PRÁ PRÁ CTICÁ 4 - OXIDÁDIONES BIOLOGICÁS RELACION DE EXPERIMENTOS:
1. Determinación de la actividad de Xantino deshidrogenasa 2. Oxidación de Lactato y Succinato por la cadena respiratoria mitocondrial.
EXPERIMETO 1
La enzima xantina: NAD+ oxidoreductasa (EC 1.17.1.4) (EC 1.17.1.4) es es una enzima que cataliza la reacción química: ác. Úrico + H+
XANTINA + H2O FAD
NADH + H +
FADH2
NAD+
La siguiente reacción química es catalizada por xantino oxidasa (EC 1.17.3.2 (EC 1.17.3.2)) XANTINA + H2O
ácido Úrico FAD
H 2O2
FADH2
O2
Estas enzimas participan participan en el el metabolismo de purinas y purinas y ambas formas catalizan la oxidación oxidación de hipoxantina en xantina y de xantina en ácido úrico. La enzima XANTINO DESHIDROGENASA, después de un proceso de isquemia y posterior reperfusion es convertida en XANTINO OXIDASA, perdiendo su afinidad por NAD+, uniéndose al FAD, Xantina oxidasa (Xo) genera especies reactivas de oxígeno que terminan produciendo daño en los tejidos infartados.
_____________________________________________________ _____________________________________ _________________________________ ______________________ _____ Precaución: los inhibidores de la cadena respiratoria respiratoria son altamente tóxicos en dosis dosis pequeña.
El azul de metileno es un cromóforo con capacidad de aceptar electrones de las enzimas flavoprotéicas como XANTINO DESHIDROGENASA o XANTINO OXIDASA.
Significancia Clínica En humanos XANTINO OXIDASA, es enzima marcadora de daño hepático; es inhibida por allopurinol y es usada en el tratamiento de de la gota. La Xantinuria La Xantinuria es un raro desorden genético desorden genético caracterizado por deficiencia de xantino deshidrogenasa y alta concentración de xantina en sangre, puede causar falla renal.
OBJETIVOS 1. Verificar la actividad de XANTINO DESHIDROGENASA de la leche, usando como sustrato a XANTINA 2. Estudiar el efecto de los inhibidores URETANO, ALOPURINOL y CIANURO sobre la oxidación de XANTINA por acción de XANTINO DESHIDROGENASA de la leche. 3. Estudiar la oxidación de XANTINA usando una fuente enzimática desnaturalizada por calor.
MÉTODO Medida de la Actividad de XANTINO DESHIDROGENASA , por decoloramiento del azul de metileno (reducción) y calificación por cruces.
PROCEDIMIENTO Rotular 5 sistemas de ensayo del 1 al 5 y medir lo siguiente en mililitros.
SISTEMAS
1
2
5,.0
3
4
5
5,0
5.0
5.0
5,0 1.5 1,5
0,5 1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
Mezclar y agregar enseguida a cada tubo aproximadamente 1 cm de parafina líquida, colocar en baño de 37oC y observar hasta que uno de los sistemas haya decolorado totalmente el azul intenso del aceptor de electrones “azul de metileno” , inmediatamente evaluar por cruces la decoloración de todos los sistemas, colocando 5 cruces al que haya decolorado totalmente y cero cruces al que no haya decolorado.
RESULTADOS Anotar sus observaciones y evaluación. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE XANTINO DESHIDROGENASA
ACTIVIDAD
1
2
3
4
5
NORMAL
DESNATURALIZACION CON CALOR
DESNATURALIZACION
DESNATURALIZACION
DESNATURALIZACION
CON ALLOPURINOL
CON CIANURO
0(+)
5(+)
CON URETANO
ENZIMATICA (CRUCES)
5(+)
0 (+)
0(+)
INTERPRETACION (Indique la composición del sistema y el resultado) SISTEMA 1: Hay decoloración, porque tiene sustrato (xantina) y azul de metileno (aceptador artificial H+ y e-
SISTEMA 2: No funciona por la desnaturalización de leche por accion del calor, no decolora. _____________________________________________________________________________
SISTEMA 3: Utilizamos inhibidor uretano por eso no hay decoloración por eso no hay una reacción _____________________________________________________________________________
SISTEMA 4: Utilizamos un inhibidor que es xantina y alopurinol tampoco ocurre reacción. _____________________________________________________________________________
SISTEMA 5: Si funciona puesto que tiene un componente que es leche cruda, sustrato, azul de metileno y además un inhibidor cianuro de sodio. _____________________________________________________________________________
EXPERIMETO 2
La mayor parte de ATP es producido por fosforilación oxidativa, un proceso dependiente del transporte de electrones a través de la cadena respiratoria; al mismo tiempo que la combustión de las grasas, los carbohidratos e incluso de las proteínas. Los intermediarios de la cadena respiratoria se localizan en la membrana mitocondrial interna, consiste en reoxidar NADH y FADH2, pasando los electrones a una cadena de transporte electrónico hasta O2, la energía que se disipa en el transporte es aprovechada para sintetizar ATP.
NADH + H+ + ½ O2
NAD+ Gº’
FADH2 + ½ O2
+ H2O
= - 52.6 Kcal/mol
FAD + H2O Gº’
= - 43.4 Kcal/mol
La oxidación de un sustrato típico, libera suficiente energía libre para producir 2 a 3 moléculas de ATP por cada átomo de oxígeno consumido. La transferencia de electrones desde el sustrato hacia el oxígeno para reducir este a agua va acompañada del bombeo de protones al espacio intermembrana, los cuales emplean el complejo ATP Sintasa para impulsar la formación de una molecular de ATP a partir de ADP y Pi. La cadena de transportadores de electrones o cadena respiratoria mitocondrial, está dispuesta en orden creciente de afinidad por los electrones (Potencial redox).
