Penentuan Aktivitas Enzim α-Amilase
LAPORAN PRAKTIKUM
Oleh :
Kelompok 4
Fitria Retno Sari (131510501063)
Yuni Y. (131510501080)
Eri Pratiwi . (131510501070)
Pitri Lailatul Q. (131510501088)
Erviana Dwi C. (131510501103)
Angga Wibowo. (131510501160)
Miftauhul Imron . (131510501091)
M Rizqy Maulana (131510501078)
10.Moch Rosy W (131510501066)
11.Mu'amal Fanani (131510501054)
PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI
LABORATORIUM FISIOLOGI TUMBUHAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS JEMBER
2014
BAB 1. PENDAHULUAN
Latar Belakang
Negara Indonesia merupakan satu-satunya negara di dunia yang memiliki tingkat keanekaragaman tanaman yang sangat tinggi, mulai dari berbagai jenis tanaman pangan hingga tanaman penggangu atau gulma. Keanekaragam tanaman di Indonesia ini disebabkan karena Indonesia merupakan satu-satunya negara mega biodersity di permukaan bumi ini. Namun meski demikian, keanekaragaman tanaman di Indonesia akan berkurang jika penduduknya kurang memahami atau tidak bijaksana dalam membudidayakan tanaman.
Dalam membudidayakan suatu tanaman, seorang harus menguasai atau setidaknya mengerti tentang anatomi dan morfologi tanaman. Hal ini bertujuan untuk mendukung proses-proses penting yang berlangsung di dalam tubuh tanaman. Dengan mengetahui struktur dari sebuah tanaman maka dapat pula diketahui proses metabolisme dari tanaman yang sedang atau hendak dibudidayakan.
Setiap tanaman pasti melakukan proses metabolisme seperti proses fotosintesis, proses respirasi, proses transpirasi dan proses-proses lainnya dalam menunjang tumbuh dan kembangnya. Selain proses-proses tersebut tanamanjuga merupakan tempat melakukan interkonversi gula dan pati yang terjadi pada organ daun. Senyawa-senyawa seperti senyawa glukosa merupakan hasil dari proses fotosintesis. Akan tetapi, pati pada tanaman tidak terbentuk dari hasil proses fotosintesis, melainkan reaksi-reaksi tersebut terbentuk akibat adanya aktivitas enzim-enzim yang terdapat dalam daun.
Enzim dapat diartikan sebagai suatu molekul protein yang dimanfaatkan sebagai katalisator yang ada di dalam tubuh makhluk hidup, enzim tersebut merupakan senyawa yang digunakan untuk membantu mempercepat proses reaksi kimia pada bahan tertentu tanpa ikut bereaksi. Oleh karena itu, pada semua proses fisiologis sel pada tanaman selalu memerlukan enzim yang bertujuan untuk mempercepat proses-proses metabolisme yang ada di dalam tubuh tanaman.
Reaksi enzimatis pada jaringan tumbuhan utamanya dipengaruhi oleh beberapa faktor. Faktor-faktor tersebut diantaranya adalah temperatur, suhu, substrat, konsentrasi enzim, inhibitor dan aktivator. Apabila semua faktor pendukung enxim dalam kondisi optimal maka reaksi enzim yang terjadi juga akan optimal. Enzim yang merupakan katalisator memiliki sifat-sifat sebagai berikut, sebagai katalisator pada umumnya enzim akan ikut bereaksi, tetapi setelah reaksi selesai maka enzim akan kembali pada bentuk semula, dengan begitu enzim dapat digunakan kembali pada reaksi lainnya.
Salah satu enzim yang ada dalam tanaman adalah enzim amilase. Enzim amilase ini umumnya diketahui berfungsi mengubah pati menjadi glukosa. Enzim ini tidak hanya pada tanaman saja, namun makhluk hidup lain yaitu manusia dan hewan yang juga mempunyai enzim amilase di dalam sistem tubuhnya. Pada saat ini enzim banyak digunakan untuk skala industri karena enzim amilase dapat diaplikasikan secara luas dalam berbagai bidang bioteknologi.
