PERCOBAAN 6 PEMURNIAN PROTEIN I. Tujuan 1. Memahami metode pemurnian protein. 2. Memisahkan protein dengan metode salting out. 3. Mengetahui cara mengisolasi protein. 4. Mengetahui cara pemisahan suatu protein dari protein lain ataupun suatu senyawa lain, berdasarkan perbedaan berat molekul dengan menggunakan cara kromatografi gel penyaring molekul sederhana. II. Prinsip 1. Teknik pemurnian ekstrak kasar dengan presipitasi protein oleh (NH 4)2SO4 karena terjadinya Salting Out. 2. Teknik Gel Filtration Chromatography, permisahan protein dari (NH 4)2SO4 dan senyawa lainnya berdasarkan perbedaan ukuran. III. Teori dasar Dalam melakukan berbagai studi maupun tes di laboratorium, sering kali diperlukan protein tertentu yang murni dari pelarut maupun molekul lain. Teknik purifikasi dan isolasi protein yang klasik digunakan ialah teknik salting out . Awalnya, teknik ini umum digunakan dalam usaha fraksinasi protein. Namun, metode ini tidak memberikan tingkat diskriminasi yang tinggi dan jarang memberikan hasil berupa fraksi yang murni. Sekarang, metode salting out ini digunakan sebagai cara yang cukup murah untuk mengkonsentrasikan ekstrak protein dari sebuah larutan. Solubilitas protein dalam sebuah larutan dipengaruhi oleh konsentrasi garam yang ada di dalam larutan tersebut. Efek ini muncul karena adanya interaksi
antara ion-ion garam dengan gugus bermuatan pada protein. Adisi garam ke dalam larutan bisa menyebabkan dua hal yang berbeda. Pada beberapa larutan dengan protein yang tidak dapat atau sulit untuk larut dalam akuades, adisi garam dalam jumlah kecil bisa menyebabkan protein tersebut larut. Fenomena ini disebut salting in. Apabila adisi garam dilanjutkan, akan terdapat suatu titik dimana adisi lebih lanjut dari garam tidak akan menambah solubilitas protein, malah akan menyebabkan presipitasi dari protein. Fenomena ini disebut salting out . Garam yang paling sering digunakan dalam metode ini adalah ammonium sulfat [(NH4)2SO4]. Penggunaan ini didasarkan pada fakta bahwa secara empiris, anion polivalen lebih efektif daripada anion univalen dalam salting out . Sedangkan, kation polivalen cenderung menghilangkan efek dari anion polivalen. Dapat disimpulkan bahwa kombinasi terbaik bagi garam yang akan digunakan untuk salting out ialah kombinasi antara anion polivalen dan kation univalen. Anion anion sendiri dapat disusun berdasarkan efektivitasnya dalam proses salting out ( Hofmeister series). Urutan daripada anion dari efektivitas tinggi ke rendah yakni: Sitrat > Sulfat > Fosfat > Klorida > Nitrat > Tiosianat
Dari Hofmeister series ini, sitrat adalah anion terbaik yang dapat digunakan dalam salting out . Namun, ammonium sulfat [(NH 4)2SO4] lebih umum digunakan karena solubilitasnya yang tinggi dan kemudahan mendapatkan bentuk murninya dengan biaya rendah. Selain itu, ammonium sulfat tidak memiliki efek toksik terhadap berbagai enzim. Hofmeister series juga merupakan susunan anion berdasarkan efek stabilisasi terhadap protein. Semakin ke kiri maka tingkat kosmotropy (kemampuan stabilisasi protein) semakin meningkat sedangan semakin ke kanan tingkat chaotropy (kemampuan destabilisasi protein) semakin meningkat. Proses salting in, faktor yang memainkan peran penting ialah ionic strength dari garam yang digunakan. Ionic strength dapat dirumuskan sebagai berikut:
ci = konsentrasi dari tiap ion garam (mol/liter) z i = muatan dari setiap ion garam. Ionic strength berefek pada konsentrasi garam yang rendah (0->0,2M). Pada ionic strength lemah, solubilitas protein berada pada tingkat minimum pada pI protein. Pada pH ini, gaya elektrostatis intramolekular antara rantai samping asam amino berada pada tingkat maksimum dimana konformasi protein sangat ketat dan hidrasi protein pada tingkat minimum. Pada pH selain pI, titrasi dari gugus-gugus yang bisa diionisasi mengarah pada pengurangan interaksi intramolekular. Hal ini mengakibatkan struktur protein lebih terelaksasi dan solubilitas serta hidrasi protein meningkat. Adisi garam memiliki efek yang sama dengan perubahan pH. Kedua efek ini bersifat kumulatif.
