ABSTRAK Percobaan Percobaan aktivitas aktivitas spesifik spesifik enzim α-amilase α-amilase bertujuan bertujuan untuk menentukan menentukan aktivitas aktivitas spesif spesifik ik enzim enzim α-amil α-amilase ase hasil hasil isolas isolasii dan pemurn pemurnian ian aal! aal! Prinsi Prinsip p percoba percobaan an ini adalah adalah Penentuan Penentuan aktivitas aktivitas spesifik enzim α-amilase α-amilase melalui melalui pen"ukuran pen"ukuran konsentrasi konsentrasi men""unakan spektrofotometer! #etode pada percobaan ini $aitu Sentrifu"asi %$aitu proses pemurnian protein $an" $an" dida didasa sark rkan an pada pada pen"e pen"end ndapa apan n den"a den"an n cara cara sent sentri rifu fu"al "al&p &per erput putar aran' an'(( dan meto metode de spektrofotometer! Penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian aal akan akan didapat didapatkan kan hubun"an hubun"an aktivi aktivitas tas spesif spesifik ik enzim enzim α-ami α-amilas lasee den"an den"an konsent konsentras rasi( i( dimana dimana konsentrasi larutan ubi un"u $an" semakin besar akan menurunkan aktivitas spesifik enzim αamilase! amilase! )ilai aktivitas aktivitas spesifik spesifik enzim α-amilas α-amilasee pada enzim murni adalah adalah *(*+,! Sedan"kan nilai aktivitas spesifik enzim α-amilase pada enzim kasar adalah *(*.!
P/R01BAA) 2333 AKT323TAS AKT323TAS SP/S343K /)53# α-A#36AS/
3!
T787A) #enentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian aal
33! 33! T3)8 T3)8A7 A7A) A) P7ST P7STA AKA 33!9!
/nzim /nzim merupakan protein $an" berfun"si seba"ai biokatalis dalam sel hidup! /nzim
telah telah ban$ak ban$ak di"unak di"unakan an dalam dalam bidan" bidan" indust industri ri pan"an( pan"an( farmas farmasii dan indust industri ri kimia kimia lainn$a lainn$a!! :alam :alam bidan" bidan" pan"an pan"an misaln$ misaln$aa amilas amilase( e( "lukos "lukosa-i a-isom somera erase( se( papain( papain( dan bromelin( sedan"kan dalam bidan" kesehatan contohn$a amilase( lipase( dan protease! /nzim /nzim dapat dapat diisol diisolasi asi dari dari hean( hean( tumbuha tumbuhan n dan mikroo mikroor" r"ani anisme sme!! Kelebi Kelebihan han enzim enzim dibandin"kan dibandin"kan katalis biasa adalah ; dapat menin"katkan menin"katkan produk beribu beribu kali lebih tin""i< bekerja pada p= $an" relatif netral dan suhu $an" relatif rendah< dan bersifat spesifik dan selektif terhadap subtrat tertentu!
/nzim ? substrat
K 9 K >
Kompleks
Kesetimban"an untuk pembentuk adalah ;
[ E ] [ S ] Km @
[ ES ]
K +
/nzim ? Produk Produk
:en"an /s adalah kompleks enzim substrat( / adalah enzim( S adalah substrat ( dan Km adalah tetapan kesetimban"an! %Azmi( >**.' 33!>!
/nzim α-amilase /nzim alfa amilase merupakan salah satu jenis enzim $an" berperan atau berfun"si
men"hidrolisis atau memecah molekul-molekul pati menjadi molekul-molekul lain $an" lebih sederhana seperti dekstrin( maltosa( dan "lukosa! #ekanisme kerja dari enzim alfa amilase adalah den"an cara memecah ikatan α-9( "likosidik rantai "lukan pati! /nzim enzim alfa amilase bekerja optimum pada p= sekitar . dan pada suhu .*o0! 8ika suhu ditin"katkan ditin"katkan(( p= optimum optimum ju"a menin"kat sampai sekitar ! 8ika α-amilase α-amilase berasal berasal dari Bacillus licheniformis maka akan men"hidrolisis pati den"an hasil utama maltoheksosa( malopentosa den"an jumlah "lukosa $an" lebih tin""i % C 9*D'! enzim alfa amilase mampu menin"katkan rasa manis pada ekstrak sari buah karena aktivitas enzim alfa amilas amilasee $an" $an" mampu mampu men"hi men"hidro drolis lisis is pati pati pada pada pisan" pisan" menjad menjadii "ula "ula lain lain $an" $an" lebih lebih sederhana! %:armajana and A"ustina( >**' 33!+!