OXIDACIÓN DE LACTATO Y SUCCINATO
OBJETIVOS 1. Demostrar la necesidad de NAD+ para la oxidación de lactato, más no para la oxidación de succinato. 2. Verificar la acción inhibitoria competitiva del malonato en la reacción de oxidación del succinato. 3. Estimar la oxidación del lactato y succinato por medio de un aceptor artificial de hidrógenos “Azul de metileno”, que al reducirse se decolora.
MÉTODO Medida de la actividad Deshidrogenasa, a través del decoloramiento del azul de metileno y calificación por cruces.
PROCEDIMIENTO
Rotular los tubos del 1 al 8 y preparar los sistemas de la siguiente manera:
SISTEMAS
1
2
3
4
5
6
7
8
Azul de metileno 0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
2.0
2.0 2.0
2.0
3.0
Lactato 0.1 M Succinato 0.1M Succinato 0,3 M
2.0
Malonato 0.2 M Agua destilada
1.9
2.0
3.9
NAD+
0.1
-
0.1
Homogenizado
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
4.0
2.0
1.0
--
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
De corazón Mezclar y agregar enseguida a cada tubo aproximadamente 1 cm de parafina líquida, colocar en baño de 37ºC y observar el grado de decoloramiento, hasta que uno de los sistemas haya decolorado totalmente, inmediatamente anotar por cruces el valor de la decoloración, colocando 5 cruces al que haya decolorado totalmente y cero cruces al que no haya decolorado en absoluto.
R ESULTADOS Construya una tabla para anotar sus observaciones, expresando el tiempo de decoloración y la calificación por cruces.
Actividad LDH SISTEMAS Grado de decoloración
Control
1
2
3
4
0(+)
0(+)
0(+)
0(+)
Actividad SDH 5
6
7
4(+) 0(+) 1(+)
8 5(+)
INTERPRETACION Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Sistema 1: Se encuentra la coenzima NAD y homogenizado
Sistema 2: No tiene la coenzima NAD ______________________________________________________
Sistema 3: Falta el sustrato
Sistema 4: No funciona no hay sustrato y no hay NAD
Sistema 5: Tiene todo
Sistema 6: Tiene todo hasta un inhibidor malonato
Sistema 7: Tiene un inhibidor malonato mayor sustrato
Sistema 8: Tiene un inhibidor tres veces mayor el sustrato Esquema del transporte de electrones por la cadena respiratoria.
INTERROGANTES
1. Esquematice las reacciones catalizadas por LDH y Succinato deshidrogenasa, participando con la cadena respiratoria.
2. Qué diferencias y semejanzas, encuentra entre Xantino deshidrogenasa y Xantino Oxidasa. Diferencias
La xantina deshidrogenasa: Enzima que cataliza la oxidación de xantina en presencia de NAD+ para formar ácido úrico y NADH. Actua también sobre otra purinas y otros aldehídos. Pertenece al grupo de las enzimas que contienen molibdeno involucradas en el metabolismo oxidativo de las purinas. La xantina oxidasa: Es una enzima que cataliza la oxidación de hipoxantina a xantina y puede luego catalizar la oxidación de xantina en ácido úrico. Esta enzima juega un papel importante en el catabolismo de purinas en algunas especies, incluyendo humanos. La xantina oxidasa puede ser convertida a xantina deshidrogenasa a través de una oxidación reversible con sulfhidrilo.
Semejanzas Tienen el mismo cofactor Molibdeno MoCo
3.
Señalar las consecuencias de los siguientes factores, empleando los términos Aumento (A), Disminución (D) y sin alteración (SA) FACTORES
CIANURO
DEFICIENCIA DE PI
ACIDO ASCÓRBICO
DEFICIENCIA DE ADP
PRESENCIA DE DNP
PRESENCIA DE PI Y/O ADP EN PRESENCIA DE DNP
TRANSPORTE DE e -
FOSFORILACIÓN OXIDATIVA
4. Haga una interpretación desde el punto de vista termodinámico de los lugares donde se libera suficiente energía para producir la síntesis oxidativa de ATP.
5. ¿Qué es un agente desacoplador de la fosforilación oxidativa, distinga los tipos de desacopladores y cite al menos dos ejemplos? Agente desacoplador: Sustancias que introducen desde el espacio intermembranoso hacia el interior mitocondial, disminuye la fuerza protón- motriz y la síntesis de ATP. Ejemplos
Termogenina 2,4- dinitrofenol (DNP) Pentaclorofenol CCCP (m-clorocarbonilcianuro fenilhidrazona), 100 veces más activa que el primero.
6. Nombre al menos 4 inhibidores del transporte de electrones por la cadena respiratoria mitocondrial.
Deshidrogenasa ligadas al NAD como coenzima Deshidrogenasas ligasas a la Flavina que contiene FAD o FMN como grupo prostetico Proteinas hierro-azufre Citocromos (hemoproteinas: Fe + profirina
7. ¿Qué objeto tiene usar parafina liquida en cada tubo, que sucedería con el azul de metileno de no usar este producto? Tiene que usar un colorante para que así se pueda observar la reducción ya sea con el azul de metileno u otro de colorante
8. Cómo es que actúa el azul de metileno, nombre otro compuesto que tenga la misma acción El azul de metileno es un indicador de óxido-reducción (es azul cuando esta oxidado e incoloro cuando está reducido) Otros compuestos son Azul de metileno, Metasulfato de fenocina, 2,6 diclorofenolindofenol, ferricianuro de potasio, etc.
9. Interprete el esquema del consumo de oxígeno a través de su electrodo. A [O2] (
) Desacoplador
(
) Sustrato
(
) Inhibidor
(
) Dador de electrones
B C
D
