima para lograr el mayor
rendimiento (55,19 %), observándose así mismo, que a mayor concentración de azúcares 20
reductores totales el rendimiento decae en 12,25 puntos, siendo un índice negativo económico que produciría si se trabajase a altas concentraciones de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor especialmente a nivel piloto e industrial(Estévez, 1998; León, 2005).
V. CONCLUSIÓN 21
De acuerdo a los resultados obtenidos de la influencia de la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor en la producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major a condiciones de temperatura 25 +/-3 ºC; pH de 5,0 – 5,5 y a un flujo de aire de 20 mL/s se concluye:
El incremento de la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor influye significativamente en el aumento de la producción de
proteína unicelular en forma directamente proporcional respecto a la biomasa neta y la productividad de C. utilis var. major .
El rendimiento de C. utilis var. major en la producción de proteína celular, se incrementa conforme se aumenta la concentración de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor hasta un máximo 20 g/L, con el que se alcanza el rendimiento máximo (55,19 %) de C. utilis var. major posterior a este el rendimiento decae significativamente.
VI.
RECOMENDACIONES 22
Se recomienda por ser de interés realizar trabajos similares a concentraciones de azúcares reductores totales de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor entre 15 y 20 g/L para determinar el rendimiento más cercano al valor teórico (56,7 %).
Así mismo desarrollar trabajos a escala piloto, tomando como base el valor máximo de la concentración de azúcares reductores totales y su máximo rendimiento con el fin de establecer indicadores económicos del bioproceso para su escalamiento industrial.
Por último, incentivar el uso de otros residuos agrícolas, previa evaluación de la concentración de los azúcares reductores totales, para ser utilizados como sustrato en la producción de proteína unicelular.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
23
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25
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Spray
torula
yeast.
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Wainwright, M. 1995. Introducción a la biotecnología de los hongos. 2da ed. Edit. Acriba. España.
27
ANEXOS
Anexo 1 en el
:
“Cáscara” de Coffea arabiga var. catimor , observe el momento
despulpado (Rioja – San Martín). Foto A : Momento del recojo del fruto de Coffea arabiga var. catimor para su despulpado. Foto B : Cáscara de Coffea arabiga var. catimor, después del despulpado.
FOTO A
FOTO B
Anexo 2 :
Composición físico –química de la “cascara” de Coffea arabiga var. catimor .
COMPOSICIÓN QUÍMICA (%) DE LA CASCARA Y MUCÍLAGO DEL FRUTO DEL CAFÉ. Sustancias pécticas totales
35,8
Azúcares totales medios
45,8
Azúcares reductores
30,0
Azúcares no reductores
20,0
Celulosa = cenizas
17,0
FRACCIONAMIENTO DE LOS GRANOS DE CAFÉ EN SECO.
100 gramos de fruto de cáfé var. catimor 29% pulpa (cáscara) seca de café 12% cascarilla de pergamino Fruto de café 4% mucílago 55% granos de café verde Nota: Al tostarlo puede perder hasta un 16% de peso en humedad
Fuente: Instituto de Nutrición de Centroamérica y Panamá (INCAP) 1978. Pulpa de café var. catimor, composición, tecnología y utilización. Adaptado por Jairo, Restrepo Rivera.
Anexo 3 :
Método de Extracción de ART de la “cascara” de Coffea arabiga var. catimor por método físico –químico con
agua (Bardales y Col, 2009).
Foto A: Método de extracción por acción físico – química con agua. Foto B: Filtrado de la extracción de los ART.
FOTO A
FOTO B
Anexo 4 : Preparación del caldo fermentativo a base de azúcares reductores totales de “cascara” de Coffea arabiga var. catimor . Foto A : Autoclavado por espacio de 15 minutos a 121 ºC y a 15 libras de presión. Foto B : Caldo fermentativo preparado, esterilizado y en concentraciones de 5, 10 , 15, 20, 25, 30 y 35 g/L de ART de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor.
FOTO A
FOTO B
Anexo 5 :
Observación microscópica y macroscópica de Candida utilis var. major C.E.C.T. 1430. Foto A : Se observa células de C. utilis de color amarillo verdoso. Foto B : Se observa una masa blanca amarillenta brillosa de las colonias de C. utilis var. major en agar sabouraud.
FOTO A
FOTO B
Anexo 6 :
Diseño del biorreactor tipo tanque agitado
Anexo 7 :
Esterilización del sistema de fermentación en cámara UV. Se observa el fluorescente encendido en la parte superior de la cámara y todos los accesorios del sistema de fermentación en la parte inferior de la cámara esterilizadora.