Klasifikasi da dan st struktur pr protein
Secara umum protein dapat dikate"orikan menurut tipe tu"as $an" dilaksanakan $aitu ; 9! Protein struktural ; Terdiri Terdiri atas molekul panjan"( liat liat dan tidak larut >! Protein Protein "lobular "lobular ; Bentukn$a Bentukn$a bulat dan larut larut dalam air! air! +! Protein Protein konfi"urasi konfi"urasi ; #erupakan #erupakan protein protein $an" bersen$aa bersen$aa den"an zat lain! Protein mempun$ai struktur seba"ai berikut; a' Struktur Struktur primer primer ; Struktur Struktur keran"ka keran"ka kovalen kovalen dan deret deret residu residu asam amino! amino! b' Struktur sekunder ; Struktur konformasi residu asam amino amino dekat polipeptida! c' Struktur Struktur tersier tersier ; Struktu Strukturr protein protein $an" rantai rantai keeseluruhann$ keeseluruhann$aa + dimensi dimensi d' Struktur Struktur kuertener kuertener ; Struktur Struktur antaraksi antaraksi antara antara sub unit unit protein protein %lehnin"er( 9,,,' 33!!
Aktivitas Sp Spesifik /n /nzim
Aktivitas spesifik han$a dapat di"unakan untuk preparat enzim $an" murni( $aitu jumlah satuan enzim per mili"ram enzim protein( tetapi aktivitas spesifik dapat pula ditentukan pada enzim tidak murni! Aktivitas spesifik enzim murni menunjukkan derajat kemurnian enzim dalam suatu sampel! Bila berat molekul enzim diketahui( maka aktivitasn$a dapat din$atakan dalam bentuk aktivitas molekular adalah jumlah satuan substrat permikromol enzim! Atau dapat pula diartikan seba"ai jumlah molekul substrat di ubah setiap menit oleh setiap molekul enzim! Aktivitas molekuler merupakan sifat enzim individu( jadi dapat d"unakan untuk menentukan kemurnian enzim seperti haln$a aktivitas enzim! %Poedjiadi( 9,,'
33!E!
Penentuan Aktivitas /n /nzim αα-amilase #etode $an" di"unakan dalam men"ukur aktivitas enzim α-amilase $aitu metode
spektrometri spektrometri!! Prosedurn$a Prosedurn$a berupa penentuan penentuan produk %"lukosa' den"an bantuan bantuan sinar( sinar( sesuai hukum lambert-Beer ; -6o" T @ A @ F ! b ! c :imana ; T @ transmitansi A @ absorbansi absorb ansi F @ koefisien ekstin"si molar b @ tebal kuvet c @ konsentrasi 7ntuk menentukan ban$akn$a produk "lukosa $an" terbentuk dari reaksi enzimatis maka di"unakan kurva standar "lukosa! Produk din$atakan dalam satuan unit aktivitas $an" didefinisikan ban$akn$a mol "lukosa dan reaksi enzimatis pada kondisi optimum! %=ardjono( >**9' 33!.!
Spektrofotometer 72-23S
Secara umum semua molekul dapat men$erap radiasi dalam daerah 72-23S karena mereka men"andun" elektron $an" dapat tereksitasi ke tin"kat ener"in$a $an" lebih tin""i! Panjan" "elomban" $an" terjadi ter"antun" pada beberapa kuat elektron ini terikat pada molekul! Absorbansi larutan bertambah den"an pen"uraian kekuatan sinar( bila konsentrasi materi $an" dileati caha$a bertambah maka caha$a lebih ban$ak diserap! 8adi absorbansi berbandin" lurus den"an ketebalan b dan den"an konsenttrasi c! %=ardjono( >**9'
33!!
