Universidad de la Sabana Facultad de ingeniería química e ingeniería de producción agroindustrial Bioquímica 2017-2 “eterminación de poli!enoles en "ierbabuena por el m#todo de Folin-$iocalteou% Redactado por: Karen Sarmiento Delgado- Laura Valentina Valentina Cely Merchan
&'SU(') Los polifenoles son micronutrientes de importante consumo, los cuales pueden ser identificados por espectroscopía, es por esto ue, se !usc" determinar la presencia de polifenoles en una muestra de hier!a!uena mediante el m#todo de $olin-Ciocalteou% Se tomaron tres muestras del mismo racimo de hier!a, la primera se us" para determinar el porcenta&e de materia 'egetal ue fue de (),*+, la segunda y la tercera se usaron para determinar la presencia de polifenoles con el m#todo ya mencionado, una de ellas fue meclada mediante 'orte. y la otra fue calentada en !a/o de ultasonido% 0ras graficar las respecti'as cur'as de cali!raci"n y realiar un an1lisis de datos, se o!tu'o un 'alor apro.imado para las concentraciones%
*+,+B&+S $,+'S. $,+'S. polifenoles, $olin-Ciocal $olin-Ciocalteou, teou, espectroscopía% espectroscopía% micronutrients of important consumption, which can be identified by spectroscopy, spectroscopy, +BS/&+$/. Polyphenols are micronutrients therefore, therefore, we sought to determine the presence of polyphenols in a sample of peppermint by the method of FolinCiocalteou. Three samples were taken from the same herb bunch, the first one w as used to determine the percentage of vegetable matter that was (),*+, the second and third one were used to determine the presence presence of polyphenols with the above method, one of them was mixed by vortex and the other was heated in ultrasound bath. fter ft er graphing the respective calibration curves and performing a data analysis, it was obtained an approximate value for the concentartions.
'3&S : polyphenols, Folin-Ciocalteou, spectroscopy. spectroscopy.
de $ourier permite la o!tenci"n de espectros de forma r1pida, precisa y con relaciones Se/alRuido 6S97 ele'adas%4;5
14 5)/&3U$$56)
&eactivo de Folin-$iocalteou Los polifenoles constituyen una de las principales clases de meta!olitos secundarios de los 'egetales, donde desempe/an di'ersas funciones fisiol"gicas% 2stos micronutrientes inter'ienen en el crecimiento y reproducci"n de las plantas, así como en procesos defensi'os contra agentes pat"genos, depredadores o radiaci"n ultra'ioleta% 3ctualmente e.iste gran inter#s en estos compuestos de!ido a la gran 'ariedad de acti'idades !iol"gicas ue presentan, consider1ndose uno de los compuestos alimentarios m1s importantes por su contri!uci"n al mantenimiento de la salud humana% La acti'idad !iol"gica de los polifenoles est1 relacionada con su car1cter antio.idante actuando como atrapadores de radicales li!res% De hecho, di'ersas organiaciones internacionales, en el 1m!ito de la nutrici"n, recomiendan un consumo diario como mínimo de cinco raciones de fruta o 'erdura, para asegurar una adecuada ingesta de antio.idantes y pre'enir enfermedades relacionadas con el estr#s o.idati'o% 2.isten numerosos estudios ue proporcionan datos ue apoyan la correlaci"n negati'a entre la ingesti"n de compuestos fen"licos y el riesgo de padecer ciertas enfermedades, incluyendo las enfermedades cardio'asculares, c1ncer, enfermedad de 3lheimer, cataratas y otras disfunciones relacionadas con la edad% 4)5
