Laboratorio de Bioquímica. Grupo H2
INFORME PRÁCTICA 5: DETERMINACIÓN DE GLUCOSA Y COLESTEROL EN SANGRE Silvia Juliana Becerra Anaya. Código: 2080117 Andrea Katherine González. Código: 2080139 Universidad Industrial de Santander Facultad de Ciencias Básicas Escuela de Química Recibido: Luis Oveimar Barbosa Jaimes. Aceptado: Octubre 3, 2012 RESUMEN En la práctica se llevó a cabo la determinación de glucosa y colesterol en una muestra de sangre. Para cual, se utilizaron los reactivos de Biosystems para uso in vitro en el laboratorio clínico. Los compuestos de interés se cuantificaron por espectrofotometría a 505 nm.
INTRODUCCIÓN: La glucosa es la principal fuente de energía para el metabolismo celular, esta se almacena en el hígado el cual tiene un papel importante en el mantenimiento de la glucosa en sangre, su determinación es útil para el diagnóstico de numerosas enfermedades metabólicas principalmente la diabetes mellitus. Al igual que la glucosa, es necesario la determinación del colesterol en sangre para la prevención cardiovascular ya que se ha visto que este contribuye a la formación de ateromas, lo cual es debido a que es una sustancia cerosa que se puede encontrar en todo nuestro cuerpo (tejidos corporales y plasma sanguíneo). [1] En la presente práctica se determina la concentración de glucosa y colesterol en sangre mediante complejos coloreados que se cuantifican por espectrofotometría a una longitud de onda de específica. OBJETIVOS GENERALES: Determinación de glucosa y colesterol en sangre mediante la formación de complejos coloreados para su posterior cuantificación por espectrofotometría a una longitud de onda especifica.
Analizar los resultados obtenidos de las concentraciones de glucosa y colesterol, por comparación con los niveles promedio de estos. MARCO TEÓRICO La glucosa es un azúcar que es utilizada como fuente de energía para el organismo, esta se incrementa en la sangre al ingerir alimentos diferentes al agua, lo que se consume desaparece de la sangre mediante el empleo de una hormona reguladora producida por el páncreas conocida como insulina, cuando ocurre lo contrario se secreta otra hormona llamada glucagón que permite mantener los niveles de glucosa en sangre. El análisis de la glucosa permite medir la concentración de esta presente en la sangre para la prevención o diagnóstico de una diabetes mellitus o sacarina, esta enfermedad se caracteriza por presentar valores superiores a 140 mg/dL, entre 70 y 110 mg/dL se consideran valores normales, pero inferiores a 60 mg/dL desencadena una hipoglicemia. Su determinación se realiza después de la oxidación enzimática en presencia de glucosa oxidasa. El peróxido de hidrogeno formado reacciona bajo la catálisis de peroxidasa con fenol 1
Determinación de glucosa y colesterol en sangre
y 4-aminofenazona formando un complejo rojovioleta usando la quinoneimina como indicador, el cual es posible cuantificarlo por espectrofotometría, a continuación se muestran las reacciones sucedidas:
1. Determinación de Glucosa Las soluciones mostradas en la Tabla 1 se colocaron en tubos de ensayo, estos se incubaron a 37 °C durante 5 minutos. Finalmente, se leyó su absorbancia a =505 nm.
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La reacción 1 se realiza en presencia de glucosa oxidasa y la 2 en peroxidasa. El colesterol es una sustancia que se encuentra en todos los tejidos normalmente en la sangre, el organismo necesita colesterol para la síntesis de hormonas y sales biliares que desempeñan una fuente importante en la absorción de las grasas procedentes de los alimentos, si la cantidad de este es grande puede contribuye a la formación de ateromas. Este es posible medirlo mediante un examen de triglicéridos en sangre, el cual se determina después de la hidrólisis enzimática y la oxidación. El indicador es la quinoneimina formada por el peróxido de hidrogeno y 4-aminoantipirina en presencia de fenol y peroxidasa, el principio de la reacción se encuentra a continuación. [2] ( ) ( ) ( )
La reacción 3 se realiza en presencia de lipasa, 4 en colesterol oxidasa (CHO) y la 5 en peroxidasa (POD). PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Se extrajo el suero de una muestra de sangre para realizar las respectivas determinaciones.