Grafik 1. Kurva solubilitas protein terhadap pH pada penambahan garam. 1
Pada konsentrasi lebih dari 0,2 M, sifat kosmotropy berperan dalam mengurangi solubilitas protein. Peran kosmotrop dalam menstabilisasi protein terletak pada efeknya yang membuat struktur protein menjadi lebih ketat dan kompak. Proses kerja garam (khususnya ammonium sulfat) dalam stabilisasi protein bisa dijelaskan berdasarkan interaksi hidrofobik protein. Amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam larutan dapat dilarutkan dengan cepat oleh air karena afinitasnya yang tinggi. Pada adisi lebih lanjut, jumlah molekul air yang tersedia
untuk melarutkan ammonium sulfat semakin berkurang hingga mencapai pada suatu titik dimana semua molekul air telah habis terpakai. Pada adisi lebih lanjut, molekul air akan terikat lemah pada gugus hidrofobik protein untuk digunakan dalam pelarutan garam. Hal ini menyebabkan bagian hidrofobik protein terekspos pada air dan untuk mengurangi efek ini, protein membentuk agregat yang kompak dan stabil. Perubahan solubilitas protein pada proses salting in atau salting out dapat diprediksi dengan menggunakan persamaan semiempiris Cohn, yaitu:
C s
= Solubilitas protein di dalam air.
C’ s
= Solubilitas protein dalam larutan garam.
β
= Rasio solubilitas protein pada titik isoionik.
I
= Ionic strength garam.
Ks
= Konstanta.
Perlu diperhatikan bahwa efek salting in dan salting out berlangsung secara bersamaan pada adisi garam. Dengan mempertimbangkan hal ini, persamaan semiempiris Cohn dapat diturunkan menjadi:
Kin
= konstanta salting-in.
Kout
= konstanta salting-out .
Apabila tingkat salting-out lebih besar, solubilitas protein akan menurun. Sebaliknya, apabila tingkat salting-in lebih besar, solubilitas protein akan naik. Suatu molekul yang larut dalam air berarti molekul tersebut bereaksi dengan air dengan membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar merata diantara molekul air. Dengan adanya muatan dalam molekul air, akan meningkatkan kelarutan karena adanya muatan yang saling menjauhi dan mencegah terbentuknya agregasi molekul.
Protein adalah senyawa yang mempunyai berat molekul yang besar dan mudah larut. Protein dapat mudah larut karena protein mempunyai gugus – NH- & – COyang ada pada ikatan peptida yang dapat berikatan dengan air. Pada muatan yang sama dalam 2 partikel molekul protein yang sama akan bertolakan sehingga membantu meningkatkan kelarutan protein ( salting in). Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul protein sangat mengurangi kelarutan protein sehingga protein menjadi mengendap. Pada larutan berkonsentrasi tinggi, menetralkan muatan pada protein sehingga membuat protein mengendap. Namun perubahan ini bersifat reversibel karena cara ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein. Amonium sulfat digunakan karena mudah larut sehingga dapat diperoleh amonium sulfat dengan range konsentrasi yang cukup luas.
Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk memisahkan komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak/mobil. Fasa diam berupa padatan/cair yang dilapiskan pada padatan/gel. Pada pemisahan ini senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan dalam sistem yang bergerak mengalir melalui suatu sistem yang diam, dan selama pengaliran fasa mobil akan terjadi pelarutan, adsorpsi, dan penguapan. Pada prinsipnya semua cara pemisahan kromatografi mengalami proses yang sama yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam fasa diam dan fasa gerak dengan memanfaatkan perbedaan- perbedaan sifat-sifat fisik komponen yang hendak dipisahkan. Perbedaaan sifat tersebut diantaranya : 1. Kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut 2. Sifat untuk bertaut (adsorpsi) yang berbeda satu sama lain dengan suatu serbuk bahan padat 3. Sifat dapat menguap pada temperatur yang berbeda satu sama lain. Kromatografi Penyaringan Gel, merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan
yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya. Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan. Metode ini digunakan untuk memisahkan garam ammonium sulfat yang digunakan pada tahap fraksinasi maupun molekul kecil lainnya dengan protein yang dikehendaki. Ammonium sulfat perlu dipisahkan karena akan mengganggu proses pemurnian selanjutnya. Kromatografi ini memisahkan berdasarkan perbedaan ukuran, dimana molekul yang berukuran kecil akan terjerap dalam fasa diam yang berupa butiran berpori, sementara molekul yang besar dapat lolos dan keluar dari kolom bersama fasa gerak
Enzim laktat dehidrogenase (LDH) merupakan enzim yang berperan penting dalam metabolisme laktat.Enzim LDH mengkatalisis reaksi irreversibel piruvat menjadi laktat yang tergantung pada kofaktor nikotinamida.
