LAPORAN TERBAIK PRAKTIKUM KIMIA V
ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL ENZIM α -AMILASE
Disusun Oleh :
1
Arif Nurdiansyah
NIM. 24030110141024
2
Delvina Maris
NIM. 24030110120010
3
Dinar F.Ramadhani
NIM. 24030110141006
4
Nyken Herlyna
NIM. 24030110140032
5
Resti Puteri Utami
NIM. 24030110141018
JURUSAN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG 2012
ABSTRAK
Percobaan „Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim α-amilase α-amilase”” bertujuan untuk memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal enzim. Sampel yang digunakan adalah jagung manis yang merupakan sumber karbohidrat. Enzim α-amilase α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul, baik pada amilase maupun amilopektin. Prinsip dari percobaan ini yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting-out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein). Metode yang digunakan adalah fraksinasi (yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan secara bertahap)/ dan sentrifugasi (yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan d engan cara sentrifugal/perputaran). Hasil yang diperoleh ialah suatu enzim enzim α-amilase α-amilase yang telah murni. Dimana semakin besar penambahan amonium selfat maka semakin kecil endapan yang terbentuk, dengan kata lain enzim semakin murni. Hasil uji kualitatif setelah penambahan amilum dan larutan iodin yaitu, Fraksi I berwana ungu pudar, Fraksi II berwana ungu pudar, Fraksi III berwana ungu pudar, dan Fraksi IV berwana ungu kecokelatan pudar.
Kata kunci: Enzim α-amilase, α-amilase, Sentrifugasi, Fraksinasi, Jagung Manis
PERCOBAAN V
ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL ENZIM α -AMILASE
I. TUJUAN
Memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui memurnikan tahap aw al
II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Enzim
Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis dalam sel hidup. Enzim telah banyak digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi dan industri kimia lainnya. Dalam bidang pangan misalnya amilase, glukosa-isomerase, papain, dan bromelin, sedangkan dalam bidang kesehatan contohnya amilase, lipase, dan protease. Enzim dapat diisolasi dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa adalah : dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi; bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah; dan bersifat spesifik dan selektif terhadap subtrat tertentu. Pada enzim terdapat bagian protein yang tidak tahan panas yaitu disebut dengan apoenzim, sedangkan bagian yang bukan protein adalah bagian yang aktif dan diberi nama gugus prostetik, biasanya berupa logam seperti besi, tembaga , seng atau suatu bahan senyawa organic yang mengandung logam. Apoenzim dan gugus prostetik merupakan suatu kesatuan yang disebut holoenzim, tetapi ada juga bagian enzim yang apoenzim dan gugus prospetiknya tidak menyatu. (Azmi, 2006) 2.2.
Enzim α-amilase
Enzim alfa amilase merupakan salah satu jenis enzim yang berperan atau berfungsi menghidrolisis atau memecah molekul-molekul pati menjadi molekul-molekul lain yang lebih sederhana seperti dekstrin, maltosa, dan glukosa. Mekanisme kerja dari enzim alfa amilase adalah dengan cara memecah ikatan α-1,4 glikosidik rantai glukan pati. Enzim o
enzim alfa amilase bekerja optimum pada pH sekitar 6 dan pada suhu 60 C. Jika suhu ditingkatkan, pH optimum juga meningkat sampai sekitar 7. Jika α-amilase berasal dari Bacillus licheniformis maka akan menghidrolisis pati dengan hasil utama maltoheksosa, malopentosa dengan jumlah glukosa yang lebih tinggi (8 – 10%). enzim alfa amilase
mampu meningkatkan rasa manis pada ekstrak sari buah karena aktivitas enzim alfa amilase yang mampu menghidrolisis pati pada pisang menjadi gula lain yang lebih sederhana. (Darmajana and Agustina, 2008) 2.3. Komponen Enzim Substrat
Enzim merupakan senyawa organik berupa protein yang berfungsi sebagai katalis dalam metabolisme tubuh, sehingga disebut juga biokatalisator. Komponen penyusun enzim terdiri dari : 1. Apoenzim, yaitu bagian enzim aktif yang tersusun atas protein yang bersifat labil (mudah berubah) terhadap faktor lingkungan, dan 2. Kofaktor,yaitu komponen non protein yang berupa : a. Ion-ion anorganik (aktivator) Berupa logam yang berikatan lemah dengan enzim, Fe, Ca, Mn, Zn, K, Co. Ion klorida, ion kalsium merupakan contoh ion anorganik yang membantu enzim amilase mencerna karbohidrat (amilum) b. Gugus prostetik Berupa senyawa organik yang berikatan kuat dengan enzim, FAD (Flavin Adenin Dinucleotide), biotin, dan heme merupakan gugus prostetik yang mengandung zat besi