Tekhnik Se Sentrifu"asi Tekhnik Tekhnik sentrifu"a sentrifu"asi si adalah suatu suatu tekhnik tekhnik pemisahan pemisahan berdasarkan berdasarkan sifat partikel partikel
dalam medan "a$a sentrifu"al sentrifu"al!! Partikel Partikel $an" berbeda berbeda berat jenis( ukuran dan bentukn$a bentukn$a men"endap searah den"an "a$a sentrifu"al den"an kecepatan berbeda! Partikel $an" akan dipisa dipisahkan hkan biasan$a biasan$a disuspens disuspensii dalam dalam
medium medium cair $an" $an" dimasu dimasukan kan dalam tabun" tabun"
sentrifu"al $an" dapat ditempatkan dalam rotasi $an" berputar( rotor terletak pada pusat sumbu simetri! %lehnin"er( 9,,,'
33!!
#etode )elson-Soumo"$i Penentuan aktivitas enzim α-amilase dilakukan den"an metode spektrofotometri di
mana mana
dila dilaku kuka kan n
pene penent ntua uan n
terh terhad adap appr prod oduk uk
enzi enzimn mn$a $a
$ait $aitu u
"luk "lukos osaa
den" den"an an
metode)elson-Souma"$i $an" prinsipn$a adalah pemanasan "ula den"an larutan alkali dari temba"a tartrat dan terbentuk cupri oksida! %6ehnin"er(9,,,' 33!,!
#etode 6or$
Protei Protein n den"an den"an asam asam fosfot fosfotun" un"sti stien-f en-fosf osfomo omolib libdat dat pada pada suasan suasanaa alkali alkali akan memberi arna biru$an" intensitasn$a ter"antun" pada konsentrasi protein! 6arutan A terdiri atas fosfotun"stein( fosfomolibdat! 6arutan B %>D )a>01+ dalam )=1= *(9 )( 0uS1 dan )a-K tartrat >D'! 0ara penentuann$a adalah seba"ai berikut( 9 ml larutan protein ditambah *(E ml lor$ B( di"ojo" dan biarkan >* menit! Selanjutn$a diamati 1: n$a pada G $an" terpilih! 0ara lor$ >* kali lebih sensitif pada cara 72 atau b uret! %lehnin"er( 9,,,'
II.10.
Analisa Bahan
II.10.1.
Amilum
Polisakarida yang banyak terdapat dari tumbuhan, dalam bahasa sehari-hari disebut pati, terdapat pada umbi, daun, batang, dan bijibiji bijian. an. Terdi erdiri ri atas atas dua dua maca macam m poli polisa saka kari rida da yait yaitu u amil amilos osa a dan dan amilopektin.
Poedjiadi,
1!!"# II.10.$.
%lukosa
B& '(0,1(, larut dalam larutan )ehling, tollens dan eter, sulit larut dalam alkohol, memiliki dua jenis yaitu *-glukosa dan +-glukosa.
*aintith,
1!!"# II.10..
n/"
enyaa kristalis larut air, berarna putih, dibuat leat pemanasan biji bijih h ink ink su sul2 l2da da diud diudar ara a dan mela melaru rutk tkan an dan dan meng mengkr kris ista tali lisa sasi si sul)atnya.
*aintith,
1!!"#
II.10.".
Ba/3#$
Padatan putih, secdikit larut dalam air, bentuk yang umum adalah oktahidrat, monoklinik, titik leleh 45 06.
*aintith,
1!!"# II.10.7.
Akuades
6airan tak berarna, titik leleh 0 06, titik didih 100 06, tidak berbau dan tidak berasa, terdiri dari satu molekul 3 $/ dengan ikatan 3-/3 1070
*aintith,
1!!"# II.10.(. -
8eagen +ory
8eagen lory A +arutan asam phospo-)ungatic-phospo-molybdic.
-
8eagen lory B 100 ml $9 :a $6/ dalam larutan :a/3 0,1 : dengan 1 ml 6uo". 73$/ 19 dan 1 ml natrium-kalium tartat $9.
udarmadji,
1!!4#
II.10.4.