Dalam reaksi ini, hidrogen dari molekul NADH ditransfer ke molekul piruvat. Hal ini menghasilkan karbon-oksigen ikatan rangkap yang dikurangi menjadi ikatan karbon-oksigen tunggal dengan penambahan atom hidrogen. Hasilnya adalah molekul laktat. Dari produk laktat, asam laktat dapat dibentuk, IV. Alat & bahan Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah tabung sentrifugasi 50 mL, blender, tabung mikrosentrifugasi, pipet tetes, tabung falcon, beaker glass dan rak tabung reaksi.
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah pengekstraksi (Tris -HCl pH 7.4,
2-Mercaptoethanol,
Phenylmethylsulfonyl
fluoride,
Ethylenediamine
tetraacetic acid), ammonium sulfat dan daging ayam. V. Prosedur 1. Presipitasi LDH dari ayam dengan Ammonium Sulfat Di Potong 5 gram daging ayam, di masukkan potongan dada ayam dan 75 ml dapar pengekstraksi ke dalam blender, di hancurkan jaringan dengan homogenasi (nyalakan blender dengan diberi jeda untuk menurunkan temperatur homogenate). Di Masukkan homogenate ke dalam tabung sentrifugasi 50 ml, lalu di masukkan tabung tersebut ke dalam sentrifugasi selama 20 menit pada 15.000 rpm. Setelah di sentrifugasi selesai, ambil supernatannya menggunakan pipet lalu ukur dan catat volume supernatan yang diperoleh. Secara perlahan di tambahkan 0,39 gram ammonium sulfat per ml supernatan ke dalam supernatan tersebut, lalu di aduk dengan menggunakan pengaduk magnet (pengadukan dilakukan pada suhu dingin) selama 15 menit. Di sentrifugasi kembali dengan hal yang sama, lalu di pisahkan supernatan dan pellet pada tempat yang berbeda. Selanjutnya di simpan pada lemari es untuk tahap pemurnian. 2. Kromatografi Resuspensi pellet ammonium sulfat – di tambahkan 1 ml dapar Tris -PMSF ke pellet ammonium sulfat. perlahan aduk campuran tersebut hingga semua pellet larut. Pencampuran dilakukan diatas es. Di periksa volume larutan. Memasukkan larutan resuspensi ke dalam kolom desalting – ketika
mendapatkan kolom, bagian atas frit akan ada larutan dapa, buang larutan tersebut. Kemudian masukkan sampel ke dalam kolom, buang cairan yang keluar dari kolom. Elusi protein dari kolom desalting – masukkan 4 ml dapar Tris-PMSF ke dalam kolom dan tampung cairan yang keluar dari kolom (cairan ini mengandung protein LDH, maka simpan di atas es. Catat volume cairan yang keluar dari kolom. Simpan 3 x 0,1 ml aliquot hasil elusi tadi. Masukkan fraksi ammonium sulfat desalted ke dalam kolom cibacron blue. Pencucian Tris-PMSF #1 – ketika semua cairan telah masuk dan keluar lagi dari kolom, isi kolom dengan dapar Tris -PMSF, dilanjutkan dengan menampung 5 ml fraksi. Ukur serapan fraksi yang ditampung pada 280 nm hingga serapannya lebih dari 0,1 dibanding serapan dapar Tris -PMSF. (serapan terutama diberikanoleh protein yang tercuci dari kolom). Pencucian NAD – setelah sisa dapar Tris-PMSF dibuang dengan pipet, tambahkan 10 ml NAD ke dalam kolom. Lanjutkan dengan menampung 5 ml fraksi. Pencucian Tris-PMSF #2 – ketika semua cairan telah masuk dan keluar lagi dari kolom, isi kolom dengan dapar Tris -PMSF, dilanjutkan dengan menampung 5 ml fraksi. Ukur serapan fraksi yang ditampung pada 280 nm hingga serapannya lebih dari 0,1 dibanding serapan dapar Tris -PMSF. (serapan terutama diberikanoleh protein yang tercuci dari kolom). Pencucian NADH – setelah sisa dapar Tris-PMSF dibuang dengan pipet, tambahkan 10 ml NADH ke dalam kolom. Lanjutkan dengan menampung 5 ml fraksi. Pencucian Tris-PMSF #3 – ketika semua cairan telah masuk dan keluar lagi dari kolom, isi kolom dengan dapar Tris -PMSF, dilanjutkan dengan
