Universidad de Chile Facultad de Ciencias
Enzimas 1 Actividad enzimática y curva de progreso
Introducción Los organismos vivos requieren de energía para su funcionamiento, la cual obtienen de su entorno. Para ello requieren de un conjunto de atributos tanto físicos como químicos. Uno de los más importantes son los mecanismos catalíticos. La catálisis es de suma importancia ya que muchas de las reacciones químicas que son necesarias para la vida, requieren de una escala de tiempo no compatible con la escala de tiempo de los organismos. Las enzimas están en el centro de todos los procesos bio-químicos, actuando con un elevado grado de especificidad y acelerando enormemente las reacciones químicas. El estudio de las enzimas es importante para el estudio de algunas enfermedades, así como para diagnosticar patologías, fármacos, comprender la degradación de compuestos, conservación y transformación de la energía química, agricultura, entre otros. Las proteínas son los componentes de la mayoría de las enzimas, y son en su conjunto las responsables de otorgarle características particulares (disposición y conformación en el espacio y actividad catalítica) a las enzimas. La actividad catalítica está definida en una zona específica llamada sitio activo, en el cual la enzima proporciona un ambiente específico dentro del cual una determinada reacción puede transcurrir a mayor velocidad. Para ello el sustrato se une al sitio activo, para luego ser liberado como producto. Es importante destacar que la enzima no pierde su función una vez realizado este proceso de conversión de sustrato a producto. La actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de un mol de sustrato en un minuto (por convención a 25 ºC). Con actividad se refiere al total de unidades de enzima que están presentes en una [1] solución .
Ecuación 1
Para comprender y medir la actividad enzimática se deben tomar ciertas precauciones. Primero, es necesario conocer el o los sustratos y el o los productos de las reacciones, además de disponer de los métodos analíticos para medirlos. También se deben realizar experimentos de control, los cuales permiten descartar posibles interferencias de los resultados como consecuencia de que algún compuesto este generando o descomponiendo algún producto o sustrato. Los controles realizados en este experimento son: -Blanco de sustrato: Sistema que contiene una mezcla de reacción similar a la mezcla en la cual se detecta la actividad enzimática, en la cual el sustrato es reemplazado por un volumen equivalente, en este caso por agua. -Blanco de enzima: En este control la solución enzimática es intercambiada por un volumen equivalente de un solvente, en este caso agua. -Tiempo cero: Este control contiene todos los componentes de la mezcla en la cual se detecta la actividad enzimática, pero la reacción se detiene en el mismo momento de completar el sistema, por lo que posee un tiempo de incubación 0. Otra precaución es la de realizar el experimento bajo condiciones conocidas, como [2] son: el pH, temperatura y tiempo de incubación .
Al estudiar la reacción enzimática en el transcurso del tiempo, se obtiene una curva de progreso, la cual representa el aumento de la concentración de producto (catalizado por medio de una enzima) en función del tiempo. A partir de la gráfica de estos datos es posible conocer la velocidad de una reacción, en la cual se muestra que en un comienzo, la velocidad es proporcional a la concentración de la enzima, pero a medida que transcurre el tiempo, la cantidad de producto creado va disminuyendo la velocidad de la reacción, hasta [2] un punto donde se hace cero .
