DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD DE LA INULINASA I.
OBJETIVO ESPECÍFICO Determinar el rango de linealidad y la actividad enzimática (actividades volumétrica y específica) de la enzima inulinasa (2,1-βD-fructan fructanohidrolasa [EC 3.2.1.7]) de un caldo crudo libre de células Kluyveromyces marxianus NRRL Y – 7571 en sus forma soluble.
II.
FUNDAMENTO TEÓRICO Los ensayos enzimáticos son métodos de ensayo químico para medir actividades enzimáticas. Son vitales para el estudio de las cinéticas enzimáticas y la inhibición enzimática. La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones, que deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad. La actividad expresa la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo, teniendo en cuenta el volumen de reacción. II.1.
Unidades Enzimáticas Las cantidades de enzima pueden ser expresadas en moles, como las de cualquier otro compuesto químico, o pueden ser cuantificadas en términos de actividad enzimática. En el Sistema Internacional de Unidades la unidad para la actividad catalítica es el katal (kat), pero es una unidad demasiado grande y suele usarse la unidad de actividad enzimática (UI).
1 kat = 1 mol sustrato convertido x s-1 = 6 x 107 UI
1 UI = 1 μmol sustrato convertido x min-1 = 16,67 nkat
Otra unidad comúnmente usada es la actividad específica. Ésta se refiere a la actividad de una enzima por miligramo (mg) de proteína, y se suele expresar en: μmol x min-1 x mg-1). La actividad específica da una idea de la pureza de la enzima. II.2.
Medida de la Actividad Enzimática
Salvo para unas pocas proteínas que pueden ser detectadas por medidas espectroscópicas directas, la presencia de una enzima es determinada por la medida de la reacción que cataliza, pudiéndose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la reacción. Además, la caracterización de una enzima implica la determinación de su actividad en diferentes condiciones. Por esto, la medida de actividad enzimática es de importancia para la investigación y análisis de proteínas.
La figura 1 muestra una curva típica de formación de un producto (P) en función del tiempo para una reacción catalizada enzimáticamente. Se observa que la velocidad disminuye con el tiempo, hecho que puede deberse a las siguientes causas: Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima. El transcurso de la reacción produce una disminución significativa de la concentración de sustrato (S). La reacción inversa puede comenzar a cursar y hacerse relativamente importante al aumentar la concentración de P. La medida adecuada de la actividad de una enzima requiere que se determine la velocidad inicial, esto es, obtener la tangente al origen del gráfico mostrado en la figura 1. De esta manera, las diferentes causas que producen la disminución de la actividad con el tiempo son eliminadas.
La
figura
2 ejemplifica medidas experimentales de la formación de P en función del tiempo (como en la fig.1), determinadas a tres concentraciones diferentes de S. Puede observarse que la velocidad (v) que se obtendría en cada caso dependería del intervalo de tiempo que se tomara para medirla. En este ejemplo, si medimos ‘v’ para cuando S=S1, obtendríamos el mismo valor, independientemente de haber elegido el intervalo 0-1 o el 1-2. En cambio para S=S2, la v obtenida sería distinta según el intervalo elegido. Para estos dos casos, la ‘v’ podría calcularse adecuadamente eligiendo el intervalo 0-1, donde la formación de P es función lineal con el tiempo. Para el ejemplo de la figura 2, la medida de ‘v’, cuando S=S3, usando el intervalo 0-1, no es enteramente confiable ya que se necesitan más puntos experimentales que verifiquen la condición de linealidad en la estimación de ‘v’ realizada. Además de considerar la variación de la velocidad con el tiempo, hay que tener en cuenta que la actividad de una enzima es afectada por otros factores como la temperatura, la fuerza iónica, el pH, la concentración de S, la cantidad de enzima en el medio de medida. Todos estos factores deben ser convenientemente conocidos y fijados al realizar medidas de actividad enzimática. II.2.1. Según el seguimiento de la reacción La medida de la actividad de una enzima requiere determinar el consumo de S o la aparición de un P de la reacción en función del tiempo. La determinación cuantitativa de S o de P puede hacerse por diferentes métodos analíticos según el caso: espectrofotométricos (los más comunes),
volumétricos, potenciométricos, espectrofluorométricos.
radioquímicos,
Los ensayos enzimáticos pueden dividirse en dos grupos según la manera en que se sigue la medición. Por una parte están los ensayos continuos, en los que el método ofrece una lectura continua de la actividad monitorizando a tiempo real el sustrato consumido o el producto generado. Por otra parte existen ensayos discontinuos, en los que la reacción se detiene en un punto y se mide la concentración de los sustratos o los productos. En el primer caso, la reacción enzimática podría seguirse continuamente en función del tiempo. En consecuencia, podrían obtenerse numerosos puntos experimentales (o trazos continuos si disponemos de un registrador automático) de la producción de Q en función del tiempo, a partir de un único medio de reacción. Esto es lo que se denomina método continuo de medida de la actividad enzimática. En otros casos, la medida de la actividad de una enzima no puede hacerse determinando continuamente un dado S o P en presencia de los demás componentes del medio de medida y es necesario separar el compuesto a cuantificar, para lo cual se requiere detener la reacción enzimática. En estos casos se utilizan métodos discontinuos, en los que la medida de S o de P requiere partir de un medio de reacción diferente. II.3.