menampung 5 ml fraksi. Ukur serapan fraksi yang ditampung pada 280 nm hingga serapannya lebih dari 0,1 dibanding serapan dapar Tris -PMSF. (serapan terutama diberikanoleh protein yang tercuci dari kolom). Tutup fraksi – fraksi yang ditampung dengan parafilm dan simpan di lemari es pada suhu 4 oC. VI. Hasil Pengamatan Presipitasi LDH dari ayam dengan Ammonium Sulfat Pada percobaan ini bahan yang digunakan adalah daging dada ayam sebanyak 5 gram dan dapar Tris-HCl sebanyak 25 ml. Hasil supernatan yang diperoleh sebanyak 2 ml, dimana ammonium sulfat yang ditambahkan sebanyak (NH4)2SO4 0,39 gram x 2 ml = 0,78 gram.
Gambar hasil supernatan
VII. Pembahasan Praktikum isolasi protein kali ini menggunakan protein dari organ dada ayam. Pertama-tama organ jantung tersebut dihilangkan lemaknya dan dipotong kecil kecil, kemudian digerus sampai halus. Penggerusan ini bertujuan agar kita memperoleh protein dari organ jantung tersebut maka protoplasma akan keluar dan akan diperoleh protein, sebab didalam protoplasma tersebut terkandung protein.Setelah digerus sampai halus, organ tersebut dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge dan diberi Buffer Tris HCl yang bertindak sebagai larutan penyangga protein agar tidak rusak. Selain itu Buffer Tris HCl juga menjaga pH agar selalu tetap. Kemudian larutan yang bercampur disentrifuge 30 menit. Tujuannya untuk memisahkan protein berdasarkan berat jenisnya. Dengan daya gravitasi tinggi, sedimentasi molekul berbanding lurus dengan berat molekul dan bentuknya dengan senyawa terutama protein. Suatu molekul dengan berat molekul berbagai senyawa terutama protein. Suatu molekul dengan berat molekul besar akan berada dibawah menjadi pellet, sedangkan molekul dengan berat molekul yang kecil akan berada diatas menjadi supernatan. Hasil sentrifuge yang pertama ini diambil supernatannya karena di dalam supernatan inilah terdapat protein. Supernatan yang diambil kemudian dicampur dengan Amonium Sulfat/ (NH4)2SO4 yang berfungsi untuk mengkonsentrasikan protein yang ada pada protein. kemudian campuran tersebut diresuspensikan ke dalam es ± 10-15 menit. Hal ini dilakukan agar dengan suhu yang rendah akan memudahkan protein berikatan dengan Amonium Sulfat, sehingga berbentuk larutan yang agak pekat sedangkan apabila pada suhu rendah akan mengakibatkan turunnya daya larut protein.Setelah diresuspensikan larutan tersebut disentrifuge kembali. Pada sentrifuge kedua ini yang diambil adalah
pelletnya. Pellet tersebut dihasilkan dari protein yang berikatan dengan (NH4)2SO4. Untuk
percobaan
pemisahan
protein
dengan
metode
Gel
Filtration
Chromatography tidak di lakukakan. Pemisahan protein enzim dengan teknik kromatografi filtrasi gel adalah proses lanjut dari proses pemurnian ekstrak kasar presipitasi protein oleh (NH4)2SO4. Pemurnian protein menggunakan kromatografi kolom filtrasi gel. Pada percobaan ini saya mengambil dari literature dari Jurnal Natur Indonesia 12(2), April 2010: 124-129 ISSN 14109379, Keputusan Akreditasi No 65a/DIKTI/Kep./2008 Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Lipase. Fraksi endapan amonim sulfat yang memiliki unit aktivitas yang paling tinggi dilanjutkan pemurniannya dengan metode filtrasi gel. Pembuatan kolom pada prcobaan ini menggunakan sephadex G150. Langkah pembuatannya tepung sephadex G150 dikembangkan dengan