Materiales y Métodos La siguiente lista muestra los materiales utilizados en el laboratorio para el ex perimento 1 y 2:
-
Amortiguador fosfato de sodio pH 7,2 (0,1 M) O-nitrofenil-β-galactósido (ONFG) (0,01 M) O-nitrofenol (ONF) (0,5 mM) Carbonato de sodio (1,0 M) β-galactosidasa
Experimento 1: Determinación de la actividad enzimática de la β-galactosidasa
Se preparan 3 tubos, control, un blanco enzima y un blanco sustrato, lo que contiene cada uno se detalla en la tabla I a continuación. Tabla I: Componentes de los tubos que se utilizaran para la determinación de la actividad enzimática de la β-galactosidasa
Componente Amortiguador Fosfato de Sodio (buffer) Enzima (β-galactosidasa) Sustrato (O-nitrofenil-β-galactósido) H2O Total
Control 0,45 ml 0,20 ml 0,15 ml 0,70 ml 1,50 ml
Blanco enzima 0,45 ml 0,15 ml 0,90 ml 1,50 ml
Blanco sustrato 0,45 ml 0,20 ml 0,85 ml 1,50 ml
El último componente que se agrega es el sustrato, una vez agregado este comienza a correr el tiempo de incubación determinado, en este caso se determinó un tiempo de incubación de 5 minutos para los tres tubos (control, blanco enzima y blanco sustrato). Al cumplirse este tiempo a cada tubo se le agregan 0,3 ml de Carbonato de Sodio para finalizar las reacciones; luego se le adiciona 1,2 ml de agua para completar un volumen final de 3,0 ml. Finalmente, a cada solución se le mide la absorbancia en un espectrofotómetro a 420 nm para poder calcular la cantidad de producto generado, lo que nos indicaría la actividad de esta enzima. Experimento 2: Estudio de la velocidad de hidrólisis enzimática del galactósido en función del tiempo de incubación (curva de progreso)
O-nitrofenil-β-
Se preparan 6 tubos con la misma concentración de componentes del tubo control del experimento 1. En este caso, la diferencia entre los tubos será el tiempo de incubación, estos tiempos y los componentes son detallados en la tabla II a continuación.
Tabla II: Componentes y tiempo de incubación de los tubos que se utilizaran para el estudio de la velocidad de hidrólisis enzimática del O-nitrofenil-β-galactósido
Tubo
1 2 3 4 5 6
Tiempo de incubación (min) 0 12 24 36 48 60
Buffer (ml) 0,45 0,45 0,45 0,45 0,45 0,45
Enzima (ml) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Sustrato (ml) 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15
H2O (ml) 0,70 0,70 0,70 0,70 0,70 0,70
El último componente que se agrega es el sustrato, una vez agregado este comienza a correr el tiempo de incubación determinado. Al cumplirse los tiempos especificados en la tabla II a cada tubo se le agregan 0,3 ml de Carbonato de Sodio para finalizar las reacciones; luego se le adiciona 1,2 ml de agua para completar un volumen final de 3,0 ml. Finalmente, a cada solución se le mide la absorbancia en un espectrofotómetro a 420 nm.
Resultados Brutos Los experimentos se realizaron bajo las siguientes condiciones: -Temperatura ambiental (14 º C). -Volumen de incubación de 1,5 ml. -Volumen libre de 1,5 ml. -Volumen total del sistema 3 ml. -Absorbancias realizadas a 420 nm. Experimento 1:
Se midió por medio de un espectrofotómetro la absorbancia a 420 nm del blanco enzima, blanco sustrato y para la reacción del sistema, obteniendo la siguiente tabla: Tabla III: Valores de absorbancia para el blanco enzima, blanco sustrato y para el sistema.
Blanco Enzima Blanco Sustrato Control
Absorbancia a 420 nm 0,012 0,002 0,260
Experimento 2:
En la siguiente tabla se muestra para cada tubo, su respectivo tiempo de incubación y la absorbancia medida a 420 nm en un espectrofotómetro.
Tabla IV: Valores de absorbancia a 420 nm de los respectivos tubos y tiempo de incubación.
Tubo 1 2 3 4 5 6
Tiempo de incubación (minutos) 0 12 24 36 48 60
Absorbancia a 420 nm 0,045 0,490 0,799 1,063 1,319 1,395
Análisis de resultados Experimento 1:
Con el fin de analizar los resultados obtenidos, el gráfico a continuación se obtuvo en el primer procedimiento práctico de proteínas 1 “curvas de calibración para la concentración de proteínas y de ONF”.
Gráfico 1. Absorbancia a 420 nm v/s Concentración 1.4 ) m1.2 n 0 1 2 4 ( a0.8 i c n0.6 a b r 0.4 o s b A0.2
Abs = 4,1193 x concentración R² = 0,9826 Absorbancia a 420 nm Linear (Absorbancia a 420 nm)
0 0
0.1
0.2
0.3
0.4
Concentración (μg/ml)
Figura 1: Gráfico 1 de absorbancia a 420 nm versus la concentración de ONF obtenido en el primer práctico.