2l reacti'o de $olin-Ciocalteu 6$CR7 es una mecla de fosfomoli!dato y fosfotungstato, usado para la determinaci"n de antio.idantes fen"licos y polifen"licos% $unciona midiendo la cantidad de sustancia analiada ue se necesita para inhi!ir la o.idaci"n del reacti'o%
2ste reacti'o no s"lo mide los fenoles totales, sino ue reaccionar1 con cualuier sustancia reductora% 2n consecuencia, el reacti'o mide la capacidad reductora total de una muestra, no s"lo el ni'el de compuestos fen"licos% 2ste reacti'o forma parte del ensayo de proteínas de Lo
24 (+/'&5+,'S ('/33S (aterial egetal
La cantidad de compuestos polifen"licos y tipos presentes en un alimento 'aría en funci"n de la especie 'egetal, 'ariedad y parte del 'egetal considerada 6fruto, semillas, !rotes, ho&as7, horas de e.posici"n solar, grado de madure,
condiciones de culti'o, almacenamiento, etc%
procesado,
condiciones
de
Se pesaron apro.imadamente ;g de ho&as de hier!a!uena so!re una ca&a de >etri y fueron colocados en una estufa a ?@AC durante un día% Bna 'e completado del tiempo, se sac" la muestra y se de&" enfriar en un desecador para tomar nue'amente su peso y realiar el c1lculo del porcenta&e de humedad%
*reparación de muestra
Se pesaron g de ho&as de hier!a!uena, pre'iamente cortados en 2l o!&eti'o de este estudio fue e'aluar el contenido en polifenoles peue/as partes, y se transfirieron a un tu!o falc"n de @ml totales, mediante la metodología de $olin-Ciocalteu, de la protegido con aluminio% Se adicionaron ;@ ml de etanol y se agit" hier!a!uena comercialiada en el mercado del municipio de Chía en 'orte. 'eces con un lapso de minutos entre cada agitaci"n% en Colom!ia, para así aportar informaci"n so!re el posi!le >osteriormente se reali" filtraci"n con algod"n y se recogi" el impacto !en#fico a la salud de esta hier!a% so!renadante, ue luego fue lle'ado a 'olumen con etanol en un matra aforado de ;ml% 'spectroscopía Repitiendo el mismo procedimiento anterior se prepar" un La t#cnica de 2spectroscopía de 8nfrarro&o permite la segundo tu!o falc"n de @ml igualmente con g de hier!a!uena y identificaci"n de los grupos funcionales de un compuesto% 2sto ;@ml de etanol% 2sta 'e no se reali" agitaci"n con 'orte., sino de!ido a ue cuando una mol#cula a!sor!e radiaci"n infrarro&a, ue se de&" el tu!o en !a/o de ultrasonido durante )@ segundos , la 'i!raci"n intramolecular con frecuencia igual a la de la 'eces% radiaci"n, aumenta en intensidad, lo ue genera se/ales con frecuencias ue corresponden a la 'i!raci"n de un enlace específico% La regi"n infrarro&a se di'ide en tres regiones denominadas infrarro&o cercano 698R7, infrarro&o medio 6M8R7 e infrarro&o le&ano 6$8R7% 2l espectr"metro de 8R con transformada
&ealiación de curva de calibración Se prepararon tu!os eppendorf de )@@EL para cada uno de los est1ndares de 1cido g1lico 6,)@,;@,@,(@ y )?@ ELml7 en etanol a partir del est1ndar de )mgml preparado de fresco% Se reali" la gr1fica de a!sor!ancia 's concentraci"n y se determin" la
ecuaci"n de la recta, adicionalmente se determin" el F para el 1cido g1lico%
$uanti!icación de poli!enoles Se colocaron ;@EL de los e.tractos a cada poo% G se adicionaron )@@EL del reacti'o $C diluido en agua 6):7 y *EL de 9a ;CH= 6*p'7% Se determin" la a!sor!ancia a *@ nm usando un lector de micro placas y se determin" la cantidad de polifenoles presentes en las muestras%
84&'SU,/+3S.