Bu;er Phos)at
+arutan A < 0,$ & larutan :a-Phospat monobasis $4,5 g dalam 1000 ml# +arutan B < 0,$ & larutan :a-phosphat dibasis 7$,(7 g#
udarmadji,
1!!4# II.10.5. -
8eagen :e :elson-omougyi
8eagen A 1$ g =.:a tartat ' 1,( g :a-bikarbonat, 1"," g :a-sul)at anhidrat, $," g :a-karbonat anhidrat dilarutkan dengan akuades.
-
8eagen B $ g 6uo".73$/ ditamb ambah 15 g :a$/" anhidrat anhidrat dilarutkan dilarutkan sampai 100 ml 8eagen :elson oumogyi ' 1 bagian :elson A > 1 bagian :elson A# udarmadji, 1!!4#
III.&?T/*? P?86/BAA: P?86/BAA: III.1.
Alat dan Bahan
III. III.1. 1.1. 1. Alat Alat 1.
Tabung reaksi
7. %elas ukur
$.
entri)uge
(. %elas bekker
.
Inkubator
4. pektro)otometer @-I
".
Pipet tetes III. III.1. 1.$. $. Baha Bahan n
1.
ampel enim
$.
amilum
4. Bu;er )os)at
.
larutan glukosa
5. 8eagen :elson-oumogyi
".
akuades
!. 8eagen +ory
7.
Ba/3#$
333!>!
(. 6u/"
0ara kerja
333!>!9! Penentuan aktivitas aktivitas enzim α-amilase 9 ml larutan amilum Tabun" reaksi
Penambahan *(9 ml larutan enzim Penambahan +(, ml buffer fosfat Penikubasian Penikubasian pada T @ +*(+(*(E*( +*(+(*(E*(.* .**0 masin"-masin" selama >*(+*(*(E*(.* menit! =asil
III.$.$. Penentuan kadar "ula pereduksi den"an metode :elson-omougyi *(9 ml larutan inkubasi Tabun" Tabun" reaksi
Penambahan akuades 9(E ml Penambahan *(> ml larutan Ba%1='> *(*9 # Penambahan larutan 5nS1 *(> ml *(*9 # Pen""ojo"an dan sentrifu"asi 9 ml supernatan Tabun" Tabun" reaksi Penambahan 9 ml rea"en :elson-omougyi
Pemanasan selama 17 menit
Pendin"inan Penambahan 9 ml rea"en arsenomolibdat Pen"enceran den"an air hin""a volume menjadi 9* ml Penentuan konsentrasi den"an spektrofotometer 72-23S pada G @ E>* nm Pen"ulan"an terhadap larutan standar "lukosa =asil
333!>!+! 333!>!+! Penentuan Penentuan kadar protein den"an metode metode lor$ *(> ml larutan enzim Tabun" reaksi
Penambahan 9 ml rea"en 0
Penambahan *(9 ml rea"en : Pendiaman +* menit Pen"ukuran absorbansi pada G @ E* nm Pen"ulan"an terhadap blanko =asil 32!:ATA P/)HA#ATA) ) o 9
Perlakuan
=asil
Penentuan aktivitas enzim α-amilase 9 ml larutan larutan amilum amilum 9D ? *(9 ml enzim enzim ? +(, ml buffer fosfat( inkubasi
>
Penentuan kadar "ula pereduksi -*(9 ml larutan inkubasi ? 9(E ml akuades ? *(> ml Ba%1='> *(*9 # ? 5nS1 *(> ml *(*9 #( pen""ojo"an sentrifu"asi -9 ml supernatan ? 9 ml rea"en )elson ? 9
+
ml rea"en arsenomolibdat( pen"enceran -Pen"ukuran A den"an spektra 72 Penentuan Kadar Protein -*(> ml larutan enzim ? 9 ml rea"en 0 ? *(9 ml rea"en : ? pendiaman +* menit -Pen"ukuran A pada G @ E* nm
2! =3P1T/ =3P1T/SA SA Penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian aal akan didapat didapatkan kan hubun"a hubun"an n aktivi aktivitas tas spesif spesifik ik enzim enzim α-amil α-amilase ase den"an den"an konsen konsentra trasi( si( dimana dimana konsentrasi $an" semakin besar akan menurunkan aktivitas spesifik enzim α-amilase!