Tabla 1. Parte experimental para la determinación de glucosa. Blanco Patrón Muestra Patrón (S1) 10 L Muestra 10 L 1 mL 1 mL 1 mL Reactivo A1 A1. Reactivo: Fosfatos 100 mmol/L, fenol 5 mmol/L, glucosa oxidasa > 10 U/mL, peroxidasa>1 U/mL, 4-aminoantipirina 0,4 mmol/L, pH 7,5 S1. Patrón de Glucosa/Urea/Creatinina. Glucosa 100 mg/dL (5,55 mmol/L), urea 50 mg/dL, creatinina 2 mg/dL. Patrón primario acuoso. [3] 2. Determinación de Colesterol Las soluciones de Tabla 2 se colocaron en tubos de ensayo, estos se incubaron a 37 °C durante 15 minutos. Posteriormente, se leyó su absorbancia a =505 nm. Tabla 2. Parte experimental para la determinación de colesterol. Blanco Patrón Muestra Patrón (S2) 10 L Muestra 10 L 1 mL 1 mL 1 mL Reactivo A2 A2. Reactivo. Pipes 35 mmol/L, colato sódico 0,5 mmol/L, fenol 28 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2 U/mL, colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L, pH 7,0. S2. Patrón de Colesterol. Colesterol 200 mg/dL (5,18 mmol/L). Patrón primario acuoso. [4] RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 3. Datos experimentales Glucosa 2
Determinación de glucosa y colesterol en sangre
Solución Reactivo A1 + Patrón S1 Reactivo A1 + Muestra
Absorbancia 0,325 0,272
Pese a los valores reportados en la tabla anterior se procedió a calcular la concentración de colesterol en la muestra.
Teniendo en cuenta los valores reportados en la tabla anterior, se calcula la concentración de glucosa en la muestra a partir de la siguiente ecuación:
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La concentración obtenida se encuentra dentro del rango normal (70-110 mg/ dL) de glucosa, lo cual quiere decir que el paciente no presenta síntomas de hiperglicemia ni hipoglicemia, a pesar de que se realizó un análisis al azar en donde se mide la concentración de glucosa en una muestra de sangre en cualquier horario habitual, otros análisis que se pueden determinar para analizar los niveles de glucosa en sangre corresponden a: - Análisis de glucosa en ayunas: Este mide la glucosa en una muestra de sangre obtenida cuando la persona no ha comido ni tomado nada (excepto agua) por al menos 8 horas. -Análisis de tolerancia a la glucosa: Este comienza con un análisis en ayunas de la glucosa. Luego el paciente toma una bebida dulce con una cantidad medida de glucosa. Los niveles de glucosa son medidos en varias muestras de sangre obtenidas a intervalos específicos de tiempo. [5] Es importante destacar que para la determinación de glucosa la muestra de sangre tomada del paciente se realizó cuando este se encontraba sentado, sin fumar ni ingerir alcohol durante las anteriores 12 horas, además de resaltarse que este análisis a diferencia de otros se puede medir en cualquier momento del día. Tabla 4. Datos experimentales Colesterol Solución Absorbancia 0,024 Reactivo A2 + Patrón S2 1 Reactivo A2 + Muestra
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La concentración de colesterol obtenida no es un valor válido, por tanto, se concluye que la determinación no se pudo llevar a cabo. Esto se observa en las absorbancias reportadas para el patrón y la muestra; ya que para el primero se obtuvo un valor prácticamente despreciable, debido posiblemente a que durante el procedimiento se utilizaron solamente 10 L, cantidad que no fue suficiente para ser detectada. Cabe mencionar que la muestra de sangre fue tomada luego de que la persona ingiriera alimentos, lo que pudo causar un alto contenido lipídico en la misma; interfiriendo en la determinación de colesterol. El perfil lipídico lo constituye la cuantificación