LAPORAN RESMI PRAKTIKUM BIOKIMIA
PERCOBAAN 1
ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL α -AMILASE
Disusun oleh: Kelompok 1 Monica Puspita Sari
24030115120004
Asisten : Safiatur Rohmag
24030113120027
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG 2017
ABSTRAK
Percobaan ‘Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim α-amilase” bertujuan untuk memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal enzim. Sampel yang digunakan adalah kecambah. Enzim α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul, baik pada amilase maupun amilopektin. Prinsip dari percobaan
ini yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada
pengendapan protein dengan cara salting-out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein). Metode yang digunakan adalah fraksinasi (yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan secara bertahap)/ dan sentrifugasi (yaitu proses pemurnian
protein
yang
didasarkan
pada
pengendapan
dengan
cara
sentrifugal/perputaran).Hasil yang diperoleh ialah suatu enzim enzim α-amilase yang telah murni. Dimana semakin besar penambahan ammonium sulfat maka semakin kecil endapan yang terbentuk, dengan kata lain enzim semakin murni.Hasil uji kualitatif setelah penambahan amilum dan larutan iodin yaitu,ekstrak kasar berwana merah kecoklatan menandakan adanya protein, Fraksi I dan II berwanamerah kecoklatan memudar yang hasil positif adanya enzim α-amilase yang menghidrolisis amilum menjadi glukosa. Tapi pada Fraksi II proses memudarnya warna ungu lebih cepat dibandingkan pada Fraksi I
Kata kunci: (Enzim α-amilase, Sentrifugasi, Fraksinasi, Kecambah)
LEMBAR PENGESAHAN
Semarang, 1 November 2017 Asisten,
Praktikan,
Safiatur Rohmag
Monica Puspita Sari
24030113120027
24030150120004
IV. DATA PENGAMATAN
No
Perlakuan
Hasil
1
Isolasi enzim α-amilase
Diperoleh
- ±200 g kecambahdi homogenisasi berwarna dengan aquades hingga halus - penyaringan dengan kain
setelah
ekstrak putih
kasar keruh
ditambahkan
yan yang
amilum
warnanya menjadi ungu kebiruan
- Filtrat disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit - Ekstrak kasar di Uji aktifitas αamilase
(Kualitatif
:
dengan
substrat amilum 1% dan larutan iodin
2
Pemurnian awal enzim α-amilase
Diperoleh ekstrak yang berupa
- Ekstrak kasar 50 ml + ammonium larutan berwarna ungu kental, sulfat
lebih kental daripada ekstrak
- Pengadukan
menggunakan kasarnya.
magnetik stirer - Pendinginan
Setelah
penambahan
iodine
- Campuran disentrifugasi
warna larutan menjadi:
- Endapan disuspensi
Fraksi 1: merah kecoklatan
- Enzim diu ji aktifitas α-amilase Fraksi 2: merah kecoklatan (Kualitatif amilum 1%)
:
dengan
substrat
VI. PEMBAHASAN
Percobaan ini berjudul Isolasi dan Pemurnian Enzim α Amilase dengan tujuan untuk memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal. Sampel yang digunakan adalah kecambah karena mengandung enzim α amilase. Enzim α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul, baik pada amilase maupun amilopektin. Pada proses isolasi enzim α amylase. Prinsip dari percobaan ini yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein). Metode yang digunakan adalah fraksinasi dan sentrifugasi. Fraksinasi adalah pemisahan dengan cara pengendapan secara bertahap. Fraksinasi digunakan sebagai teknik pemisahan komponen organik dan ionik (larut dalam air) dalam suatu senyawa campuran menjadi dua fraksi. Sentrifugasi yaitu suatu teknik pemisahan yang dilakukan berdasarkan partikel dalam medan gaya sentrifugal. Tabel 1. Kandungan Gizi Kecambah per 100 gram Kalori (kcal) 22 Jumlah Lemak 0,7 g Lemak jenuh 0,1 g Lemak tak jenuh ganda 0,4 g Lemak tak jenuh tunggal 0,1 g Kolesterol 0 mg Natrium 6 mg Kalium 79 mg
Jumlah Karbohidrat 2,1 g Serat pangan 1,9 g Gula 0,2 g Protein 4 g Vitamin A
155 IU Vitamin C
8,2 mg
Kalsium
32 mg
Zat besi
1 mg