Semaran"( 9 1ktober >**,
#en"etahui(
Asisten
Praktikan
:idi Sutardi 8>0**E
8>0**.*9,
:ATA P/)HA#ATA) ) o 9
>
Perlakuan
=asil
Penentuan aktivitas enzim α-amilase 9 ml larutan larutan amilum amilum 9D ? *(9 ml enzim enzim ? +(, ml buffer buffer fosfat( inkubasi Penent Penentuan uan kadar kadar "ula "ula pereduk pereduksi si den"an den"an metode metode )elson )elson-Soumo"$i -*(9 ml larutan inkubasi ? 9(E ml akuades ? *(> ml Ba%1='> *(*9 # ? 5nS1 *(> ml *(*9 #( pen""ojo"an sentrifu"asi 9* menit a! ekstrak kasar b! fraksi 3 c! fraksi 33 d! fraksi 333 e! fraksi 32 -9 ml larutan supernatan ? 9 ml rea"en )elson-soumo"$i(
6arutan benin" 6arutan benin" 6arutan benin" 6arutan benin" 6arutan benin"
Biru Biru makin pekat Biru dipan dipanas askan kan dalam dalam laru laruta tan n mendi mendidi dih h sela selama ma 9E meni menit( t( Biru didin"inkan Biru a! ekstrak kasar b! fraksi 3 Biru c! fraksi 33 kelompok 3 Biru makin pekat d! fraksi 333 Biru e! fraksi 32 Biru Biru a! ekstrak kasar b! fraksi 3 Kunin" kehijauan c! fraksi 33 kelompok 33 Kunin" kehijauan d! fraksi 333 Kunin" kehijauan e! fraksi 32 Kunin" kehijauan -Penambahan 9 ml larutan molibdat( pen"enceran Kunin" kehijauan a! ekstrak kasar b! fraksi 3 (E A( ( A( (E A c! fraksi 33 >( A( >(. A( >(E A d! fraksi 333 >(> A( > A( > A
e! fraksi 32 -Penentuan konsensentrasi den"an spektra 72 a! ekstrak kasar b! fraksi 3 c! fraksi 33 kelompok 3 d! fraksi 333 e! fraksi 32 +
a! ekstrak kasar b! fraksi 3 c! fraksi 33 kelompok 33 d! fraksi 333 e! fraksi 32 Penentuan kadar Protein metode 6or$ -Penambahan larutan sampel den"an 9 ml rea"en 0( kocok a! ekstrak kasar b! fraksi 3 c! fraksi 33 d! fraksi 333 e! fraksi 32 -Penambahan *(9 ml rea"en :( kocok a! ekstrak kasar b! fraksi 3 c! fraksi 33 d! fraksi 333 e! fraksi 32
-Pen"ukuran absorbansi a! G maI b! ekstrak kasar c! fraksi 3 d! fraksi 33 e! fraksi 333 f! fraksi 32 23! P/#BA=ASA)
9( A( 9(E A( 9( A *( A( *( A( *( A >( A( >( A( >(E A >( A( >( A( >(. A > A( >(9 A( > A 9(E A( 9( A( 9(E A *( A( *( A( *( A
-Biru kehijauan -Kunin" kecoklatan -Kuni Kunin" n" keco kecokl klat atan an lebih benin" darinfraksi 3 -Bir -Biru u kehi kehija jaua uan n lebi lebih h benin"
dari
ekstrak
kasar -Biru benin" -Biru tua -biru tua makin "elap -biru tua -Biru benin" -biru -biru benin" benin" api lebih lebih "elap dari sebelumn$a .+* nm *(E A( *( A( *( A *(. A( *(. A( *(E A *(EE A( *(E A( *(E A *( A( *( A( *( A *(+E A( *( A( *(+E A
Percobaan Percobaan aktivitas aktivitas spesifik spesifik enzim α-amilase α-amilase bertujuan bertujuan untuk menentukan menentukan aktivitas aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian aal! Sampel $an" di"unakan adalah ubi un"u $an" merupakan sumber karbohidrat! /nzim α-amilase merupakan enzim $an" dapat men"uraikan amilum den"an memutuskan ikatan α-9( "likosida dalam pati secara acak dari ba"ian dalam molekul( baik pada amilase maupun amilopektin! Prinsip percobaan ini adalah Penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase secara kromato"rafi! #etode pada percobaan ini
$aitu $aitu 4raksi 4raksinas nasii %$aitu %$aitu(( pemurn pemurnian ian $an" $an" didasa didasarka rkan n pada pen"end pen"endapan apan secara secara bertah bertahap' ap'(( Sentrifu"asi %$aitu proses pemurnian protein $an" didasarkan pada pen"endapan den"an cara sentrifu"al&perputaran'( dan metode kromato"rafi %pen"ukuran absorbansi'!