berperan
memberi
kekuatan
ekstra
pada
enzim
terutama
katalase,
peroksidae, sitokrom oksidase. c. Koenzim Berupa molekul organik non protein kompleks, seperti NAD (Nicotineamide Adenine Dinucleotide), koenzim-A, ATP, dan vitamin yang berperan dalam memindahkan gugus kimia, atom, atau elektron dari satu enzim ke enzim lain. (Herliyana, Nandika, Achmad, Lisdar I, and Witarto, 2008)
2.4. Sifat-Sifat Enzim
1. Enzim adalah Protein Sebagai protein enzim memiliki sifat seperti protein, yaitu sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, seperti suhu, pH, konsentrasi substrat). Jika lingkungannya tidak sesuai, maka enzim akan rusak atau tidak dapat bekerja dengan baik. 2. Bekerja secara khusus/spesifik Setiap enzim memiliki sisi aktif yang sesuai hanya dengan satu jenis substrat, artinya setiap enzim hanya dapat bekerja pada satu substrat yang cocok dengan sisi aktifnya. 3. Berfungsi sebagai katalis Meningkatkan kecepatan reaksi kimia tanpa merubah produk yang diharapkan tanpa ikut bereaksi dengan substratnya, dengan demikian energi yang dibutuhkan untuk menguraikan suatu substrat menjadi lebih sedikit. 4. Diperlukan dalam jumlah sedikit Reaksi enzimatis dalam metabolisme hanya membutuhkan sedikit sekali enzim untuk setiap kali reaksi. 5. Bekerja bolak-balik Enzim tidak mempengaruhi arah reaksi, sehingga dapat bekerja dua arah (bolak-balik). Artinya enzim dapat menguraikan substrat menjadi senyawa sederhana, dan sebaliknya enzim juga dapat menyusun senyawa-senyawa menjadi senyawa tertentu. 6. Enzim bersifat khusus terhadap suatu substrat tertentu yang dapat diikat dan jenis reaksinya. 7. Kerja enzim dipengaruhi oleh lingkungan, seperti oleh suhu, pH, konsentrasi, dll. (Deswita, 2006) 2.5. Cara kerja Enzim
Cara enzim bekerja adalah dengan membentuk senyawa enzim-substrat, kemudian menghasilkan suatu produk tanpa merubah senyawa enzim itu sendiri, setelah produk terbentuk maka enzim akan melepaskan diri untuk membentuk senyawa baru dengan substrat yang lain. Ada 2 (dua) cara kerja enzim : 1. Lock and key (gembok dan anak kunci)
Setiap enzim memiliki sisi aktif yang tersusun dari sejumlah asam amino. Bentuk sisi aktif ini sangat spesifik, sehingga hanya molekul dengan bentuk tertentu yang dapat menjadi substrat bagi enzim. 2. Induced fit (induksi pas) Sisi aktif enzim merupakan bentuk yang tidak kaku (fleksibel). Ketika substrat memasuki sisi aktif enzim, bentuk sisi aktif berubah bentuk sesuai dengan bentuk substrat kemudian terbentuk kompleks enzim-substrat. Pada saat produk sudah terlepas dari kompleks, maka enzim lepas dan kembali bereaksi dengan substrat lain. (Deswita, 2006) 2.6. Faktor – faktor yang mempengaruhi kerja enzim
a. Temperatur Karena enzim tersusun dari protein, maka enzim sangat peka terhadap temperature. Temperature yang terlalu tinggi dapat menyebabkan denaturasi protein. Temperature yang terlalu rendah dapat menghambat reaksi. Pada umumnya temperatur optimum enzim adalah 30 – 400C. Kebanyakan enzim tidak menunjukkan reaksi jika suhu turun sampai 00c , namun enzim tidak rusak, bila suhu normal maka enzim akan aktif kembali . enzim tahan pada suhu rendah, namun rusak diatas suhu 500c. b. Perubahan pH Enzim juga sangat terpengaruh oleh pH. Perubahan pH dapat mempengaruhi perubahan asam amino kunci pada sisi aktif enzim sehingga menghalangi sisi aktif berkombinasi dengan substratnya. pH optimum yang diperlukan berbeda – beda tergantung jenis enzimnya. c. Konsentrasi enzim dan substrat Agar reaksi berjalan optimum, maka perbandingan jumlah antara enzim dan substrat harus sesuai. Jika enzim terlalu sedikit dan substrat terlalu banyak reaksi akan berjalan lambat bahkan ada substrat yang tidak terkatalisasi. semakin banyak enzim, reaksi akan semakin cepat. d. Adanya activator Aktivator adalah zat yang dapat mengaktifkan dan menggiatkan kerja enzim. Contohnya ion klorida, yang dapat mengaktifkan enzim amilase.
