DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL
INTRODUCCIÓN Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energía más rápidamente debido a la presencia de catalizadores biológicos llamados enzimas. Como sucede con los catalizadores inorgánicos, las enzimas modifican la velocidad de una reacción sin alterar el equilibrio final y solo se requieren pequeñas cantidades para efectuar la concentración de un gran número de moléculas de sustrato. El alfa-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilasa y la amilo pectina, ambos polisacáridos de glucosa. La glucosa. La amilasa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces aC1-C4, mientras que la amilo pectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en amilo-pectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos. como productos. Si bien es cierto existen evidencias de que la enzima poli-ADP ribosa polimerasa-1 (PARP) Desempeña un papel muy importante en la modulación de la expresión génica durante el desarrollo y en respuesta a señales celulares específicas, ejerciendo su acción a diferentes niveles. PARP-1 pertenece a una familia de enzimas (PARP) que usando NAD+ como sustrato, sintetizan y transfieren transfiere n homopolímeros homopolímeros de ADH-ribosa en residuos de ácido glutámico en proteínas aceptoras principalmente involucradas en el experimento a realizar como la actividad enzimática. Para poder mostrar la actividad enzimática enzimátic a se debe tener presente fundamentalmente que la acción catalítica de las enzimas es de carácter específico; o sea, cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama SUSTRATO, habría entonces tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes existen en un organismo vivo.
I.
OBJETIVOS
Determinar la actividad específica el alfa-amilasa vegetal.
Determinar la actividad enzimática de la amilasa extraída de la cebada germinada, utilizando almidón residual.
II.
MARCO TEÓRICO ¿Qué es una enzima? Las enzimas son proteínas que ayudan a que las reacciones químicas ocurran con mayor rapidez. Sin enzimas nuestros cuerpos se detendrían en seco. ¿Qué es el sustrato? El sustrato es cualquier sustancia orgánica o inorgánica sobre las que actúan las enzimas produciendo su modificación en productos finales de la reacción. Cada enzima actúa sobre un sustrato en particular, ya que una de las características de las enzimas es su especificidad de sustrato.
La Actividad De Cualquier Sistema Enzimático Puede Ser Demostrada De Dos Maneras: 1. Verificado el sustrato no transformado (s u s t r a t o r e s i d u a l ) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones de PH y temperatura debidamente adecuada para poder llevarse a cabo las reacciones. 2. Verificando los productos liberados después de un tiempo de incubación que este en óptimas condiciones específicas de tanto de pH como de la temperatura para que los procesos se lleven con mayor eficacia y poder obtener sustancias a partir de las reacciones. Factores Que Afectan Las Reacciones Enzimáticas Fuerza osmótica. La mayoría de las enzimas no pueden tolerar concentraciones de sal extremadamente altas. Los iones interfieren con los débiles enlaces iónicos de las proteínas. Las enzimas típicas son activas en concentraciones salinas de 1 a 500 mM. Existen excepciones como las enzimas de las algas y bacterias halófilas.
Temperatura. Todas las enzimas trabajan en un rango de temperaturas específicas del organismo al que pertenecen. Los aumentos de temperatura generalmente provocan un incremento de la velocidad de reacción. Esto se debe a alteraciones de la estructura de la proteína debidas a la interrupción de uniones iónicas que resultan en la estabilización de la estructura tridimensional de la enzima. pH. La mayoría de las enzimas son sensibles al pH y tiene un rango específico en el que se detecta actividad; todas tienen un pH óptimo. El pH puede detener la actividad enzimática al provocar la desnaturalización de la estructura proteica rompiendo enlaces iónicos y puentes de hidrógeno. La mayoría de las enzimas funcionan entre un pH 6 y 8; sin embargo, la pepsina estomacal tiene un pH óptimo de 2 y la tripsina de 8. Saturación del sustrato. Aumentando la concentración de sustrato aumenta la velocidad de la reacción o actividad enzimática. Sin embargo, el límite de saturación limita la velocidad. Una enzima está saturada cuando los sitios activos de todas las moléculas están ocupados la mayoría del tiempo.
III.
MATERIALES materiales
IV.
muestras y reactivos
Tubos de ensayo Gradilla Embudos Vasos precipitados Pipetas 1,5,10 ml Pro-pipetas Gasa para filtrar Mortero
Germinados : cebada Solución de almidón al 1% Ácido clorhídrico 0.5n Lugol Reactivo de Biuret Solución de buffer Cloruro de calcio (0.1gr/1l)
equipos Estufa Espectrofotómetro
PROCEDIMIENTOS a. Extracción de la amilasa:
Germinar 50 semillas de cebada por 3 días. Triturar las semillas adicionando 10 ml de solución de buffer+ Cloruro de calcio (0.1gr/1m). Filtrar en gasa. Llevar a calentar por 5 minutos, con la finalidad de gelificarlo.
b. Determinación de actividad enzimática:
Para este proceso, armamos el siguiente sistema de cuatro tubos:
TUBOS (ml)
ALMID N INICIAL
ALMID N RESIDUAL
I
II
III
IV
SUSTRATO (ALMIDÓN) incubar: 30°c x 5 min EXTRACTO ENZIMA Incubar: 30°c x15 min ÁCIDO CLORHÍDRICO 0.5N Reposara T amb. x 5 min AGUA DESTILADA
1.0
1.0
1.0
1.0
---
0.1
0.2
0.3
1.0
1.0
1.0
1.0
9.9
9.8
9.7
9.6
LUGOL
0.5
0.5
0.5
0.5
Mesclar y después de 5 min medir la absorbancia (a 540nm) de los cuatro tubos. Anote los resultados.
c. Determinación de la actividad específica:
Armamos el siguiente sistema de tubos.