1.2 Tujuan
Untuk mengetahui aktivitas enzim α-Amilase
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
Negara indonesia merupakan satu-satunya negara di dunia yang memiliki tingkat keanekaragaman tanaman yang sangat tinggi, mulai dari berbagai jenis tanaman pangan hingga tanaman penggangu atau gulma. Banyaknya tananaman pangan tersebut maka potensi untuk mengembangkan bahan industri yang dapat menghasilkan enzim α-amilase. Enzim α-amilase in banyak dihasilkan dari tanaman-tanaman yang memiliki sari pati. Contoh tanaman yang memiliki kandungan pati tinggi dalam biji atau buahnya diantaranya adalah tanaman jagung, tanaman sagu, tanaman sorgum dan tanaman singkong (Trismilah dan Budiasih, 2009).
Menurut Kotting (2010), senyawa pati yang sering ditemukan di bagian tanaman-tanaman tertentu merupakan salah satu dari senyawa karbohidrat yang banyak tersimpan di dalam tanaman. Zat utama yang merupakan penyusun senyawa pati adalah polimer glukosa amilosa dan amilopektin. Kedua zat tersebut berada di dalam tubuh tanaman dan disimpan untuk digunakan kembali pada saat bahan untuk melakukan proses fotosintesis telah habis. Pada tanaman tingkat tinggi senyawa pati berfungsi sebagai kontrol kerja enzim α-amilase dan enzim β-amilase. Syafi'i (2009), menambahkan bahwa kadar pati yang terdapat di dalam tanaman dapat mengalami penurunan. Penurunan tersebut diakibatkan oleh proses pemanasan yang sangat lama. Proses pemanasan yang terlalu lama menyebabkan pati terpecah menjadi gula secara sederhana seperti glukosa dan maltosa. Pemecahan pati tersebut dilakukan oleh enzim α-amilase dan enzim β-amilase. Aktifitas enzim α-amilase dan enzim β-amilase sangat tinggi ketika proses pemanasan berlangsung sehingga senyawa pati pun terpecah menjadi monosakarida.
Menurut Sloane (1994), enzim merupakan suatu katalis dari organik yang masuk ke dalam protein globular. Enzim umumnya mampu menurunkan energi aktivasi yang terjadi di dalam sel. Hal inilah yang menyebabkan reaksi pada sel hidup dapat berlangsung pada kondisi normal. Kebanyakan enzim hanya bekerja untuk satu substrat saja, hal ini menjadi suatu bukti bahwa setiap enzim mampu membedakan substratnya sendiri dengan substrat lain yang berkaitan erat. Sedangkan menurut Sumardjo (2009), enzim adalah suatu kelompok protein yang menjalankan dan mengatur perubahan kimia dalam sistem biologi pada makhluk hidup. Enzim banyak dihasilkan dari tanaman atupun hewan, dimana enzim ini melangsungkan berbagai reaksi kimia seperi hidrolisis, reduksi, oksidasi, pemutusan rantai karbon, dan masih banyak yang lainnya. Enzim dapat mengalami kerusakan seperti halnya protein. Hal itu bisa terjadi jika adanya pemanasan, gelombang ultrasonil, radiasi UV atupun pengaruh penambahan asam maupun basa tertentu. Enzim yang mengalami kerusakan atau denaturasi lama kelamaan akan menjadi tidak produktif alias tidak dapat bekerja dengan baik.