e. Adanya inhibitor Inhibitor adalah zat yang dapat menghambat kerja enzim. Berdasarkan cara kerjanya, inhibitor terbagi dua, inhibitor kompetitif, inhibitor nonkompetitif, inhibitor umpan balik, inhibitor represor, inhibitor alosterik. f. Adanya induktor Induktor adalah suatu substrat yang dapat merangsang pembentukan enzim. Misal, laktosa dapat menginduksi pembentukan enzim beta galaktosidase. Umumnya pemberian nama enzim didasarkan atas nama substrat yang dikatalis atau daya katalisnya dengan penambahan kata-ase. Misal proteinase adalah enzim yang dapat mengkatalis pemecahan protein. (Azmi, 2006) 2.7. Inhibitor Enzim
Seringkali enzim dihambat oleh suatu zat yang disebut inhibitor, ada dua jenis inhibitor yaitu sebagai berikut: a. Inhibitor kompetitif Inhibitor kompetitif adalah inhibitor yang bersaing aktif dengan substrat untuk mendapatkan situs aktif enzim. Inhibitor ini disebabkan oleh senyawa tertentu yang mempunyai struktur mirip dengan substrat saat reaksi enzim akan terjadi. Misal, sianida bersaing dengan oksigen dalam pengikatan Hb. Pada penghambatan ini zat – zat penghambat mempunyai struktur yang mirip dengan struktur substrat. Dengan demikian baik substrat maupun zat penghambat berkompetisi atau bersaing untuk bersatu dengan sisi aktif enzim , jka zat penghambat lebih dulu berikatan dengan sisi aktif enzim , maka substratnya tidak dapat lagi berikatan dengan sisi aktif enzim. b. Inhibitor nonkompetitif Inhibitor nonkompetitif adalah inhibitor yang melekat pada sisi lain selain situs aktif pada enzim, yang lama kelamaan dapat mengubah sisi aktif enzim. Inhibitor umpan balik disebabkan oleh hasil akhir suatu rangkaian reaksi enzim yang menghambat kerja enzim pada reaksi pertama. Pada penghambatan ini, substrat sudah tidak dapat berikatan dengan kompleks enzim- inhibitor, karena sisi aktif enzim berubah. (Bahagiawati, 2005)
2.8.
Inhibitor α -amilase
Inhibitor α-amilase adalah protein yang menghambat enzim amilase di dalam saluran pencernaan (midgut) serangga. Enzim amilase diperlukan oleh serangga, terutama serangga yang makan biji-bijian dan ubi yang kaya dengan pati. Pati ini harus hidrolisis menjadi molekul karbohidrat yang lebih sederhana (kecil) seperti disakarida dan monosakarida, agar dapat digunakan dalam sistem metabolisme serangga. Dengan dihambatnya pemecahan pati oleh inhibitor α-amilase maka serangga tidak mendapatkan kebutuhan karbohidratnya, sehingga dapat berakibat fatal bagi serangga tersebut. Beberapa jenis inhibitor α-amilase telah diisolasi dari berbagai biji tanaman, seperti Phaseolus vulgaris dan Triticum aestivum. Inhibitor α-amilase dari P. vulgaris menghambat aktivitas amilase pada ekstrak kasar dari midgut serangga Lepidoptera, seperti Spodoptera littoralis, Agrotis ipsilon, dan Plodia interpunctella (Gutierrez et al. 1993). Inhibitor ini juga menghambat aktivitas amilase di midgut Callosobruchus maculatus dan Tribolium confusum (Bahagiawati, 2005) 2.9. Fraksinasi dalam Pemurnian kitin deasetilase
Pemurnian fraksi dilakukan dengan kromatografi pertukaran anion. Hasil pemurnian dengan kromatografi pertukaran anion menunjukkan bahwa kitin deasetilase memiliki 3 (tiga) buah fraksi a8ktif dengan aktivitas tertinggi pada fraksi ke-76. Karakterisasi biokimiawi menunjukkan bahwa kitin deasetilase mempunyai pH dan suhu optimum masing-masing 8 dan 55 oC, stabil terhadap panas selama 5 jam. Aktivitas enzim dihambat oleh ion logam Mn, Ni dan Ca (1 mM), namun tidak dipengaruhi oleh EDTA. Ion Mg dan Na-asetat dapat meningkatkan aktivitasnya. Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan adanya dengan perkiraan berat molekul 15-67 kDa.