Graficar los valores de absorbancia y concentración permite obtener un valor para el factor de calibración, el cual en este caso corresponde a 4,1193. Este valor equivale al coeficiente de extinción del ONF. Con este valor podemos calcular a partir de la absorbancia la cantidad de μmoles producidos de ONF. En la tabla V a continuación se muestran los valores de ONF producido en cada tubo según la absorbancia marcada en el espectrofotómetro. Para obtener la concentración de ONF producida, a la absorbancia del tubo control se le resta la suma de las absorbancia de los dos tubos blancos y ese valor es divido por el coeficiente de extinción obtenido en el gráfico.
Tabla V: Valores de absorbancia y concentración de ONF para los tubos utilizados en la determinación de la actividad enzimática
Blanco Enzima Blanco Sustrato Control
Absorbancia a 420 nm
Concentración ONF (μmoles/ml)
Concentración total de ONF (μmoles)
Concentración final de ONFG (μmoles)
0,012
0,003
0,009
1,401
0,002
0,000
0,000
0,000
0,246
0,060
0,180
1,320
Con la ecuación (1) presente en la introducción y con los valores de concentración obtenidos, se procede a determinar la unidad de actividad enzimática (U), además para calcular la actividad enzimática específica, el valor obtenido será dividido por 0,2 ml que fue la cantidad de enzima utilizada en la mezcla.
Experimento 2:
A continuación se presentan los datos obtenidos en el segundo experimento, que dan cuenta de cómo afecta en la actividad enzimática el tiempo de incubación. En la tabla VI a continuación se expresan los valores obtenidos y calculados según el gráfico 1 para los valores de concentración de ONF. A los valores de absorbancia se les restó el valor del primer tubo, considerándose este como blanco. Tabla VI: Valores tratados y calculados para el estudio de la velocidad de hidrólisis enzimática del o-nitrofenil-β-galactósido, en función del tiempo de incubación.
Tiempo Concentración ONF Actividad, U Actividad Tubo incubación Absorbancia ONF producido (μmoles/min) específica, (min) (μmoles/ml) (μmoles) U/ml 0 0,000 0,000 0 0,000 0,000 1 12 0,445 0,108 0,324 0,027 0,135 2 24 0,754 0,183 0,549 0,023 0,114 3 36 1,018 0,247 0,741 0,021 0,103 4 48 1,274 0,309 0,927 0,019 0,097 5 60 1,350 0,328 0,984 0,016 0,082 6 Con los datos de la tabla VI es posible realizar un gráfico de la concentración total de μmoles de ONF producidos en función del tiempo de incubación,
Gráfico 2. μmoles de ONF producidos V/S tiempo 1.2 ) s e l o 1 m μ 0.8 ( o d i 0.6 c u d o0.4 r p F0.2 N O 0
R² = 0.9981
0
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo (min)
Figura 2: Gráfico 2 de la relación entre μmoles de ONF producidos en función del tiempo de incubación. 2
El valor de R indicado en el gráfico (0,9981) es muy cercano a 1, lo que nos indica que existe una fuerte correlación entre el ONF producido y el tiempo de incubación. Con los datos de la tabla VI también posible realizar un gráfico que muestre la variación de la velocidad de la reacción a través del tiempo de incubacion.
Gráfico 3. Velocidad de la reacción V/S tiempo s e 0.03 l o m 0.025 μ ( n 0.02 ó i ) n c i c m0.015 a / e r F e N d O 0.01 d a 0.005 d i c o 0 l e 0 V
R² = 0.9867
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo (min)
Figura 3: Gráfico 3 de la relación entre la velocidad de la reacción y el tiempo de incubación. 2
El valor de R indicado en el gráfico (0,9867) es muy cercano a 1, lo que nos indica nuevamente que existe una fuerte correlación entre la velocidad de reacción y el tiempo de incubación.