Vitamin D
0 IU
Vitamin B6
0 mg
Vitamin B12 0 µg
Magnesium 27 mg (Direktorat Gizi Depkes RI, 1981)
6.1. Isolasi Enzim α -amilase
Dalam percobaan ini digunakan kecambah. Kecambah terlebih dahulu dihaluskan
menggunakan blender dengan tujuan agar dinding sel hancur
sehingga semua komponen yang terkandung dalam kecambah dapat keluar termasuk enzim α-amilase. Penghomogenan dengan aquades dikarenakan enzim α-amilase larut dalam pelarut air karena sifat keduanya yang sama-sama polar, struktur enzim α-amilase adalah:
Gugus OH yang terikat pada atom C itulah yang menyebabkan enzimα-amilase menjadi bersifat polar, seingga dapat berikatan dengan molekul air melalui ikatan hidrogen
Karena enzim dapat larut dalam aquadest, maka enzim α-amilase akan terkandung didalam filtrat setelah dilakukan penyaringan. Pelarutan dengan pelarut organik lainnya sebenarnya dapat dilakukan, namun hal dapat mengganggu karena adanya pendenaturasian dengan gugus-gugus tertent. Misalnya pelarut alkohol. Pelarut alkohol seperti air tetapi karena pH yang tidak sesuai yaitu < 7 maka akan menyebabkan enzim terdenaturasi. Mekanisme pendenaturasian protein: 1. Denaturasi Protein karena Panas Panas dapat memutuskan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar yang menopang struktur sekunder dan tersier molekul protein. Hal ini disebabkan suhu yang tinggi meningkatkan energi kinetik sehingga menyebabkan molekul penyusun protein bergetar sangat cepat yang mengakibatkan sisi hidrofobik dari gugus samping molekul polipetida akan terbuka. 2. Denaturasi Protein karena Asam dan Basa Asam dan basa dapat memutuskan jembatan garam pada struktur tersier protein. Hal ini dsebabkankan asam dan basa akan terdisosiasi menjadi produk bermuatan ionik. Mekanisme denaturasi berlangsung ketika terjadi reaksi substitusi antara ion positif dan negatif di dalam garam dengan ion positif dan negatif yang berasal dari asam atau basa yang ditambahkan.
3. Denaturasi Protein karena Logam Berat Reaksi yang terjadi pada logam berat dengan protein mengakibatkan terbentuknya protein logam yang tidak larut. Protein akan mengalami presipitasi bila bereaksi dengan ion logam. Pengendapan oleh ion positif (logam berat) diperlukan pH larutan di atas pI karena protein bermuatan negative begitu pula sebaliknya. Ion-ion positif tersebut adalah : Ag+, Ca 2+, Zn2+, Hg2+, Fe2+, Cu2+ dan Pb2+. Sedangkan ion-ion negatif meliputi : ion salisilat, triklorasetat, piktrat, tanat dan sulfosalisilat. Logam berat juga merusak ikatan disulfida karena afinitasnya yang tinggi dan kemampuannya untuk menarik sulfur sehingga mengakibatkan denaturasi protein. Setelah diperas, kemudian kita ambil filtratnya dan masukan dalam 4 wadah dengan volume yang sama. Filtrat disentrifugasi 2 rpm selama 10 menit untuk memisahkan supernatan dari residunya. Partikel yang berbeda dalam berat jenis, ukuran, dan bentuk akan mengendap searah dengan gaya sentrifugal dengan kecepatan yang berbeda. Kecepatan tergantung dengan gaya sentrifugal yang mengenai partikel searah dengan jari-jari radial ke arah luar (menjauhi sumbu) (Lehninger, 1999). Partikel yang dihasilkan sedikit dipengaruhi oleh rpm yang tinggi dan membutuhkan waktu yang lama. Hal ini berarti molekul/senyawa yang memiliki berat molekul yang besar akan mengendap sebagai residu sedangkan molekul/senyawa yang memiliki berat molekul yang kecil akan terkandung di dalam filtrat. Enzim α-amilase akan terkandung di dalam filtrat, sedangkan serat – serat kasar dari sampel kecambah menjadi residunya. Residu yang terbentuk berupa karbohidrat, kalori, serat zat besi, kalsium, vitamin A, vitamin C dsb. Supernatan ini merupakan ekstrak kasar enzim yang diperkirakan mengandung enzim α-amylase. Enzim kasar yang diperoleh tersebut disimpan terlebih dahulu dalam botol vial yang nantinya akan diuji kualitatif.