(Rochima, 2005) 2.10. Klasifikasi Enzim
2.10.1 Oksidoreduktase Mengkatalisis reaksi oksidasi-reduksi, dan biasanya menggunakan koenzim +
NAD dan NADP+. Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial: Dehidrogenase, Oksidase, dan Hidroksilase.
2.10.2 Transferase Mengakatalisis pemindahan gugus tertentu, seperti gugus 1-karbon, gugus aldehid, dan keton, gugus alkil, gugus glikosil, gugus fosfat dan gugus yang mengandung S. Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial adalah: Amino, Transferase, Asil Karnitin Transferase, Transkarboksilase 2.10.3 Hidrolase Meningkatkan pemecahan ikatan antara karbon dan atom lainnya dengan penambahan air. Yan gtermasuk enzim ini dengan nama trivial: Esterase, Amidase, Peptidase. 2.10.4 Liase Mengkatalisis pemecahan karbon-karbon, karbon-sulfur, dan karbonnitrogen. Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial: Dekarboksilase, Aldolase, dan Sintase 2.10.5 Isomerase Mengkatalisis rasemisasi optik atau isomer geometri dan reaksi oksidasireduksi intra molekular tertentu. Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial: Epimerase, Mutase, dan Isomerase. 2.10.6 Ligase Mengkatalisis pembentukan ikatan antara karbon dengan karbon, karbon dengan sulfur, karbon dengan nitrogen, dan karbon dengan oksigen. Untuk pembentukan ikatan tersebut diperlukan energi yang berasal dari ATP. Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial: Sintetase dan Karboksilase.
(Azmi, 2006) 2.11.Salting Out
Apabila campuran dalam larutan ditambahkan dengan garam, dan konsentrasi garam yang ditambahkan terus ditingkatkan, maka kelarutan protein dalam campuran tersebut menjadi berkurang sampai pada konsentrasi tertentu protein akan mengendap dan terpisahkan. Hal ini merupakan efek dari salting out. (Scoper, 1998) 2.12 Taksonomi Jagung Manis
Jagung manis memiliki kandungan zat gula tinggi oleh karena terdapatnya gen resesif. Ciri-cirinya berambut putih, dengan biji sebelum matang berwarna putih dan
setelah masak berwarna kuning. Taksonomi tanaman jagung manis (Zea Mays Saccharata) dalam taksonomi tumbuh-tumbuhan dimasukkan dalam taksonomi sebagai berikut: Kingdong
: Plantae (tumbuh-tumbuhan)
Division
: Spermatophyta (tumbuhan berbiji)
Sub Divisio : Angiospermae (biji tertutup) Classis
: Monocotyledone (berkeping satu)
Familio
: Poecease
Genus
: Zea
Species
: Zea Mays Saccharata (Suprapto, 1998)
2.12. Analisa Bahan
2.12.1. Amilum Sifat Fisik : Polisakarida yang banyak terdapat dari tumbuhan, dalam bahasa sehari-hari disebut pati, terdapat pada umbi, daun, batang, dan biji bijian. Sifat Kimia: Terdiri atas dua macam polisakarida yang keduanya adalah polimer dari glukosa yaitu amilosa (20%-80%) dan sisanya amilopektin (Poedjiadi, 1994) 2.12.2. Aquades 0
0
Sifat Fisik : Cairan tak berwarna, titik leleh 0 C, titik didih 100 C, tidak berbau dan tidak berasa. 0
Sifat Kimia: Terdiri dari satu molekul H2O dengan ikatan H-OH 105
(Daintith, 1994) 2.12.3. Jagung Manis Sifat Fisik : Ciri-cirinya berambut putih, dengan biji sebelum matang berwarna putih dan setelah masak berwarna kuning. Sifat Kimia: manis memiliki kandungan zat gula tinggi oleh karena terdapatnya gen resesif. (Suprapto, 1998)
2.12.4. Buffer Phosfat Sifat Fisik : Terdiri dari Larutan A = 0,2 M larutan Na-Phospat monobasis (27,8 g dalam 1000 ml) dan Larutan B = 0,2 M larutan Na-phosphat dibasis (52,65 g) Sifat Kimia:Bekerja aktif pada penambahan asam, konsentrasi relatif rendah, kurang berperan dalam plasma, dalam menghambat beberapa metabolik