analítica de una serie de lípidos que son transportados en la sangre por los diferentes tipos de lipoproteínas plasmáticas. La determinación de estos parámetros es un procedimiento analítico básico para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades metabólicas, primarias o secundarias. Entre estos parámetros analíticos que se pueden determinar están: el colesterol total, el colesterol transportado por las LDL, el colesterol transportado por las HDL, los triglicéridos totales, ciertas apoproteínas particulares etc. Condiciones para una determinación eficaz de colesterol en sangre: -El paciente debe encontrarse en un estado fisiológico regular (sin ejercicio vigoroso) y bajo su dieta ordinaria del día anterior a la prueba. -La muestra debe recolectarse en ayuno total excepto agua, durante un lapso de 12 a 14 horas antes de la prueba. 3
Determinación de glucosa y colesterol en sangre
-La muestra debe recolectarse en tubo recolector al vacío de tapón rojo el cual no contiene anticoagulante. -La muestra debe centrifugarse a 3500 rpm para separar el suero, si este se obtiene turbio, la muestra es inaceptable. [6] Debido a que no se tuvieron en cuenta varias de las condiciones mencionadas anteriormente, no se pudo determinar de manera efectiva la concentración de colesterol en la muestra de sangre. CONCLUSIONES El colesterol es una sustancia lipídica presente en todas las células del organismo. Puede ser cuantificado por métodos espectrofotométricos, ya que según reacciones acopladas, forma un complejo coloreado, el cual es detectado a una longitud de onda específica. Para la determinación de colesterol total se utilizan reactivos comerciales que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificación de todas las formas de colesterol presentes en el suero. La glucosa es un azúcar que es utilizada como fuente de energía para el organismo, está puede ser cuantificada mediante la formación de complejos coloreados por métodos espectrofotométricos a una longitud de onda determinada. El análisis de glucosa en sangre es posible determinarlo en cualquier horario habitual como no sucede con el colesterol, debido a las posibles interferencias del material lipídico generado por ingerir alimentos en los momentos previos al análisis.
http://books.google.com.co/books?id=p3DCb9lTL x8C&pg=PA1129&lpg=PA1129&dq=glucosa+y+ colesterol+bioquimica&source=bl&ots=Y_ZNSW MjTQ&sig=jqN_12yt3uz2zqcA5hQfYHqX1UM& hl=es&sa=X&ei=E2xsUJaoFrOH0QGVk4HIAg& ved=0CDkQ6AEwAg . [2]BRICEÑO VERONICA; OGOÑO CRISTIAN; CHUQUIMARCA LENIN. Escuela de Bioquímica y Farmacia, Laboratorio de Bioquímica Clínica. Ecuador. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/45351469/bioquimica . [3] GLUCOSA. GLUCOSA OXIDASA/ PEROXIDASA. BioSystems S.A. Costa Brava 30, Barcelona (Spain). Disponible en: http://www.biolinker.com.ar/productos/PDF_BIO/ 11538%20Glucosa.pdf .
[4] COLESTEROL. COLESTEROL OXIDASA/ PEROXIDASA. BioSystems, S.A. Costa Brava 30, Barcelona (Spain). Disponible en: http://www.biolinker.com.ar/productos/PDF_BIO/ 11506-11539%20Colesterol.pdf . [5] ÁVILA LUIS. Grupo de Diabetes de la Sociedad Andaluza de Medicina Familiar y Comunitaria.2010. Disponible en: http://www.grupodiabetessamfyc.cica.es/index.php /guia-clinica/guia-clinica/diagnostico.html . [6] MORÁN, V. Obtención de muestras sanguíneas de Calidad analítica; 1ª ed; ed. Médica Panamericana S.A. de C.V; México D.F. 2001.pp 65.
BIBLIOGRAFÍA [1] THOMAS M. DEVLIN. Bioquímica. Cuarta edición; ed. Reverté S. A., España.2004. pp: 11281132.Disponible en:
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