Discusión En el experimento 1, al observar la tabla V se observa que la concentración total de ONF para el blanco sustrato es 0, lo cual se esperaba ya que la reacción no se puede llevar a cabo sin un sustrato, a diferencia del blanco enzima, en el cual a pesar de no poseer la enzima se obtuvieron a los 5 minutos de incubación una concentración final de 0,009 μmoles de ONF, esto se debe a que la reacción ocurre a pesar de la ausencia de la enzima. En el control se observa que al cabo de los 5 minutos de incubación se obtiene una concentración total de ONF mucho mayor que la obtenida en el blanco enzima, por lo que se puede concluir a partir de este experimento que la enzima β-galactosidasa actua como catalizador ya que cumple la función de acelerar la velocidad de esta reacción. Por otro lado se comprueba que es necesario conocer las condiciones experimentales, como lo son el pH, la temperatura y el tiempo de incubación, ya que estos factores son determinantes para estudiar la actividad enzimática. El experimento 2 permite calcular la actividad enzimática de la β-galactosidasa, para ello se construyó una curva de progreso (Fig. 2) en la que es posible observar la relación entre el ONF producido y el tiempo de incubación. Esta curva describe una relación hiperbólica. Esto implica que a medida que transcurre el experimento la cantidad de producto formado por unidad de tiempo va disminuyendo (esto se observa con mayor 2 detalle en la tabla VI). Se observa en la fig. 2 el valor de R , que es 0,9981 valor muy cercano a 1, lo que nos indica la fuerte correlación que existe entre las dos variables estudiadas y nos confirma una buena realización del experimento. Esta curva va a tender a llegar a un punto de equilibrio, donde las velocidades de la reacción (directa e indirecta) se igualan, es decir, se forman a la misma velocidad productos y reactantes, A pesar que la relación sea hiperbólica (Fig.2), se observa que en las primeras fracciones de tiempo la curva muestra una relación lineal, esta fracción de la gráfica se representara en un gráfico independiente (gráfico 4) para la observación clara de la linealidad que presenta.
Gráfico 4. ONF producido V/S tiempo ) 0.6 s e 0.5 l o m0.4
μ ( o 0.3 d i 0.2 c u d 0.1 o r p 0 F 0 N O
y = 0.0237x R² = 0.9871
5
10
15
20
25
30
Tiempo (min)
Figura 4: Gráfico 4 de la relación entre el ONF producido y el tiempo de incubación.
De este gráfico se desprende la velocidad de la reacción (pendiente de la recta) que 2 es 0,0237 μmoles/min. Además se observa el valor de R (0,9871) que es muy cercano a 1, o que nos indica una fuerte correlación entre el ONF producido y el tiempo de incubación. En este gráfico solo se consideran los primero puntos equivalentes a los tres tubos iniciales, ya que solo en esta fracción del experimento la concentración de productos al ser tan pequeña no altera la velocidad de la reacción. En el gráfico 3 (Fig. 3), se corrobora lo mencionado anteriormente sobre la relación que existe entre la velocidad de reacción y el tiempo de incubación, ya que la gráfica muestra una pendiente negativa, mostrando como la velocidad disminuye a medida que el tiempo transcurre, la tendencia de esta curva nos indica que con el transcurso del tiempo se pueden llegar a obtener valores de velocidad cero, llegando a un punto de eq uilibrio. Las condiciones experimentales (pH, temperatura y tiempo de incubación) son variables determinantes de la reacción; la temperatura por su parte afecta directamente la cinética de la reacción, lo que se ve reflejado en un notorio cambio de velocidad inicial, a mayor temperatura, la velocidad inicial será mayor. Por otro lado el pH afecta la actividad enzimática, esto se ve reflejado al momento de finalizar el momento de incubación deseado se utilizó carbonato de sodio para detener la reacción, ya que el carbonato de sodio cambia el pH de la solución.
Conclusión
Se logró determinar de manera experimental la actividad enzimática de la βgalactossidasa. Se obtuvo un valor de velocidad de reacción para la formación de ONF a partir de ONFG. Se logró determinar de manera experimental la importancia y como afectaron las diferentes variables (temperatura, pH y tiempo de incubación) a la reacción. En una reacción enzimática la velocidad de la formación de producto varia en el transcurso de tiempo, siendo máxima en los primeros minutos de la reacción y disminuyendo a medida que se acerca al equilibrio. A su vez la actividad enzimática era mayor en el comienzo de la reacción y disminuye a mayores tiempos de incubación. La utilización de controles ( tiempo cero, blanco enzima y sustrato) es necesaria para poder descartar la influencia de los otros componentes del sistema en la reacción.