akuades dan diinkubasi pada suhu kamar. Suspensi ini dibiarkan sampai mengendap. Gel yang mengapung dibuang, sedangkan gel yang mengendap dijaga agar tetap terendam dalam akuades. Gelembung-gelembung udara yang terdapat di dalam partikel- partikel gel dikeluarkan dengan cara mengurangi tekanan udara diatas permukaan suspense menggunakan pompa vakum. Gel kemudian direndam dalam buffer tris HCl pH 7,2. Kelebihan buffer di atas gel yang mengendap disisakan lebih kurang 1 cm. Gel diaduk perlahan-lahan dan dimasukan lewat batang pengaduk ke dalam kolom gelas dengan panjang 30 cm dan diameter 2,5 cm dan buffer tris HCl pH 7,2 setinggi 5 cm. Gel dibiarkan mengendap semuanya. Pemurnian Lipase dengan Kolom Sephadex G-150. Sebanyak 5 ml fraksi hasil dianalisis dengan aktivitas tertinggi dimasukkan ke dalam kolom dengan hati-hati agar gel tidak rusak. Kolom dihubungkan dengan sumber eluen lewat pipa plastik. Kolom Sephadex G-150 yang terjadi dielusi dengan buffer pengembangnya dengan kecepatan tetesan 6 menit per tetes. Kran kolom kaca dibuka, eluat ditampung dalam botol ampul sebanyak 100 buah. Semua eluat ditentukan aktivitas, aktivitas spesifik dan kadar proteinnya. Fraksi yang mempunyai aktivitas paling tinggi selanjutnya ditentukan tingkat kemurnian dan
beberapa karakteristiknya meliputi pH optimum, suhu optimum, pengaruh beberapa logam berat. Pemurnian Lipase Menggunakan Kromatografi Kolom Gel Filtrasi. Fraksi 45% amonium sulfat dengan kemurnian tertinggi dilanjutkan dengan pemurnian menggunakan kromatografi kolom filtrasi gel. Pemisahan protein enzim pada metode ini didasarkan atas perbedaan ukuran molekul protein melalui sebuah kolom yang dinamakan sephadex. Sephadex terbuat dari protein berhidrat tinggi dengan pori- pori yang sangat halus. Molekul protein yang kecil dapat menembus pori- pori dan tertahan selama aliran ke bawah kolom. Molekul protein yang lebih besar akan terelusi lebih dahulu oleh pelarutnya disusul molekul yang lebih kecil, sehingga dapat terjadi pemisahan fraksi berdasarkan ukuran
molekul.
Kecepatan
aliran
molekul
protein
tergantung
dari
kemampuannya memasuki pori- pori. Kolom kromatografi yang digunakan adalah sephadex G-150 dengan eluen buffer Tris-HCl pH 7,2.Hasil fraksinasi terlihat pada Gambar 2, yang mempunyai dua fraksi dengan aktivitas lipase tinggi, yaitu fraksi 24 dengan aktivitas 2880 U/ml dan fraksi 37 dengan aktivitas 2560 U/ml. Fraksi 24 selanjutnya dilakukan karakterisasi apabila ingin melakukan pemurnian protein lebih lanjut. VIII. Kesimpulan 1. Pemurnian LDH (Laktat Dehidrogenase) dari bagian daging dada ayam. Metode yang digunakan metode presipitasi protein dengan ammonium sulfat. 2. Kolom kromatografi gel penyaring dapat memisahkan molekul berdasarkan perbedaan berat molekul dengan menggunakan penyaring molekuler. 3. Hasil supernatan yang diperoleh sebanyak 2 ml dan ammonium sulfat yang harus ditambahkan sebanyak 0,78 gram.
Daftar pustaka
Murray, Robert K. Granner, Daryl K. Rodwell, Victor W. Biokimia Harper . 27th ed. Jakarta.Penerbit Buku Kedokteran EGC: 2006. Cantarow and Schepartz, 1963, Biochemistry, W.B Saunders Company, Philadelphia. Kleiner and Orten, 1962, Biochemistry, The C.V. Mosby Company, St. Louis. Holme,
D.J
and
Peck
Hazel,
1993, Analytical
Biochemistry
Second
Edition, Longman Scientific & Technical, New York. Montgomery. R. dkk, 1993, BIOKIMIA Suatu Pendekatan terorientasi Kasus, Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