.!9! Penentuan Aktivitas enzim α-amilase Percobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian aal men""unakan metode inkubasi! :i"unakan amilum karena enzim α-amilase dapat men"hidrolisis amilum! 4un"si penambahan buffer P1 adalah seba"ai larutan pen$an""a a"ar p=-n$a tidak tetap! :i mana aktivitas α-amilase berada pada ran"e p= E(-.(( maka di"unakan buffer P1 den"an p= .(9 %buffer asam'( di mana p= ini merupakan p= optimum aktivitas α-amilase! 8ika p=-n$a di atas p= optimum maka enzim akan men"alami deprotonasi atau perubahan p= baik di atas maupun di baah p= optimum akan men$ebabkan enzim terdenaturasi( sehin""a aktivitas enzim menurun! 0ampura 0ampuran n diinkub diinkubasi asi pada suhu suhu +*0 kare karena na suhu suhu ters terseb ebut ut meru merupak pakan an suhu suhu optimum aktivitas enzim α-amilase! α-amilase! =al ini sebandin" den"an ener"i aktivasi %/a' untuk setiap enzim membentuk kompleks enzim-substrat dan kemudian membentuk produk dan enzim kembali! 8ika suhu inkubasi lebih tin""i maka protein akan terdenaturasi $an" men"akibatkan aktivitas enzim menurun! Be"itu pula jika diinkubasi pada temperatur $an" lebih rendah maka aktivitas enzim α-amilase kuran" optimal!
.!>! Penentuan kadar "ula pereduksi den"an metode metode )elson-Soumo"$i Percobaan ini betujuan untuk penentuan kadar "ula pereduksi den"an men""unakan metode )elson-Soumo"$i! Penentuan kadar "ula pereduksi merupakan ujud dari uji aktifitas aktifitas enzim α-amilase! α-amilase! Aktivita Aktivitass enzim merupakan unit aktivitas aktivitas enzim permili"ram permili"ram protein( sedan"kan satu unit aktivitas enzim α-amilase merupakan aktivitas enzim $an" men$ebabkan terbentukn$a 9Jmol produk "lukosa dari substrat amilum persatuan aktu inkubasi pada kondisi temperatur dan P= tertentu! 7ji aktivitas spesifik enzim α-amilase
diaali den"an reaksi enzimatis( $aitu den"an menambahkan larutan amilum 9D dan buffer fosfat ke dalam enzim kasar dan enzim halus!
/
?
/nzim
/S
S αsubstrat
/
enzim-substrat
?
P
enzim
produk
Pada reaksi enzimatis diperlukan proses inkubasi( dimana pada proses inkubasi ini terjadi kontak antara enzim α-amilase den"an substrat dalam membentuk produk $aitu "lukosa! Reaksi ; CH2OH
OH
O
CH2 OH O
CH2OH O
OH
O
=1
O
?
B uf uf f er 4o sf sf a t
OH
OH
CH2OH
alfa - amilase amilase
OH
O
CH 2OH O
1=
1=
OH
OH
=1 OH
OH
#altosa
OH
Hlukosa
Kada Kadarr "ula "ula pere peredu duks ksii dapat dapat diten ditentu tuka kan n den"a den"an n meto metode de )els )elson on-S -Soum oumo"$ o"$i! i! Penambahan larutan Ba%1='> bertujuan untuk meminimalisasi masuknn$a oksi"en dari luar ke dalam larutan $an" dapat men"oksidasi kupri oksida %0u>1' dan penambahan 5nS1 bertujuan untuk men"endapkan protein! Supernatan $an" terbentuk ditambahkan rea"en )elson-Soumo"$i dan dipanaskan %den"an tujuan untuk mempercepat reaksi'! Penambahan rea"en )elson-Soumo"$i men$ebabkan terbebtukn$a kupri oksida! Rea"en 0u-tartrat akan direduksi oleh "lukosa( hal ini karena "lukosa mempun$ai "u"us "ula pereduksi( $aitu "u"us aldehid! Reaksi reduksi 0u>? ; 0u>? ? e
0u>?