enzim
termasuk
Karboksilase,
Fumarase,
dan
Fosfoglukomutase (Sudarmadji, 1997) 2.12.5 Ammonium Sulfat Sifat Fisik
: Kristal berwarna abu-abu sampai putih. Densitas 1,77 g/ml, titik o
leleh 513 C dengan penguraian Sifat Kimia : Larut dalam air, tidak larut dalam aseton dan alkohol, tidak mudah terbakar (Daintith, 1994) 2.12.6 Iodine o
Sifat Fisik : Berwarna ungu tua, titik didih 103,45 C, BM 253,8 g/mol, titik leleh o
113,5 C Sifat Kimia:Larut dalam etanol dan pelarut organik, dapat bereaksi dengan amilum meunculkan warna biru tua (Basri, 2003)
III. METODE PERCOBAAN 3.1. Alat dan Bahan 3.1.1. Alat
1. Tabung Reaksi 2. Sentrifuge 3. Pipet Tetes 4. Kain 5. Gelas ukur 6. Gelas beker 7. Penangas Es 8. Lemari Es 10. Blender 3.1.2. Bahan
1. Jagung Manis 2. Amilum 3. Aquades 4. Larutan Iodine 5. Buffer Fosfat 6. Ammonium Sulfat
3.2.Cara kerja 3.2.1. Isolasi enzim α-amilase
400 g jagung blender Pemblenderan selama 15 menit Penyaringan dengan kain
residu
filtrat Sentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit Ekstrak kasar
5 mL Ekstrak kasar Tabung Reaksi Penambahan 1 mL buffer fosfat Penambahan amilum 1% 3 tetes Penambahan 3 tetes iodin hasil
3.2.2. Pemurnian awal enzim α -amilase
50 mL Ekstrak kasar Gelas beker Penambahan ammonium sulfat secara perlahan-lahan Pendiaman selama 1 jam residu filtrat Pensentrifugasian pada 3000 rpm selama 5 menit Pemisahan endapan dan filtrat
filtrat
endapan
Endapan Gelas beker Penambahan 1 mL buffer fosfat Penambahan amilum 1% 3 tetes Penambahan 3 tetes iodin hasil
IV. DATA PENAMATAN
No 1
Perlakuan
Hasil
Isolasi enzim α-amilase
Diperoleh ekstrak kasar yan berwarna
- 400 g jagung manis di homogenisasi kuning
yag
setela
ditambahkan
dengan 200 ml akuades selama 15 amilum warnanya menjadi ungu menit - penyaringan dengan kain - Filtrat disentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit - Ekstrak kasar diUji aktifitas α-amilase (Kualitatif : dengan substrat amilum 1% dan larutan iodin
2
Pemurnian awal enzim α-amilase - Ekstrak kasar 50 ml + ammonium sulfat - Pengadukan
menggunakan
Diperoleh ekstrak yang berupa larutan
magnetik berwarna kuning kental, lebih kental
stirer
daripada ekstrak kasarnya.
- Pendinginan - Campuran disentrifugasi
Setelah penambahan iodine warna
- Endapan disuspensi
larutan menjadi:
- Enzim
diu ji
aktifitas
α-amilase
Fraksi 1: ungu pudar
(Kualitatif : dengan substrat amilum Fraksi 2: ungu pudar 1%)
Fraksi 3: ungu pudar Fraksi 4: ungu kecokelatan pudar
V. HIPOTESA
Percobaan yang berjudul “Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim α-amilase” bertujuan memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal. Enzim αamilase adalah enzim yang dapat menguraikan amilum yang memutuskan ikatan enzim α1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul. Prinsip dari percobaan ini yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting-out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein). Metode yang digunakan adalah fraksinasi (yaitu pemurnian yang didasarkan pada pengendapan secara bertahap) dan sentrifugasi (yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara sentrifugal/perputaran). Hasil yang diperoleh ialah suatu enzim enzim α-amilase yang telah murni.