/abla 94 $oncentraciones de :cido g:lico
945S$U$56). Iumedad de la hier!a!uena: La humedad en las plantas arom1ticas y en general en los culti'os afecta las condiciones tanto superficiales como su!terr1neas de las partes ue la conforman% 3dem1s, para auellas plantas cuyos aceites esenciales son comercialmente renta!les, es preciso definir este tipo de condiciones y este es el caso de la Iier!a!uena% >or medio de un secado a ?@AC se determin" la humedad presente en dos muestras de Iier!a!uena, cada una de apro.imadamente ; gramos% Los resultados presentados en la
Datos de humedad para la hier!a!uena:
La ecuaci"n tomada en cuenta para calcular los porcenta&es de humedad en las muestras se muestra a continuaci"n &unto con los resultados arro&ados por la misma:
/abla 1. Datos de humedad >eso inicial
>eso final
de Iumedad
Muestra )
;,@))@ g
@,=*? g
(),=;
Muestra ;
),++( g
@,=? g
(;,;
Cur'a de cali!raci"n: 3 partir de la cur'a de cali!raci"n patr"n, se determinaron las concentraciones de 1cido g1lico, un polifenol presente en distintos tipos de plantas como la hier!a !uena, segJn la ecuaci"n de la recta patr"n:
/abla 24 atos patrón4 5lustracion14 $urva de calibración patrón
$oncentración ;
+bsorbancia ;
;@ @ (@ )?@
@,@@@ @,@=(@ @,@*=* @,)(*
Datos de a!sor!ancia para la muestra de Iier!a!uena:
3 las soluciones muestra se rest" la a!sor!ancia del !lanco ue fue de @,@(, con lo cual se o!tu'ieron los siguientes datos:
/abla 84 atos absorbancia muestra >ara hallar el 'alor de las concentraciones se reali" el siguiente c1lculo a partir de la ecuaci"n de la muestra patr"n:
$oncentración de :cido g:lico ;=g>m,?
*romedio @ desviación est:ndar ;=g>m,?
orte<
;?@,+=
=);,;*
;+;,+=
;(?,+ 6 ;),7
Ultrasonido
)),?@
)?,;*
)*,;*
)(,=( 6 ?,@7
+bsorbancia orte< Ultrasonido
@,?(; @,==
@,(=? @,=*(
@,*(( @,=)
ta!la ) fueron muy cercanos al 'alor esperado segJn la teoría, cuyo dato es de (;,=* ) a la misma temperatura% 2sta informaci"n indica ue el m#todo utiliado para e.traer la cantidad relati'a de agua presente en la muestra fue muy efecti'o% 2n este caso tam!i#n es muy importante mencionar ue la mayor parte del peso en las muestras de Iier!a!uena tomada corresponde Jnicamente a la humedad, lo cual es indicio de una planta arom1tica ue realia un proceso de transpiraci"n adecuado, ue es indispensa!le para mantener esta!le la temperatura de la planta y para la formaci"n de !iomasa% 3 pesar de ello, las plantas ue pierden de manera dr1stica el suministro necesario de agua, pierden de igual manera el control de la transpiraci"n, con lo cual se genera marchitamiento, disminuci"n del alargamiento celular, cierre de estomas y disminuci"n de las funciones 'itales como la fotosíntesis% 2sto fue sumamente e'idente en el cam!io de color ue tu'o la hier!a!uena, ya ue luego de realiar este proceso tom" un tono mucho m1s opaco y la superficie se torn" 1spera% >or otro lado, el proceso de secado tam!i#n tiene la funci"n de preser'ar y eliminar muchas !acterias ue crecen y se multiplican en am!ientes hJmedos% $inalmente, uno de los m#todos m1s 'ia!les para el secado de este tipo de plantas es el ue se hace en condiciones de 'acío ya ue minimia las p#rdidas de compuestos fen"licos y antio.idantes%