3on 0u? akan men"endap seba"ai 0u>1 dalam suasana basa ; > 0u ? ? > 1=-
0u>1 ? =>1
Reaksi terbentukn$a kupri oksida ;
CHO
CHO
H
C
OH
OH
C
H
H
C
OH
H
C
OH
CH2OH
Hlukosa
>?
0u
Alkali
H
C
OH
OH
C
H
H
C
OH
H
C
OH
?
0u>1
CH2OH
asam :-"lukonat
#etode )elson-Soumo"$i men"analisa secara kuantitatif! Produk reaksi enzimatis berupa "lukosa( akan tetapi metode ini memiliki kekuran"an karena "ula non pereduksi %sukrosa' tidak dapat terdeteksi dan han$a bisa mendeteksi "ula pereduksi %"lukosafruktosa' padahal produk dari pemecahan amilum oleh enzim α-amilase bukan "lukosa melainkan maltosa( sukrosa dan "ula non pereduksi $an" lain! Hula dapat direduksi den"an sinar 72 karena memiliki elektron-elektron $an" dapat tereksitasi dari keadaan dasar ketin"kat ener"i $an" lebih tin""i! Biasan$a transisi elektron elektron disebabkan oleh elektron elektron dimana dalam molekul "lukosa men"andun" "u"us karbonil $an" dibentuk oleh elektron ! Penentuan kadar "lukosa dilakukan den"an men"ukur absorbansi larutan tersebut den"an men""unakan spektrofotometer 72-23S pada G E>* nm! Panjan" "elomban" E>* nm ini merupakan panjan" "elomban" maksimum( dimana terjadi serapan maksimum oleh oleh laru laruta tan n "luko "lukosa sa!! Kada Kadarr "ula "ula pered pereduks uksii dite ditent ntuka ukan n den" den"an an memban membandi din" n"kan kan absorbansi larutan sampel terhadap kurva larutan standar glukosa.
Absorbansi enzim murni pada kelompok 9( pada fraksi 3 adalah >(.( fraksi 33 adalah >(*( fraksi 333 adalah 9(*( dan fraksi 32 adalah *(E! Pada kelompok >( pada fraksi 3 adalah >(.( fraksi 33 adalah >(*+ ( fraksi 333 adalah 9(E( dan fraksi 32 adalah *(.! Absorbansi pada ekstrak kasar >(+! /nzim murni $an" di"unakan adalah pada fraksi 3 karena nilai absorbansin$a palin" besar! Sehin""a kadar "ula pereduksi pada enzim murni %pada kelompok kelompok 9 dan >' adalah *(*> m"&9** m"&9** ml dan enzim kasar kasar pada kelompok kelompok 9 adalah *(* m"&9** ml dan pada kelompok > adalah *(*>E m"&9** ml! Kadar enzim murni lebih besar karena pada enzim kasar terdapat enzim-enzim lain $an" mun"kin menimbulkan interferensi dan pen"ukuran absorbansi!
.!+! Penentuan kadar Protein den"an #etode 6or$
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein dari larutan ubi un"u! #etode $an" di"unakan adalah metode lor$! Penentuan kadar protein den"an metode lor$ didasarkan pada arna kompleks $an" $an" dibentuk $an" intensitas arnan$a bervariasi berasrkan jenisprotein atau jumlah asam amino aromatik pada protein! La Larna rna $an" timbul disebabkan oleh reaksi temba"a alkali den"an protein! Rea"en $an" di"unakan rea"en 4olin 0iocalteu $an" merupakan campuran natrium tun"stat dan natrium molibdat dalam asam! 0ampuran asam ini akan mereduksi protein $an" di"unakan dalam percobaan melalui pen"uraian 0u>? sehin""a campuran asam ini kehilan"an satu atau lebih atom oksi"en dan kompleks biru $an" dihailkan merupakan kompleks antara protein den"an 0u>?! Struktur kompleks biru ; HN R
CH
O
C HN
NH >?