6.2 Pemurnian Awal Enzim α -amilase
Proses pemurnian tahap awal enzim α-amilase dilakukan dengan fraksinasi dengan menggunakan ammonium sulfat terhadap ekstrak enzim αamilase yang dilakukan dengan penambahan garam untuk mengendapkan protein. Prinsip dari fraksinasi ammonium sulfat ini adalah proses pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting out.Salting out merupakan keadaan apabila ditambahkan garam yang berkonsentrasi tinggi maka kelarutan protein akan menurun pada titik dimana protein akan terpresipitasi dengan sempurna dari larutan (Lehninger, 1999). Proses pemurnian dilakukan secara bertahap dengan berbagai fraksi dengan tujuan untuk memperoleh enzim yang benar- benar merupakan enzim αamilase. Dengan demikian dapat diketahui secara pasti enzim α-amilase akan terendapkan secara optimum pada berapa banyak kadar garam (NH4)2SO4 yang ditambahkan. Tahap selanjutnya adalah pemurnian awal enzim α-amilase yang didapatkan dari enzim kasar, sebanyak 50 ml diambil kemudian ditambahkan amonium sulfat, proses ini disebut sebagai fraksinasi amonium sulfat terhadap ekstrak enzim α-amilase. Fraksinasi amonium sulfat adalah proses pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein tahap awal dengan cara penambahan garam. Pada percobaan ini garam yang digunakan adalah garam ammonium sulfat, karena garam ammonium sulfat ini merupakan garam divalent. Dalam hal ini digunakan garam (NH4)2SO4 karena garam ini mempunyai beberapa keuntungan antara lain yaitu kelarutan dalam air tinggi (533g/L) pada suhu 20oC, harganya murah dan pada umumnya tidak mempengaruhi struktur proein. Garam ini dapat diganti deng an garam lainnya, tetapi garam tersebut harus garam divalent misalnya CaCl2 (Brayer, 1995), tetapi dalam percobaan ini garam divalen seperti MgCl2, MgSO4, lebih efektif
daripada garam monovalen seperti NaCl, NH4Cl, dan KCl. Penggunaan garam yang berbeda akan mempengaruhi kelarutan enzim didalam air. Dalam percobaan ini dipilih variasi fraksi amonium sulfat 0-20 dan fraksi 20-40, dimana variasi fraksi tersebut bertujuan untuk memperoleh enzim yang benar- benar merupakan enzim α-amilase. Dengan demikian dapat diketahui secara pasti enzim α-amilase akan terendapkan secara optimum pada berapa banyak kadar garam (NH4)2SO4 yang ditambahkan. Dalam hal ini digunakan garam
(NH4)2SO4
karena garam ini
mempunyai beberapa keuntungan antara lain yaitu kelarutan dalam air tinggi (533g/L) pada suhu 20oC, harganya murah dan pada umumnya tidak mempengaruhi struktur proein. Garam ini dapat diganti den gan garam lainnya, tetapi garam tersebut harus garam divalent misalnya BaCl2 (Brayer, 1995). Penggunaan garam yang berbeda akan mempengaruhi kelarutan enzim didalam air. Campuran didinginkan, fungsinya untuk mencegah denaturasi protein yang mengakibatkan aktivitas enzim menurun. Tetapi jika terlalu dingin ma ka aktivitas enzim α-amilase juga kurang optimal. Oleh karena itu pendinginan dilakukan dalam waktu kurang lebih 30 menit. Proses pengadukan dengan stirer dilakukan dengan tujuan untuk mempercepat proses pelarutan. Semakin banyak garam ammonium sulfat yang ditambahkan maka semakin sulit atau semakin lama waktu yang dibutuhkan untuk proses pelarutan tersebut. Karena semakin besar tingkat fraksinasinya, maka semakin besar konsentrasi enzim dan garam ammonium sulfatnya. Sehingga dengan semakin besar konsentrasi enzim tersebut, maka protein akan semakin murni/semakin cepat terhidrolisis. Dengan semakin murninya protein, maka kemampuam amonium sulfat untuk mengendapkan protein semakin kecil, karena protein tersebut sudah mengalami hidrolisis.