Con el o!&eti'o de hallar la concentraci"n de estos micronutrientes en la muestra, se aplicaron ; t#cnicas de homogeneiaci"n para las muestras ue contenían los e.tractos y el etanol% 2l 'alor esperado oscila entre los )+*,)) Og de 3%mL ;, ya ue los 'alores te"ricos encontrados dependen del tipo de hier!a!uena, se reali" un promedio y segJn la ta!la el 'alor m1s cercano, teniendo en cuenta la des'iaci"n, es el de Bltrasonido% 3l reducir el tama/o de las partículas, por e&emplo, en la muestra filtrada de hier!a!uena, hace m1s selecti'o y preciso el proceso de a!sorci"n dentro de la !anda indicada para hallar la concentraci"n de 1cido g1lico en la hier!a!uena% >or lo tanto, al realiar la comparaci"n entre los dos m#todos el !a/o de ultrasonido arro&" el me&or resultado, de!ido a la t#cnica en sí% >or un lado, el 'orte. se !asa en una 'i!raci"n, ue transmite un '"rtice a la soluci"n dentro del tu!o, pero el ultrasonido mantiene como principio la propagaci"n de ondas sonoras% 2s un m#todo m1s específico y mec1nico, en el ue las mol#culas al separarse, se distri!uyen de manera uniforme, lo cual me&ora la lectura a tra'#s de la celda específica% 2n general la reacci"n se lle'" en un medio muy !1sico gracias al icar!onato de Sodio, con un pI apro.imado de ), las muestras tenían una tenue coloraci"n aul, lo cual indic" la o.idaci"n del 1cido g1lico% 3 partir de estos datos se realia una apro.imaci"n de la cantidad de micronutrientes y antio.idantes por muestra dependiendo del 1cido presente y una 'ia!ilidad nutricional y medicinal%
3plicaci"n de la Ley de Lam!ert-eer y coeficiente de e.tinci"n:
La ley de Lam!ert-eer rige la a!sorci"n de todos los tipos de radiaci"n electromagn#tica, la cual se puede aplicar a s"lidos,líuidos, gases y, como es el caso de las muestras pro!lema, disoluciones% >or lo tanto, es e'idente segJn la 0a!la ; ue el comportamiento de la a!sorci"n en relaci"n a la concentraci"n es proporcional, lo cual es acorde a la relaci"n:
A4 $3)$,US53)'S.
Sin em!argo, se puede notar igualmente, ue no es una relaci"n directamente proporcional, es decir, al realiar el a&uste lineal, el coeficiente de determinaci"n, no es tan cercano a )% Lo cual posi!lemente es de!ido a las condiciones de los compuestos in'olucrados en la disoluci"n, por e&emplo, el etanol, ue de!ía estar sumamente fresco, o las condiciones del aire, como la humedad ue pueden 'ariar el pI de la soluci"n% Htra 'aria!le ue puede influir es la cantidad de datos tomados para la muestra patr"n ya ue una mayor cantidad de datos sir'e para dar m1s precisi"n al resultado%
dato te"rico encontrado fue de ;);@@ 6
7 en una !anda
de a!sorci"n de ;?@ nm% 2
arcía 9a'arrete $% N% 2'aluaci"n de los efectos del proceso de secado so!re la calidad de la Ste'ia 6Ste'ia re!audiana ertoni7 y la Iier!a!uena 6Mentha spicata7 pg% =
Se determin" la concentraci"n de polifenoles presentes en una muestra de hier!a!uena, considerando ; efectos distintos para la homogeneiaci"n de la disoluci"n, hallando ue el me&or m#todo es el !a/o el ultrasonido con una cantidad de polifenoles de )(,=( 6 ?,@7 Og de 3%mL, resultado ue 'ari" por el estado de la hier!a!uena y sus características de conser'aci"n%
Con respecto al coeficiente de e.tinci"n molar hallado a partir de la cur'a de cali!raci"n, cuyo 'alor fue de @,@=, sin em!argo el
1
Cantidad de polifenoles presentes en la muestra:
Se compro!" ue la cur'a de cali!raci"n patr"n o!edece al modelo de la Ley de Lam!ert-eer con respecto a la proporcionalidad de 3!sor!ancia y concentraci"n, pero no de manera lineal% >or medio de un secado a ?@AC se hall" ue la humedad de la hier!a!uena fue de apro.imadamente (),*+ e'aluando de igual manera las características y condiciones en las cuales la planta contiene dentro de su composici"n agua%
Mu/o Vel1ue 2% 2%, Ri'as-Día K%, Loarca >i/a Ma% $%, Mendoa Día S%, Reynoso Camacho R%, Ramos-"me M% Comparaci"n del contenido fen"lico, capacidad antio.idante y acti'idad antiinflamatoria de infusiones her!ales comerciales pg% (?