0u
C
O
HC
R
NH
Penentuan Penentuan kuantitatif kuantitatif kadar protein protein secara secara lor$ didasarkan didasarkan pada absorbansi absorbansi sinar oleh kompleks biru! Absorbansi diukur den"an men""unakan spektrofotometri 72-23S! Absorbansi sampel $an" diperoleh $aitu pada fraksi 3 adalah *(E( fraksi 33 adalah *(E>( fraksi fraksi 333 adalah *( dan fraksi 32 adalah *(+! untuk enzim kasar absorbansin$a absorbansin$a adalah *(+! Kadar protein enzim murni pada fraksi 3 adalah 9+(E J"&ml( fraksi 33 adalah .E9 J"&ml( fraksi 333 adalah E*9 J"&ml( dan fraksi 32 adalah .+(E J"&ml! Pada ekstrak enzim kasar masih terdapat ban$ak protein sehin""a kadarn$a lebih tin""i! )ilai aktivitas spesifik enzim α-amilase ekstrak kasar pada kelompok 9 adalah *(*, dan pada kelompok > adalah *(*.! )ilai aktivitas spesifik enzim α-amilase pada enzim murni %pada kelompok 9 dan >' adalah *(*+,! /nzim murni $an" di"unakan adalah pada fraksi 3 karena nilai absorbansin$a palin" besar
233! K/S3#P76A) 9! Penentuan Penentuan aktivitas aktivitas enzim enzim α-amilase α-amilase dapat dapat di lakukan lakukan den"an metode metode spektro spektro fotometr fotometrii men""unakan metode )elson-soumo"$i dan 6or$
>! Kadar "ula pereduk pereduksi si pada pada enzim enzim murni murni %pada kelompok kelompok 9 dan >' adalah *(*> m"&9** m"&9** ml dan enzim kasar pada kelompok 9 adalah *(* m"&9** ml dan pada kelompok > adalah *(*>E m"&9** ml! +! Kadar protein protein enzim enzim murni murni pada fraksi fraksi 3 adalah adalah 9+(E 9+(E J"&ml( J"&ml( fraksi fraksi 33 adalah adalah .E9 J"&ml( J"&ml( fraksi 333 adalah E*9 J"&ml( dan fraksi 32 adalah .+( E J"&ml ! )ilai aktivit aktivitas as spesifik spesifik enzim enzim α-amilase α-amilase ekstra ekstrak k kasar pada pada kelompok kelompok 9 adalah *(*, *(*, dan pada kelompok > adalah *(*.! Pada enzim murni %pada kelompok 9 dan >' adalah *(*+, E! Semaki Semakin n besar besar konsentra konsentrasi si enzim α-amilas α-amilasee maka maka akan menurunka menurunkan n aktivi aktivitas tas spesif spesifik ik enzim α-amilase
2333! :A4TAR P7STAKA Azmi( >**.( Penentuan Penentuan Kondisi Kondisi 1ptimum 1ptimum 4ermentasi 4ermentasi Asper"il Asper"illus lus 1r$zae 1r$zae 7ntuk 3solasi /nzim Amilase Pada #edium Pati Biji )an"ka( 6aboratorium Kimia 8urusan P#3PA 4K3P 7niversitas Riau( Pekanbaru :aintith( 9,,( Kamus 6en"kap Kimia( Kimia( /rlan""a( 8akarta! 8akarta! :armajana And A"ustina( >**( Pen"aruh Konsentrasi /nzim α-Amilase Terhadap Sifat 4isik :an 1r"anoleptik 4iltrat( Balai Besar Teknolo"i Tepat Tepat Huna C 6ipi( Suban" =ardjono( >**9( > **9( Spekstroskopi( Spek stroskopi( libert$( Mo"$akarta Mo"$akarta 6ehnin"er( 9,,,( Biokimia :asar( /rlan""a( 8akarta Poedjiadi( 9,,( :asar-dasar Biokimia( 73 Press( 8akarta
Semaran"( >. 1ktober >**,
#en"etahui( Asisten
Praktikan
:idi Sutardi
8>0**E
8>0**.*9,