Cuestionario Experimento 1:
1. ¿Qué función cumple el carbonato de sodio en el sistema de ensayo de la – galactosidasa? El carbonato de sodio (Na2CO3) utilizado se encontraba en solución acusa, en estas condiciones se encuentra con un pH muy básico. Por lo que cuando es incluido al sistema provoca un cambio drástico de pH, volviendo el sistema alcalino. Este cambio en las concentraciones de iones en la solución se sucede de un cambio en la forma de la proteína, debido a una protonación o desprotonación de las proteínas que componen a la enzima. Esta reestructuración de la proteína cambia la conformación de la proteína, inhabilitando su sitio activo y por ende su actividad enzimática. 2. ¿Cómo podría comprobar que una reacción química determinada es una reacción enzimática? Mediante tubos de control de actividad enzimática, como un tubo control de blanco de enzima (en ausencia de la enzima) y un tubo control con todos los componentes de la reacción, ambos tubos someterlos a las mismas condiciones de pH, temperatura y tiempo de incubación. A continuación mediante espectrofotometría determinar si hubo o no cambios en los valores de absorbancia entre ambos experimentos. Otra manera es teniendo dos tubo control con concentraciones de enzimas diferentes, y mediante espectrofotometría ver si existe algún cambio en los valores de absorbancia.
3. Si desea determinar una actividad enzimática cualquiera en un extracto de tejido: a) ¿Qué controles haría? Un control de tiempo cero contrastado con una curva de progreso y la Ecuación 1, permiten determinar la actividad enzimática. Ya que se puede observar si los componentes de la reacción interfieren o no en la actividad enzimática. b) ¿Qué consideración debe tener en cuenta para fijar el tiempo de incubación? Para fijar el tiempo de incubación se debe tener en consideración la velocidad de reacción de la enzima. Para ellos es necesario realizar una curva de progreso, la cual permite escoger una fracción del tiempo en el cual la reacción se encuentre en velocidad inicial.
Experimento 2:
1. ¿Cómo afectan la forma de una curva de progreso: la concentración de sustrato, la concentración de enzima? La modificación de la concentración de enzima y la concentración de sustrato afectan de la misma manera en una curva de progreso. El aumento de la concentración (tanto de sustrato como de enzima) produce un aumento en la pendiente de la primera fracción de la curva de progreso. Por otro lado una disminución en las concentraciones produce una disminución en la pendiente de la primera fracción de la curva de progreso. 2. Una reacción enzimática se detiene espontáneamente después de transcurrido un cierto tiempo: a) ¿Qué explicación podría dar para este fenómeno? Este fenómeno puede explicarse de dos maneras, primero puede ocurrir que se produzca la concentración necesaria de producto como para alcanzar el equilibrio de las velocidades de reacción, y al igualarse estas, se establece un equilibrio de reacción y se detiene la actividad enzimática. Por otro lado está la segunda opción, que puede que una elevada concentración de producto termine inhibiendo la actividad enzimática. b) ¿Cómo podría comprobar experimentalmente su hipótesis? Para comprobar la primera hipótesis de que se logra un equilibrio, se puede utilizar un reactivo que reaccione con el producto formado y que además no interfiera en la reacción enzimática, de esta manera, el equilibrio no puede ser logrado y por ende no se llega a una detención de la reacción enzimática. Para comprobar la segunda hipótesis de la inhibición de la enzima, al momento de la detención de la reacción enzimática se puede agregar más sustrato, si al pasar el tiempo la reacción sigue detenida, se debe a la inhibición enzimática y no a un equilibrio logrado.
Bibliografía [1] Nelson D. y Cox M., 2009, Principios de Bioquimica, capítulo 6, paginas 91 y 183197, OMEGA, España. [2] Victoria Guixé y Ana Preller, 2014, Guía de trabajos prácticos y de ejercicios, Curso de Bioquímica, Facultad de Ciencias de la Universidad de Chile.