VI. PEMBAHASAN
Percobaan ini bertujuan untuk memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal enzim. Sampel yang digunakan adalah jagung manis yang merupakan sumber karbohidrat. Tabel 1. Kandungan Gizi dalam 100 g Jagung Manis Komponen
Karbohidrat (g) Gula (g) Serat (g) Kalori (kkal) Protein (g) Lemak (g) Vitamin A, setara dg 10 g Folat (Vit. B9), 46 g Vitamin C, 7 mg Besi, 0,5 mg Magnesium, 37 mg Potasium, 270 mg Air (g)
Kadar
19 3,2 2,7 90 3,2 1,2 1% 12% 12% 4% 10% 6% 24 (Retno Arianingrum, M.Si, 2011)
Enzim α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul, baik pada amilase maupun amilopektin. Prinsip percobaan ini adalah pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein). Metode pada percobaan ini yaitu Fraksinasi (yaitu, pemurnian yang didasarkan pada pengendapan secara bertahap), Sentrifugasi (yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara sentrifugal/perputaran. 6.1. Isolasi Enzim α-amilase
Dalam percobaan ini digunakan jagung manis. Jagung manis ini dihancurkan dengan cara mekanik menggunakan blender dengan tujuan agar dinding sel hancur sehingga semua komponen yang terkandung dalam jagung manis dapat keluar termasuk enzim α-amilase.
Penghomogenesian dengan aquades dikarenakan enzim α-amilase larut dalam pelarut air karena sifat keduanya yang sama-sama polar, struktur enzim α-amilase adalah:
Gugus OH yang terikat pada atom C itulah yanng menyebabkan enzim α-amilase menjadi bersifat polar, seingga dapat berikatan dengan molekul air melalui ikatan hidrogen
Karena enzim dapat larut dalam aquadest, maka enzim α-amilase akan terkandung didalam filtrat setelah dilakukan penyaringan. Sebelum dilakukan penghomogenasian, jagung manis tidak boleh diperas terlalu keras karena hal ini akan menyebabkan enzim α-amilase yang terkandung dalam jagung manis akan menjadi sedikit karena terbawa oleh filtrat/cairan hasil perasan karena kadar air yang terlalu banyak ikut terperas. Pelarutan dengan pelarut organik lainnya sebenarnya dapat dilakukan, namun hal dapat mengganggu karena adanya pedenaturasian dengan gugus-gugus tertentu, contoh pelarut seperti air, yaitu alkohol, tetapi karena pH yang tidak sesuai yaitu < 7 maka enzim akan terdeaturasi. Mekanisme pendenaturasian protein: 1. Denaturasi Protein karena Panas Panas dapat memutuskan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar yang menopang struktur sekunder dan tersier molekul protein. Hal ini disebabkan suhu yang tinggi meningkatkan energi kinetik sehingga menyebabkan molekul penyusun protein bergetar sangat cepat yang mengakibatkan sisi hidrofobik dari gugus samping molekul polipetida akan terbuka. 2. Denaturasi Protein karena Asam dan Basa Asam dan basa dapat memutuskan jembatan garam pada struktur tersier protein. Hal ini dsebabkankan asam dan basa akan terdisosiasi menjadi produk bermuatan ionik. Mekanisme denaturasi berlangsung ketika terjadi reaksi substitusi antara ion positif dan
negatif di dalam garam dengan ion positif dan negatif yang berasal dari asam atau basa yang ditambahkan. 3. Denaturasi Protein karena Logam Berat Reaksi yang terjadi pada logam berat dengan protein mengakibatkan terbentuknya protein logam yang tidak larut. Protein akan mengalami presipitasi bila bereaksi dengan ion logam. Pengendapan oleh ion positif (logam berat) diperlukan pH larutan di atas pI karena protein bermuatan negative begitu pula sebaliknya. Ion-ion positif +
2+
2+
2+
2+
2+
2+
tersebut adalah : Ag , Ca , Zn , Hg , Fe , Cu dan Pb . Sedangkan ion-ion negatif meliputi : ion salisilat, triklorasetat, piktrat, tanat dan sulfosalisilat. Logam berat juga merusak ikatan disulfida karena afinitasnya yang tinggi dan kemampuannya untuk menarik sulfur sehingga mengakibatkan denaturasi protein. Filtrat disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dari residunya. Supernatan ini merupakan ekstrak kasar. Sementara residu mempunyai komponen antara lain serat, karbohidrat, lemak, kalsium (Ca) , fosfor (P), vitamin, dan senyawa lainnya. Setelah didapatkan ekstrak kasar, kemudian dilakukan tahap pemurnian dengan metode fraksinasi (4 fraksi).