Anexo 8 :
Producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major . Foto A : Se observa los biorreactores con sus respectivos sistemas de agitación y aireación. Foto B : Vista general del sistema trabajando, nótese la presencia de una fuente de poder y bombas de aireación.
FOTO A
FOTO B
Anexo 9 :
Valores originales de biomasa neta producida “X” (g/L) de Candida utilis var. major en relación a la concentración de azúcares reductores totales (ART) suministrados “So” (g/L) de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y sus estimadores. X T
B
5
10
So 15
1
12,08
0,20
1,02
5,00
7,96
10,91
12,00
13,08
13,30
2
12,00
0,22
1,00
4,93
8,04
11,00
11,00
12,75
14,70
3
11,92
0,18
0,98
5,07
8,00
11,09
11,25
12,92
14,,00
∑Xi
36,00
0,60
3,00
15,00
24,00
33,00
34,25
38,75
42,00
X
12,00
0,20
1,00
5,00
8,00
11,00
12,00
13,00
14,00
E.S
0,04619
0,01155
0,01155
0,04041
0,02309
0,05196
0,43301
0,04619
0,40415
S
0,75000
0,02000
0,02000
0,07000
0,04000
0,09000
0,75000
0,08000
0,70000
S2
0,563
0,00000
0,00000
0,005
0,002
0,008
0,563
0,006
0,490
ni
Diagrama I : Comparación de medias método “t”
20
25
30
35
Concentración*: T B 5 10 15 20 25 30 35
*Leyenda: Diferencias altamente significativas (1 % error).
Anexo 10 :
Valores originales de rendimiento “Y” (%) de Candida utilis var. major en relación a la concentración de azúcares reductores totales (ART) suministrados “So” (g/L) de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y sus estimadores. Y T
B
5
10
So 15
1
56,07
0,00
20,35
50,70
53,21
54,55
48,14
42,97
43,73
2
55,85
0,00
20,15
50,34
53,54
55,83
48,02
43,42
42,15
3
55,96
0,00
20,55
49,48
53,87
55,19
48,26
43,87
42,94
∑Xi
167,88
0,00
61,05
150,52
160,62
165,57
144,42
130,26
128,82
X
55,96
0,00
20,35
50,34
53,54
55,19
48,14
43,42
42,94
E.S
0,29633
0,00
0,11547
0,36191
0,19053
0,36950
0,06928
0,41265
0,45611
S
0 51326
0 00
0 20000
0 62684
0 33000
0 64000
0 12000
0 71473
0 79000
ni
20
25
30
35
Anexo 10 :
Valores originales de rendimiento “Y” (%) de Candida utilis var. major en relación a la concentración de azúcares reductores totales (ART) suministrados “So” (g/L) de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y sus estimadores. Y T
B
5
10
So 15
1
56,07
0,00
20,35
50,70
53,21
54,55
48,14
42,97
43,73
2
55,85
0,00
20,15
50,34
53,54
55,83
48,02
43,42
42,15
3
55,96
0,00
20,55
49,48
53,87
55,19
48,26
43,87
42,94
∑Xi
167,88
0,00
61,05
150,52
160,62
165,57
144,42
130,26
128,82
X
55,96
0,00
20,35
50,34
53,54
55,19
48,14
43,42
42,94
E.S
0,29633
0,00
0,11547
0,36191
0,19053
0,36950
0,06928
0,41265
0,45611
S
0,51326
0,00
0,20000
0,62684
0,33000
0,64000
0,12000
0,71473
0,79000
S2
0,263
0,00
0,040
0,393
0,109
0,410
0,014
0,511
0,624
ni
Diagrama II :
Comparación de medias método “t”
20
25
30
35
Concentración*: T B 5 10 15 20 25 30 35
*Leyenda: Diferencias altamente significativas (1 % error).