Tubos (ml)
V.
I
II
III
IV
PREPARADO ENZIMÁTICO
---
0.2
0.1
0.05
AGUA DESTILADA
1.0
0.8
0.9
0.95
REACTIVO DE BIURET
4.0
4.0
4.0
4.0
Mesclar e incubar a 37°c x 30 minutos Realizar las lecturas de absorbancia a 540nm calibrando a cero en los tubos n°1
TABLA DE DATOS a. Determinación de actividad enzimática: La calibración utilizada fue a 620nm, pero como nuestra solución estuvo muy concentrada por tal razón, cambiamos a 540 nm.
N° TUBOS
La calibración utilizada fue a 540nm N° tubos
Absorbancia a (540nm)
absorbancia a (540nm)
I
0.106
I
2.420
II
0.118
II
3.850
III
0.132
III
3.852
IV
0.100
IV
3.852
b. Determinación de la actividad Específica: VI.
CÁLCULOS Y RESULTADOS a. Determinación de la concentración del almidón (mg/ml), multiplicando absorbancia por factor de calibración. N° tubos I II
concentración () -38.500
III IV promedio
38.520 38.520 38.513
b. Calculo de las unidades de enzima U (de la siguiente forma U: mg de almidón hidrolizado/15min).
n tubos I II
UNIDADES ENZIMÁTICAS ---
VII.
2.568 2.568 2.568
2.567
c. Determinación de mg de proteína/ml = absorbancia por factor. n tubos I II III IV promedio
III IV promedio
% PROTEÍNAS (mg/ml) 1.06 1.18 1.32 1.00 1.140
d. Determinación de la actividad de específica. n tubos I II III IV promedio
ACTIVIDAD ESPECIFICA -----0.22 0.19 0.26 0.223
CONCLUSIONES
VIII.
Primeramente para especificar bien las conclusiones, damos a conocer que la alfa amilasa es producida por bacterias, hongos. Mientras que, la beta-amilasa es de origen vegetal y producidas por algunas bacterias. Por tanto concluimos que la actividad específica de la beta amilasa es de un promedio de 0.223 ml/min En conclusión el resultado deseado no se obtuvo por falta de una buena guía en el laboratorio, sin embargo obtuvimos datos de absorbancia (3.494) muy altas, esto es debido a la falta de germinación de los granos de cebada, y al uso de la estufa en lugar de la incubadora.
DISCUSIONES
Las amilasas, son enzimas que hidrolizan los almidones, se encuentran no solo en los animales sino también en las plantas superiores y en los microorganismos. Existen tres tipos principales de amilasas: α-amilasas, β-amilasas y glucoamilasas; estas enzimas se extraen de cuatro fuentes principales: las alfa-amilasas pueden ser de origen fúngico ( Aspergillus oryzae), bacteriano ( Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens ) céreo y pancreático. Y en el caso de la βamilasas pueden ser producidas a partir de cereales, soya. Entonces la amilasa puede ser de tres tipos, la amilasa con la que hemos estado trabajando en laboratorio es de origen vegetal, proveniente del grano de cebada y trigo, entonces la actividad enzimática determinada es de la β - amilasa, mas no de la α -amilasa.
Las β-amilasas hidrolizan los enlaces α-1,4 glicosidicos, comenzando por un extremo no reductor de la molécula de almidón, formando maltosa. No producen una alteración de la viscosidad, yaqué solo actúan sobre el extremo de la cadena del sustrato. Su acción se detiene al llegar a las uniones α -1,6 de la amilopectina generando fragmentos conocidos como dextrinas β -límite. La actividad enzimática
IX.
CUESTIONARIO 1. Por qué se sometieron las raicillas del cereal a un proceso físico y químico en el proceso de extracción. Proceso químico: la agregación de solución de buffer de un pH=4.01, con la finalidad de diluir la concentración de la β - amilasa vegetal. Proceso físico: se trituro la cebada, para extraer β - amilasa vegetal.
2. Si se te da una solución supuestamente contiene una enzima. ¿Cómo determinarías en la solución la presencia de una enzima que cataliza la hidrolisis del almidón? Para determinar la actividad enzimática se debe tener en cuenta fundamentalmente que la acción catalítica de las enzimas es de carácter específico como es en cada reacción debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato, habría entonces tener sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes que existen en un organismo vivo. En esta etapa se puede determinar de dos maneras: a) Verificando el sustrato, el sustrato no transformado (sustrato residual) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura. b) Verificando sus productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura. 3. ¿Cómo se puede incrementar la actividad enzimática de una enzima? La cinética de las reacciones enzimáticas difiere de las reacciones inorgánicas simples. Cada enzima es específica de forma selectiva para la sustancia sobre la que causa la reacción, y es más eficaz a una temperatura determinada. Aunque un aumento de la temperatura puede acelerar una reacción, las enzimas son inestables cuando se calientan. La actividad catalítica de una enzima está determinada sobre todo por su secuencia de aminoácidos y por la estructura terciaria, es decir, la estructura de plegamiento tridimensional de la macromolécula.
X.
BIBLIOGRAFÍA
Garzón de la Mora, P., “Manual de prácticas de bioquímica” Proyecto VI,
Condiciones óptimas para medir una actividad enzimática, 111-125, 2002.
Rivas, G., López, L. A., Velasco, A., “Regresión no lineal”, Revista Colombiana de
Estadística, 14, 89-102, 1993. Suzanne Nielen, “análisis de los alimentos”. Ed. Acribia S.A. España 2003. Pag.117-119.