6.2. Pemurnian Awal Enzim α -amilase
Proses pemurnian tahap awal enzim α-amilase dilakukan dengan fraksinasi dengan menggunakan ammonium sulfat terhadap ekstrak enzim α-amilase yang dilakukan dengan penambahan garam untuk mengendapkan protein. Prinsip dari fraksinasi ammonium sulfat ini adalah proses pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting out. Penambahan (NH4)2SO4 terus menerus akan menyebabkan kelarutan enzim α-amilase dalam air akan berkurang karena enzim dan (NH4)2SO4 akan berkompetisi memperebutkan molekul air sehingga enzim lama kelamaan akan mengendap. Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan endapan protein dari larutannya. Garam (NH4)2SO4 ini dapat mengendapkan protein dengan cara menyerap molekul air. Garam ini bersifat larut dalam air, sehingga ketika ditambahkan garam ini akan menarik atau mengikat molekul air yang melarutkan protein dalam campuran, sehingga protein akan berkurang kelarutannya akibat pengikatan pelarut air oleh (NH4)2SO4. Dalam hal ini digunakan garam (NH4)2SO4 karena garam ini mempunyai beberapa keuntungan
o
antara lain yaitu kelarutan dalam air tinggi (533g/L) pada suhu 20 C, harganya murah dan pada umumnya tidak mempengaruhi struktur proein. Selain dengan (NH4)2SO4, proses salting out dapat menggunakan garam-garam lain, tetapi dalam percobaan ini garam divalen seperti MgCl2, MgSO4, lebih efektif daripada garam monovalen seperti NaCl, NH4Cl, dan KCl. Penggunaan garam yang berbeda akan mempengaruhi kelarutan enzim didalam air. Dalam hal ini, protein yang diendapkan akan lebih murni dibandingkan dengan yang tidak difraksinasi, karena pengotor seperti air tidak terendapkan. Fungsi penambahan buffer PO 4 adalah sebagai larutan penyangga agar pH-nya tidak banyak berubah. Dimana aktivitas α-amilase berada pada range pH 5,4-6,4, maka digunakan buffer PO4 dengan pH 6,1 (buffer asam). Jika pH-nya di atas pH
optimum maka enzim akan mengalami
deprotonasi atau perubahan pH baik di atas maupun di bawah pH optimum akan menyebabkan enzim terdenaturasi, sehingga aktivitas enzim menurun. Reaksi enzimatisnya adalah sebagai berikut: E
+
Enzim
S
[ES]
E
+
substrat
enzim-substrat
enzim
P produk
Pada reaksi enzimatis ini terjadi kontak antara enzim α-amilase dengan substrat dalam membentuk produk yaitu glukosa. Reaksi yang terjadi: CH2OH OH
O
CH2OH O
CH2OH O
OH
O
HO
O
+
B uf f er Fo sf a t
OH
OH
CH2OH
alfa - amilase
OH
O
CH 2OH O
OH
OH
OH
OH
HO OH
OH
Maltosa
OH
Glukosa
(Murray, 2009) Campuran selanjutnya didinginkan, untuk mencegah denaturasi protein yang mengakibatkan aktivitas enzim menurun. Tetapi jika terlalu dingin maka aktivitas enzim αamilase juga kurang optimal. Oleh karena itu pendinginan dilakukan dalam waktu kurang lebih satu jam. Proses pengadukan dilakukan dengan tujuan untuk mempercepat proses pelarutan. Semakin banyak garam ammonium sulfat yang ditambahkan maka semakin sulit atau
semakin lama waktu yang dibutuhkan untuk proses pelarutan tersebut. Karena semakin besar tingkat fraksinasinya, maka semakin besar konsentrasi enzim dan garam ammonium sulfatnya. Sehingga dengan semakin besar konsentrasi enzim tersebut, maka protein akan semakin murni/semakin cepat terhidrolisis. Dengan semakin murninya protein, maka kemampuam amonium sulfat untuk mengendapkan proten semakin kecil, karena protein tersebut sudah mengalami hidrolisis. Hasil percobaan uji kualitatif (uji adanya protein/yang berarti adanya enzim) yang dilakukan dengan penambahan amilum dan larutan iodine. Digunakan amilum sebagai substrat karena enzim α-amilase dapat menghidrolisis amilum. Penggunaan iodin adalah untuk menunjukan terjadinya hidrolisis oleh enzim α-amilase. Hasil campuran ini berwarna ungu yang lama-lama memudar, yang menunjukan adanya protein. Pada ekstrak kasar, Fraksi I, Fraksi II, dan Fraksi III setelah dilakukan penambahan amilum dan iodin larutan berwana ungu memudar, hal ini menunjukan didalam larutan tersebut terdapat protein. Sedangkan pada Fraksi IV berwana ungu kecoklatan yang lama-lama memudar, hal ini menunjukan adanya enzim α-amilase yang telah menghidrolisis amilum menjadi glukosa.