Anexo 11 :
Valores originales de productividad del sistema “P” (g/L.h) de Candida utilis var. major en relación a la concentración de azúcares reductores totales (ART) suministrados “So” (g/L) de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y sus estimadores. P T
B
5
10
So 15
20
25
30
35
1
0,24160
0,0000
0,02040
0,10000
0,15920
0,21820
0,24000
0,26160
0,26600
2
0,24000
0,00000
0,02000
0,09860
0,16080
0,22000
0,25500
0,26000
0,29400
3
0,23840
0,00000
0,01960
0,10140
0,16000
0,22180
0,22500
0,25840
0,28000
∑Xi
0,72000
0,00000
0,06000
0,30000
0,48000
0,66000
0,72000
0,78000
0,84000
X
0,24000
0,00000
0,02000
0,10000
0,16000
0,22000
0,24000
0,26000
0,28000
ni
E.S 0,00092376 0,00000000 0,00023094 0,00080829 0,00046188 0,00103923 0,00866025 0,00092376 0,00808290 S
0,00160000 0,00000000 0,00040000 0,00140000 0,00080000 0,00180000 0,01500000 0,00160000 0,01400000
Anexo 11 :
Valores originales de productividad del sistema “P” (g/L.h) de Candida utilis var. major en relación a la concentración de azúcares reductores totales (ART) suministrados “So” (g/L) de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor y sus estimadores. P T
B
5
10
So 15
1
0,24160
0,0000
0,02040
0,10000
0,15920
0,21820
0,24000
0,26160
0,26600
2
0,24000
0,00000
0,02000
0,09860
0,16080
0,22000
0,25500
0,26000
0,29400
3
0,23840
0,00000
0,01960
0,10140
0,16000
0,22180
0,22500
0,25840
0,28000
∑Xi
0,72000
0,00000
0,06000
0,30000
0,48000
0,66000
0,72000
0,78000
0,84000
X
0,24000
0,00000
0,02000
0,10000
0,16000
0,22000
0,24000
0,26000
0,28000
ni
20
25
30
35
E.S 0,00092376 0,00000000 0,00023094 0,00080829 0,00046188 0,00103923 0,00866025 0,00092376 0,00808290 S
0,00160000 0,00000000 0,00040000 0,00140000 0,00080000 0,00180000 0,01500000 0,00160000 0,01400000
S2
0,0000000
Diagrama III :
Anexo 12 :
0,0000000
0,0000000 0,0000000 0,0000000 0,0000000
0,0000000
0,0000000 0,0000000
Comparación de medias método “t” Concentración*: T B 5 10 15 20 25 30 35 *Leyenda: Diferencias altamente significativas (1 % error).
Valores promedio originales y estimados de biomasa neta producida, rendimiento y productividad de Candida utillis var. major a diferentes concentraciones de azúcares reductores totales (ART) suministrados de de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor.
So (g/L) 40,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
BIOMASA “X” (g/L)
RENDIMIENTO “Y” (%)
PRODUCTIVIDAD “P” (g/L.h)
Observadas
Estimadas
Observadas
Estimadas
Observadas
Estimadas
12 02 1 5 8 11 12 13 14
13,187 -1,0213 2,512 5,0687 8,312 10,387 11,912 12,887 13,312
55,96 0 20,35 50,34 53,54 55,19 48,14 43,42 42,94
-935,731 7,069 8,219 -24,631 -94,481 -192,331 -327,181 -496,031 -698,881
0,24 0,00 0,02 0,10 0,16 0,22 0,24 0,26 0,28
0,613 -0,027 0,053 0,133 0,213 0,293 0,373 0,453 0,533
Anexo 12 :
Valores promedio originales y estimados de biomasa neta producida, rendimiento y productividad de Candida utillis var. major a diferentes concentraciones de azúcares reductores totales (ART) suministrados de de “cáscara” de Coffea arabiga var. catimor.
So (g/L) 40,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
BIOMASA “X” (g/L)
RENDIMIENTO “Y” (%)
PRODUCTIVIDAD “P” (g/L.h)
Observadas
Estimadas
Observadas
Estimadas
Observadas
Estimadas
12 02 1 5 8 11 12 13 14
13,187 -1,0213 2,512 5,0687 8,312 10,387 11,912 12,887 13,312
55,96 0 20,35 50,34 53,54 55,19 48,14 43,42 42,94
-935,731 7,069 8,219 -24,631 -94,481 -192,331 -327,181 -496,031 -698,881
0,24 0,00 0,02 0,10 0,16 0,22 0,24 0,26 0,28
0,613 -0,027 0,053 0,133 0,213 0,293 0,373 0,453 0,533
Leyenda: Blanco 0,0 g/L ART So = Concentración de Azúcares reductores Totales “ART” (g/L). X = Biomasa Neta Producida (g/L). Y = Rendimiento en base a Azúcares Reductores Suministrados. P = Productividad del Sistema (g/L.h).