Enzim yang banyak ditemukan pada senyawa pati adalah enzim α-amilase. Enzim α-amilase mampu menghidrolisis pati dan glikogen melalui pemotongan internal ikatan α-1,4-glikosida secara acak, dan kemudian akan menghasilkan oligosakarida seperti maltosa dan glukosa. (Lestari dkk., 2011). Hidrolisis enzimatis dapat dilakukan dalam pembuatan sirup glukosa, dapat dilakukan dengan menggunakan dua tahap yaitu likuifikasi pada tahap pertama dan sekarifikasi pada tahap kedua. Likuifikasi yaitu enzim α-amilase (EC 3.2.1.1) yang digunakan untuk memecah molekul pati dari sisi bagian dalam rantai pati pada ikatan (1,4)-α-glikosida menjadi molekul BM yang lebih kecil dan meliputi maltosa, glukosa, oligosakarida, dan deskrin. Konsentrasi enzim akan mempengaruhi jumlah substrat yang berhubungan dengan enzim. Lama sakarifikasi akan mempengaruhi lama dan singkatnya hubungan yang terjadi antara substrat dan enzim (Yunianta dkk., 2010).
Garcia (2013), menambahkan suatu pernyataan berdasarkan penelitiannya bahwa aktivitas enzim yang melibatkan sukrolisis dan amilolisis dapat digunakan untuk membuktikan adanya jalur metabolik potensial. Pada penelitian tersebut, ditemukan karbohidrat yang didalamnya terdapat kandungan sukrosa, glukosa, fruktosa serta pati. Menurut Askurrahman (2010), salah satu faktor yang mempengaruhi kecepatan dan metabolik enzim adalah suhu. Peningkatan suhu dapat meningkatkan afinitas enzim terhadap katalisator dan aktivator. Hal itu menyebabkan reaksi akan berlangsung cepat. Selain itu, peningkatan suhu juga dapat menambah energi kinetik dari enzim maupun substrat yang lama kelamaan akan menyebabkan enzim dan substrat bergerak dengan cepat dan akhirnya akan saling bertabrakan. Besarnya frekuensi tabrakan antar enzim dan substrat akan memperbesar terbentuknya produk. Das (2011), menambahkan bahwa enzim amilase merupakan salah satu dari sekian banyak enzim yang digunakan dalam bidang industri karena dalam sistem sel, amilase berperan penting dalam biokonversi pati dan substrat berbasis pati, sehingga enzim amilase disini sangat berpengaruh terhadap proses hidrolisis dalam dalam pengolahan pati skala industri.
BAB 3. METODOLOGI PRAKTIKUM
Waktu dan Tempat
Pratikum Fisiologi Tumbuhan dilaksanakan pada Kamis tanggal 22 Oktober 2014 dari pukul 15.15 sampai selesai di laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Jember.
Bahan dan Alat
Bahan
Benih kecambah
Buffer phosphat 0,1 M dengan pH 7,55
Starch soluble 1 %
Larutan DNS
Enzim CE, enzim α-amilase
Alat
Tabung reaksi dan rak
Oven
Spektrofotometer
Mikropipet
Cara Kerja
Mengambil 100 µl soluble starch 1% masukkan dalam tabung reaksi.
Menambahkan KPI pH 7,55 sebanyak 390 µl
Menambahkan 10 µl Enzim CE
Menginkubasi pada suhu 35-40˚C selama 30 menit
Menambahkan DNS sebanyak 500 µl
Mendidihkan selama 5 menit
Mendinginkan
Mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 575 nm.
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Tabel 4.1.1 Hasil Pengukuran Absorbansi Enzim Amilase
Jenis Enzim
Kelompok 1
Kelompok 2
Kelompok 3
Kelompok 4
CE
2,6815
3,000
2,9245
2,8735
E
1,388
1,4925
1,2415
1,613
4.2 Pembahasan
Kinetika enzim (Km) merupakan suatu studi reaksi kimia yang dikatalisis oleh enzim. Pada kinetika enzim laju reaksi diukur dan dampak dari berbagai kondisi reaksinya. Kinetika enzim juga mempengaruhi bidang biokimia yang terkait dengan pengukuran kuantitatif dari kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim dan pemeriksaan sistematik faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kecepatan enzim.