Se constat" la efecti'idad del m#todo $olin- Ciocalteau 6$C7 para conocer la cantidad de polifenoles por medio de una reacci"n de ".ido-reducci"n a una a!sor!ancia de *@ nm con un lector de microplacas
4B5B,53C&+FD+
arcía Martíne, !".# Fern$nde% &egovia, '.# Fuentes
()pe%, . *+/. 0eterminaci)n de polifenoles totales por el m1todo de Folin-Ciocalteu%
http:hdl%handle%net)@;);@?% 4)5 Ierrera Duene renda, Rodrigo arcía Noauín, on1les 3riadna isela, Lope Dia Nos# 3l!erto, on1les 3guilar usta'oP 6;@))7 QCuantificaci)n de polifenoles y capacidad
antioxidante en dura%nos comerciali%ados en Ciudad 2u$re% "exico3.
M% C% aldomero 2sui'el Rodrígue 8nstituto de uímica, B93M 4!spectroscop5a de infraro6o% 4;5 Singleton VL, Hrthofer R, Lamuela-Ra'entos RM% nalysis
of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. "eth !n%ymol )+++P ;++: );-)*(%4 Villegas 8saa L% 8 6;@)? / Componentes para el mane6o integrado de plagas de "entha spicata en cultivos del 7riente ntio8ue9o. Bni'ersidad 9acional de Colom!ia% Medellín% 0omado de: http:<<<%!digital%unal%edu%co)*))@;@@(+%;@)?%p df arcía 9a'arrete $% N%6;@)7 !valuaci)n de los efectos del
proceso de secado sobre la calidad de la &tevia *&tevia rebaudiana :ertoni/ y la ;ierbabuena *"entha spicata/
Bni'ersidad 9acional de Colom!ia% ogot1% 0omado de: http:<<<%!digital%unal%edu%co;@);)(;;)=*%;@)%pdf Mu/o Vel1ue 2% 2%, Ri'as-Día K%, Loarca >i/a Ma% $%, Mendoa Día S%, Reynoso Camacho R%, Ramos-"me M% 6;@);7 Comparaci)n del contenido fen)lico, capacidad
antioxidante y actividad antiinflamatoria de infusiones herbales comerciales. Re'ista Me.icana de Ciencias 3gricolas% Vol =% 0omado de: DialnetComparacionDelContenido$enolicoCapacidad3ntio.idan;)(*+%pdf%
KRTGST0H$ >HL2USK8, S23S0839 K9830, D39B03 SL3U89SK3% <(('C C'0, =T>?(
=T'7@'0=T, '= A>!7>& =0 "'C!((? !=B'?7="!=T &P!CT?7&C7P'C &T>0'!&. 0omado
de: http:taninos%tripod%comacidogalico%htm Cruado M%, >astor 3%, Castro 9%, Cedr"n N% c%6;@)=7
0!T!?"'=C'D= 0! C7"P>!&T7& F!=D('C7& E CT'B'00 =T'7@'0=T! 0! !@T?CT7& 0! (CC;7F*Cynara scolymus (./% 0omado de: http:<<<%scielo%org%pepdfrsp'*+n)a@('*+n)%pdf