VII. PENUTUP 7.1 KESIMPULAN
1.
Enzim α-amilase dapat diperoleh dari jagung manis
2.
Pemurnian enzim tahap awal dilakukan dengan menggunakan metode fraksinasi, yaitu penambahan ammonium sulfat.
3.
Pada hasil percobaan ekstrak kasar, Fraksi I, Fraksi II, dan Fraksi III setelah dilakukan penambahan amilum dan iodin larutan berwana ungu yang memudar sedangkan pada Fraksi IV berwana ungu kecoklatan yang memudar. Hal ini menunjukan hasil positif adanya enzim α-amilase.
7.2 SARAN
1.
Penghomogenisasian
jagung
manis
dengan
air
harus
dilakukan
dengan
perbandingan volume yang sesuai, jangan terlalu encer dan jangan terlalu pekat 2.
Pada saat memeras jagung manis untuk mendapatkan filtrat harus perlahan dan hati-hati agar residu tidak terbawa dan agar enzim α-amilase yang terkandung dalam jagung manis akan menjadi sedikit karena terbawa oleh filtrat/cairan hasil perasan karena kadar air yang terlalu banyak ikut terperas.
DAFTAR PUSTAKA
Azmi, 2006, Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi Aspergillus Oryzae Untuk Isolasi Enzim Amilase Pada Medium Pati Biji Nangka, Laboratorium Kimia Jurusan PMIPA FKIP Universitas Riau, Pekanbaru Bahagiawati, 2005, Isolasi Dan Purifikasi Inhibitor α-Amilase Dari Biji Kacang Phaseolus Vulgaris, Balai Besar Penelitian Dan Pengembangan Bioteknologi, Bogor Daintith, 1994, Kamus Lengkap Kimia, Erlangga, Jakarta. Darmajana And Agustina, 2008, Pengaruh Konsentrasi Enzim α-Amilase Terhadap Sifat Fisik Dan Organoleptik Filtrat Bubur Buah Pisang, Balai Besar Teknologi Tepat Guna – Lipi, Subang Deswita, 2006, Fungsi Enzim Dalam Metabolisme, SMAN 2 Batusangkar, Batusangkar Herliyana, Nandika, Achmad, Lisdar I, And Witarto, 2008, Biodegradasi Substrat Gergajian Kayu Sengon Oleh Jamur, Dept Silvikultur, Fakultas Kehutanan, IPB, Bogor Rochima, 2005, Pemurnian Dan Karakterisasi Kitin Deasetilase Termostabil Dari Bacillus Papandayan Asal Kawah Kamojang Jawa Barat, Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran Jatinangor, Bandung
VII. LEMBAR PENGESAHAN
Semarang, 06 Desember 2012 Praktikan,
Arif Nurdiansyah 24030110141024
Delvina Maris
Dinar Fitriana Ramadhani
24030110120010
24030110141006
Resti Puteri Utami
Nyken Herlyna
24030110141018
24030110141032
Mengetahui, Asisten
Octafsari Kristiana S. J2C 009 023
LAMPIRAN
Perhitungan Fraksi Amonium Sulfat 1. Fraksi 0-25
=
2. Fraksi 25-50
=
3. Fraksi 50-75
=
4. Fraksi 75-100 =
L
x 144 gram/L = 3,6
gram
L
x 158 gram/L = 3,95 gram
L
x 176 gram/L = 4,4
L
x 198 gram/L = 4,94 gram
gram