Dalam penelitiannya Putra (2009), menyatakan bahwa penentuan kinetika enzim diukur berdasarkan plot grafik hubungan antara konsentrasi Substrat (S) dengan kecepatan aktivitas enzim (V), sehingga tingkat reaksi enzim dapat diketahui dengan menggunakan rumus Vmaks dan Kmaks. Dalam analisis Michaelis-Menten, Kmaks dikenal dengan Km yang hingga saat ini digunakan sebagai salah satu parameter dalam kinetika enzim. Km tersebut merupakan konsentrasi substrat yang sudah terisi setengahnya ketika kecepatan enzim telah mencapai Vmaks. Pada
tabel berikut dapat kita tentukan seberapa besar nilai kinetika enzim (Km) nya.
S (Konsentrasi)
Vo (Kecepatan)
3
5
10
30
50
10,4
14,5
22,5
33,8
40,5
Tabel 4.2.1 Contoh Aktivitas Enzim Amilase
Tabel si atas merupakan satu dari sekian banyak contoh soal untuk mengetahui nilai dari kinetika enzim melalui konsentrasi substrat (S) dan kecepatan enzim (V). Analisis tabel diatas menggunakan analisis Michaelis-menten dan tabel akan dirubah dan dikonversikan ke dalam tabel dan grafik 4.2.2 yang menerangkan tentang hubungan regresi dan korelasi antar konsentrasi (S) denagan kecepatan (V).
S (konsentrasi)
V (kecepatan)
1/[S]
1/V
3
10,4
0.3333
0.0961
5
14,5
0.2000
0.0689
10
22,5
0.1000
0.0444
30
33,8
0.0333
0.0296
50
40,5
0.0200
0.0247
Tabel 4.2.2 Analisis Data Menggunakan Analisis Michaelis-Menten
Grafik 4.2.1. Hubungan Antara 1/[S] dan 1/V.
Penentuan nilai Vmaks dan Km didasarkan atas persamaan garis regresi grafik hubungan antara 1/[S] dan 1/V (Tabel 4.2.2), seperti ditunjukkan pada grafik 4.2.2 melalui analisis Michaelis-Menten. Berdasarkan pada grafik 4.2.2. dapat diketahui bahwa garis regresi 1/[S] dan 1/V adalah Y= a (0.0215) + b (0.23)x maka diperoleh 1/Vmaks = 0,0215, dan nilai Vmaks = 46,51. Sedangkan nilai Km/Vmaks = 0.23 sehingga nilai Km=10,69. Tinggi rendahnya hasil kinetika enzim dipengaruhi oleh kadar substrat, kadar enzim, pH, suhu, kovaktor, vitamin dan inhibitor.
Menurut Page (1981), kinetika enzim merupakan pengukuran dari suatu laju reaksi enzim dan dampak dari berbagi kondisi reaksi enzimatis. Dengan mempelajari kinetika enzim ini dapat mengetahui mekanisme katalitik enzim, peran enzim dalam metabolisme, skema aktivitas enzim dikendalikan dan skema suatu bahan dapat menghambat kerja enzim. Manfaat kinetika enzim adalah untuk mengetahui dan memahami fungsi katalitik dari suatu proses biologis. Manfaat lain yang tidak kalah penting adalah untuk memahami suatu fenomena biologi seperti pengaruh faktor lingkungan seperti cahaya, suhu, kelembaban dan sebagainya terhadap kinerja enzim. Selain itu, kinetika enzim juga digunakan sebagai prosedur pemurnian enzim.
Enzim amilase adalah enzim yang mengkatalisis pemecahan pati menjadi gula. Enzim amilase terbagi menjadi 3 macam yaitu α-amilase, β-amilase, γ-amilase. Enzim α-amilase mampu menghidrolisis pati dan glikogen melalui pemotongan internal ikatan α-1,4-glikosida secara acak, menghasilkan oligosakarida seperti maltosa dan glukosa. Dalam kehidupan manusia, enzim α-amilase digunakan dalam dunia industri pangan, tekstil, fermentasi, obat-obatan, kertas dan gula yang dimanfaatkan guna pengkatan produksi dan efisiensi setiap proses produksi (Lestari dkk., 2011).