Endapan
enzim
tersebut
dapat
dipisahkan
dengan
melakukan
sentrifugasi kembali. Endapan yang dihasilkan merupakan enzim α-amilase fraksi I, yang kemudian disuspensikan dengan buffer fosfat. Fungsi penambahan buffer fosfat adalah sebagai larutan penyangga agar pH-nya tidak berubah. Aktivitas α-amilase berada pada range pH 5,4-6,4, maka digunakan buffer fosfat dengan pH 6,1 (buffer asam), di mana pH ini merupakan pH optimum aktivitas α-amilase. Filtrat yang dihasilkan dari sentrifugasi fraksi I (0-20) tersebut kemudian digunakan sebagai bahan fraksinasi yang kedua (20-40). Prosesnya sama seperti pada proses fraksinasi pertama, namun untuk fraksi kedua ini ditambahkan amonium sulfat sebesar 5.78 gram karena besarnya volume yang dihasilkan berbeda. Setelah diperoleh endapan dari fraksi I dan II, selanjutnya dilakukan analisis kualitatif terhadap kedua sampel tersebut dan juga pada ekstrak kasarnya. Analisis kualitatif ini dilakukan dengan menambahkan amilum dan larutan iodin. Digunakannya amilum karena enzim α-amilase sendiri dapat menghidrolisis amilum. Sedangkan ditambahkannya iodin digunakan untuk menunjukan terjadinya hidrolisis oleh enzim α-amilase.Pada tahap awal amilum ditambahkan iodin dengan volume yang sama yang nantinya akan digunakan sebagai larutan pembanding (kontrol). Hasil yang diperoleh menjukkan bahwa pada fraksi pertama dan kedua saat ditambahkan iodin tidak terjadi perubahan warna, setelah penambahan amilum terjadi perubahan warna menjadi merah kecoklatan. Sedangkan untuk ekstrak kasarnya saat diuji kualitatif didapatkan warna ungu. Dalam ekstrak kasar diperoleh hasil larutan yang berwarna ungu, dimana hasil tersebut menunjukkan uji positif dan menandakan bahwa dalam ekstrak kasar masih terdapat enzimnya. Warna ungu terjadi karena adanya pembentukan kompleks amilum iodin. Setelah itu larutan ditunggu selama 15 menit untuk melihat terjadinya perubahan warna.
Setelah diamati perubahan warna untuk fraksi
I dan II warna ungunya
menjadi pudar. Sedangkan yang membedakannya adalah proses perubahan warna pada fraksi I lebih lama dibandingkan fraksi II. Untuk reaksi-reaksi yang terjadi dapat dilihat dibawah ini: a. Reaksi uji positif enzim α amylase Warna ungu terjadi karena adanya pembentukan kompleks amilum iodin. Hasil yang diperoleh adalah terbentuknya warna ungu yang memudar. Hal ini menunjukan bahwa setelah terhidrolsis amilum akan berubah menjadi glukosa dan I- akan terlepas. Sehingga warna ungu akan memudar. CH2 OH
CH 2OH
O
O
OH
+
OH
H2O
enzim amilase
water O
O
O
n OH
OH
2-(((4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(methoxymethyl)tetrahydro-2 H pyran-3-yl)methoxy) methyl)-6-(hydroxymethyl)-5-(methoxym ethyl)-5methyltetrahydro-2 H -pyran-3,4-diol
CH2 OH
O
OH
+
OH
Iiodide
OH
OH
6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2 H -pyran2,3,4,5-tetraol
(Fessenden, 1999) b. Reaksi pemecahan (hidrolisis) amilum menjadi glukosa
(Brayer, 1995)
VII. PENUTUP 7.1 Kesimpulan
7.1.1 Enzim α-amilase dapat diperoleh dari kecambah 7.1.2 Pemurnian tahap awal enzim α-amilase dapat dilakukan dengan fraksinasi amonium sulfat. 7.1.3 Pada hasil percobaan ekstrak kasar setelah dilakukan penambahan amilum dan iodin larutan berwana ungu yang memudar sedangkan pada Fraksi I dan II berwana merah kecoklatan yang memudar. Hal ini menunjukan hasil positif adanya enzim αamilase. 7.1.4 Lama waktu yang diperlukan untuk Fraksi I mengalami perubahan membutuhkan waktu yang lebih lama dibandingkan dengan terjadinya perubahan warna pada Fraksi II.