Menurut Herawati (2010), senyawa pati merupakan sumber dari enzim amilase. Kandungan pati yang banyak terdapat pada pada biji-bijian, umbi-umbian, sayuran dan buah-buahan. Tanaman yang mengandung pati otomatis juga mengandung enzim amilase. Contoh tanaman yang mengandung enzim amilase antara lain adalah jagung, kentang, labu, pisang, ubi jalar, gandum, barley, beras, sagu, sorgum, ubi kayu, dan ganyong.
Enzim merupakan senyawa protein yang merupakan biokatalisator reaksi kimia pada sistem biologi, dimana enzim ini dapat mengkatalis (mempercepat) reaksi kimia di dalam sel maupun jaringan-jaringan makhluk hidup. Berbagai macam jenis enzim memiliki karakteristik yang berbeda-beda. Kecepatan kerja masing-masing enzim pun otomatis juga berbeda, Kecepatan kerja enzim dalam reaksi kimia inilah diukur dengan kinetika enzim.
Jenis enzim ada dua, yaitu enzim buatan (Crude Enzim) dan enzim asli. Crude enzim atau CE adalah campuran antara protein enzim dan protein non enzim yang membutuhkan proses pemurnian. Salah satu contoh crude enzim adalah Riboflafin deoksiribosa protein. Enzim ini dapat dilakukan pemurnian dengan memakai larutan amonium sulfat, hal ini digunakan untuk memisahkan enzim asparaginase dengan protein lainnya. Enzim asli atau murni merupakan enzim yang yang berasal dari protein enzim asli tanpa ada campuran dari bahan atau larutan kimia lainnya. Enzim murni juga tidak memerlukan pemurnian terlebih dahulu jika hendak dimanfaatkan untuk berbagai jenis kebutuhan seperti untuk pembuatan ragi, keju dan bahan lainnya yang memerlukan katalisis dari suatu enzim.
Gambar 4.2.2 Hasil Pengukuran Absorbansi
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, data yang di dapat untuk nilai enzim pada masing-masing kelompok terlihat berbeda-beda. Gabungan data golongan dapat dilihat dari gambar 4.2.1. Pada kelompok 1 nilai untuk enzim yang buatan CE sebesar 2,6815 dan untuk nilai enzim murni E sebesar 1,388. Hasil dari kelompok 2 menunjukkan nilai untuk enzim yang buatan CE sebesar 3,000 dan untuk nilai enzim murni E sebesar 1,4925. Berbeda halnya dengan kelompok 3 nilai untuk enzim yang buatan CE sebesar 2,9245 dan untuk nilai enzim murni E sebesar 1,2415 dan sedangkan hasil dari kelompok 4 nilai untuk enzim yang buatan CE sebesar 2,8735 dan untuk nilai enzim murni E sebesar 1,613.
Dari masing-masing data kelompok diketahui bahwa nilai terbesar untuk enzim buatan terdapat pada kelompok 2 sebesar 3,000, sedangkan nilai terkecil untuk enzim buatan terdapat pada kelompok 1 yaitu 2,6815. Untuk nilai enzim murni tertinggi terdapat pada kelompok 4 dengan nilai sebesar 1,613, sedangkan untuk nilai enzim murni terendah terdapat pada kelompok 3 yaitu senilai 1,2415. Dari data tersebut juga dapat diketahui bahwa nilai enzim CE lebih besar dibandingkan jika dibandingkan dengan nilai enzim E. Besar kecilnya nilai absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer dan bisa juga dilihat dari kepekatan larutan yang dihasilkan. Faktor-Faktor yang mempengaruhi absorbansi enzim antara lain pH, enzim, kandungan substrat dan kandungan dari enzim itu sendiri.
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Enzim merupakan senyawa protein yang mengkatalisis (mempercepat) reaksi rekasi kimia
Enzim amilase adalah endoenzim ekstraseluler yang secara acak menghidrolisis molekul pati untuk menghasilkan produk berupa dekstrin dan polimer progresif yang lebih kecil yang tediri dari unit glukosa.
kinetika enzim merupakan pengukuran dari suatu laju reaksi enzim dan dampak dari berbagi kondisi reaksi enzimatis.
Tinggi rendahnya hasil kinetika enzim dipengaruhi oleh kadar substrat, kadar enzim, pH, suhu, kovaktor, vitamin dan inhibitor.
Pengukuran akivitas enzim α-amilase dengan spektrofotometer didapatkan hasil absorbansi yang berbeda-beda.
Jenis enzim ada dua, yaitu enzim buatan (Crude Enzim) dan enzim asli.
5.2 Saran
Sebaiknya pada proses perlakuan enzim dilakukan dengan hati-hati untuk, perlu adanya koordinasi terlebih dahulu jika ada pergantia asisten sementara agar praktika dapat menyesuaikan diri dengan baik.
DAFTAR PUSTAKA
Askurrahman. 2010. Isolasi dan Karakterisasi Linamarase Hasil Isolasi dari Umbi Singkong (Manihot esculenta Crantz). Agrointek, 4(2) : 138-145
Das, S. 2011. Biotechnological Applications of Industrially Important Amylase Enzyme. Pharma and Bio Sciences, 2(1) : 486-496
Garcia, C.C., M. Guarnieri, dan E. Paccini. 2013. Inter-Conversion of Carbohydrate Reserves from Pollen Maturation to Rehydration in A Chili Pepper. American Journal of Plant Sciences, 4 : 1181-1186
Kotting, O., J. Kossmann, S,C. Zeeman, dan J.R. Llolyd. 2010. Regulation of Starch Metabolism : The age of enlightenment. Current opinion in Plant Biology, 13 : 1321-1329
Lestari P., N. Richana., A. Darwis, K. Syamsu dan U. Murdiyatmo. 2011. Purifikasi dan Karakterisasi α-Amilase Termostabil dari Bacillus stearothermophilus TII-12. AgroBiogen, 7(1) : 56-62.
Page D. 1981. Prinsip-Prinsip Biokimia. Terjemahan Soendoro, 1989. Jakarta : Erlangga.
Putra, G.P.G. 2009. Penentuan Kinetika Enzim Poligalakturonase (Pg) Endogenous dari Pulp Biji Kakao. Biologi, 13(1) : 21-24
Sloane, E. 1994. Anatomi dan Fisologi Untuk Pemula. Terjemahan oleh Palupi Widyastuti, 1995. Jakarta : EGC
Sumardjo, D. 2009. Pengantar Kimia. Jakarta : EGC
Syafi'i, I., Harjono, dan E. Martati. 2009. Detoksifikasi Umbi Gadung (Dioscorea hispida Denst) dengan Pemanasan dan Pengasaman Pada Pembuatan Tepung. Teknologi Pertanian, 10(1) : 62-68
Trismilah, Dan B. Wahyuntari. 2009. Pemanfaatan Berbagai Jenis Pati Sebagai Sumber Karbon untuk Produksi α-Amilase Ekstraseluler Bacillus sp SW2. Sains dan Teknologi Indonesia, 11(3) : 169-174
Yunianta, T. Sulistyo, Apriliastuti, T. Estiasih, dan S. N. Wulan. 2010. Hidrolisis Secara Sinergis Pati Garut (Marantha arundinaceace L.) oleh Enzim α-Amilase, Glukoamilase, dan Pullulanase untuk Produksi Sirup Glukosa. Teknologi Pertanian, 11(2): 78-86.
DOKUMENTASI
Ganbar 1. Proses pemipetan starch dengan alat mikro pipetet
Gambar 2. Proses pemanasan tabung reaksi yang terdapat enzim α-amilase didalamnya
Gambar 3. Proses pendinginan
Gambar 4. Proses inkubasi didalam oven
Gambar 5. Pengukuran dengan spektrofotometer
Gambar 6. Hasil yang tertera pada spektrofotometer
1/[S]
1/V
Hasil pengukuran absorbansi enzim amilase
Jumlah percobaan
Absorbansi pada λ 575 nm