7.2 Saran
7.2.1 Sebaiknya untuk praktikum selanjutnya dapat digunakan sampel lain selain kecambah sebagai sumber enzim α-amilase nya, sehingga praktikan tidak hanya cuma mengetahui kandungan enzim α-amilase dalam kecambah. 7.2.2 Penghomogenisasian kecambah dengan air harus dilakukan dengan perbandingan volume yang sesuai, jangan terlalu encer dan jangan terlalu pekat 7.2.3 Untuk semua peralatan yang digunakan pastikan sudah dicuci dan bersih
DAFTAR PUSTAKA
Brayer GD, Yaoguang L, Withers SG. 1995. The str ucture of human pancreatic αamylase at 1.8 A resolution and comparisons with related enzymes. Protein Science Direktorat Gizi Departemen Kesehatan RI. 1981. Daftar Komposisi Bahan Makanan: Jakarta Fessenden, R.1999. Kimia Organik .Erlangga : Jakarta Lehninger. 1999. Biokimia Dasar . Erlangga :Jakarta Murray, R. K., Granner, D. K., & Rodwell, V. W. 2009. Biokimia harper (27 ed.). Jakarta: Buku Kedokteran EGC. Suarni dan Rauf Patong. 2007. Potensi Kecambah Kacang Hijau sebagai SumberEnzim α-Amilase. J. Chem.7 (3) : 332-336
LAMPIRAN
A. Perhitungan Fraksinasi Amonium Sulfat Rumus yang digunakan :
=
1000
×
Keterangan: Nilai fraksinasi di sesuaikan dengan tabel fraksinasi dengan garam ammonium sulfat pada berbagai tingkat kejenuhan. Tingkat kejenuhan fraksi 1 = 0-20 Tingkat kejenuhan fraksi 2 = 20-40 Fraksi 1 Diketahui : V filtrat = 50 mL Fraksinasi (NH4)2SO4 = 114 gram/L Ditanya : massa (NH4)2SO4=….? Dijawab : Fraksi 0 – 20 = 50/1000L x 114 gram/L = 5,7 gram
Fraksi 2 Diketahui : V filtrat = 47 mL Fraksinasi (NH4)2SO4 = 123 gram/L Ditanya : massa (NH4)2SO4=….? Dijawab : Fraksi 20 – 40 = 47 /1000 L x 123 gram/L = 5,781 gram
B. Lampiran foto
Sampel yang berisi iodin dan amilum dan filtrate hasil sentrifugasi fraksi 2
Sampel yang digunakan untuk percobaan
Keterangan gambar berdasarkan urutan dari kiri ke kanan : 1. Pembanding : isinya iodin dan amilum 2. Ekstrak kasar : ekstrak kasar yg diperoleh ditambah iodin dan amilum 3. Fraksi 2 : hasil dari sentrifugasi fraksi 2, filtratnya diambil ditambahi dengan iodin dan amilum. Ditunggu hingga warna ungu nya agak pudar 4. Fraksi 1 : isi dalam tabungnya han ya filtrate dari hasil sentrifugasi fraksi 1