Factores que afectan el ensayo Fuerza osmótica: La mayoría de las enzimas no pueden tolerar concentraciones de sal extremadamente altas. Los iones interfieren con los débiles enlaces iónicos de las proteínas. Temperatura: Todas las enzimas trabajan en un rango de temperaturas específicas del organismo al que pertenecen. Los aumentos de temperatura generalmente provocan un incremento de la velocidad de reacción. Esto se debe a alteraciones de la estructura de la proteína debidas a la interrupción de uniones iónicas que resultan
en la estabilización de la estructura tridimensional de la enzima. La temperatura óptima de las enzimas humanas se encuentra generalmente entre los 35 y los 40 °C pH. La mayoría de las enzimas son sensibles al pH y tiene un rango específico en el que se detecta actividad; todas tienen un pH óptimo. El pH puede detener la actividad enzimática al provocar la desnaturalización de la estructura proteica rompiendo enlaces iónicos y puentes de hidrógeno. La mayoría de las enzimas funcionan entre un pH 6 y 8. Saturación del sustrato. Aumentando la concentración de
sustrato aumenta la velocidad de la reacción o actividad enzimática. Sin embargo, el límite de saturación limita la velocidad. Una enzima está saturada cuando los sitios activos de todas las moléculas están ocupados la mayoría del tiempo. A partir del punto de saturación la reacción no puede acelerarse mediante adición de sustrato, sea cual sea la cantidad añadida. En un gráfico la velocidad de reacción habría alcanzado una meseta.
III.
MATERIALES E INSTRUMENTOS
IV.
Solución de sacarosa 0.2 – 0.6 M Solución de tampón citrato fosfato pH 5.0 Concentrado enzimático 07 Tubos de ensayo y gradilla Pipetas y micro-pipeta Agua hirviendo Hielo Baño maría Mechero y trípode
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL La experiencia se realizará a diferentes diluciones del concentrado enzimático inulinasa, 1:1; 1:2; 1:3, … , luego se graficará la concentración de sustrato o producto contra el tiempo de reacción y se expresará correctamente los valores de las actividades volumétrica (UI/ml) y específica (UI/mg): 1. Preparar 5 tubos de ensayo, agregar a cada uno 2.9 mL de solución de sacarosa a la concentración definida y a pH 5.0 y colocarlos en un baño maría durante 3 minutos.
2. Agregar 0.1 mL de concentrado enzimático inulinasa a cada uno de los 5 tubos de ensayo y dejarlos reaccionar por los tiempos requeridos para el experimento: 0; 5; 10; 15 y 20 minutos respectivamente. 3. Detener la reacción introduciendo cada tubo en baño de agua a 100°C por 3 minutos. Retirar los tubos del baño hirviendo y ponerlos en hielo. 4. Simultáneamente en otros dos tubos hacer los blancos para el sustrato y para la enzima. 5. Hacer la determinación de azúcares reductores. DIAGRAMA DE BLOQUES DEL PROCESO
Preparar
En 5 tubos de ensayo
Agregar
A cada tubo, 2.9 mL de Solución de sacarosa (10 g sacarosa + 0.5 L de tampón citrato fosfato a
Colocar
Agregar
Dejar
En baño maría a 55⁰C durante 3 min
0.1 ml de caldo crudo enzimático a c/u de los tubos de ensayo En reacción el tiempo requerido por el experimento: 0, 5, 10, 15, 20 min respectivamente
Detener
La reacción introduciendo cada tubo en agua a 100⁰C por 3 min
Retirar
Los tubos del agua hirviendo y ponerlos en hielo
Determina r
Azucares reductores Los blanco para sustrato (2.9 mL solución sacarosa + 0.1 mL tampón citrato fosfato) y para la enzima (2.9 mL tampón citrato
Preparar
Azucares (g/l) vs tiempo (min)
Graficar
V.
RESULTADOS Cuando se efectúa una reacción enzimática, se observa, un aumento en la concentración del producto y una disminución en la concentración del sustrato hasta que la reacción termina o alcanza su punto de equilibrio. El cambio observado en la concentración inicial respecto al tiempo se denomina velocidad inicial de reacción y, en general, se expresa en unidades internacionales o en moles de producto por minuto bajo condiciones específicas descritas. Se trabajó a diferentes concentraciones de enzima. A continuación se muestran las diferentes absorbancias de las muestras, a diferentes concentraciones de enzima para diferentes tiempos.
t
Dilución
0 5 10 15 20
01:10 01:10 01:10 01:10
Blanco Sustrato Blanco Enzima
E 1:1 Abs 540nm 0.575 0.635 0.977 1.135 1.203 0.043 0.055
P (g/L)
P (g/L)
0.963 1.062 1.631 1.894 2.007
0.787 10.448 16.137 18.765 19.896
0.078 0.098
25.000 20.000 15.000 Azucares Redcutores (g/L)
10.000 5.000 0.000 0 10 20 30 Tiempo (min)
12.000 10.000 8.000 Azucares Redcutores (g/L)
6.000 4.000 2.000 0.000
0 f(x) 10 20=30
=0 TiempoR² (min)
t
Dilución
0
01:01
5
E 1:2 Abs 540nm
P (g/L)
P (g/L)
0.383
0.643
0.568
01:05
0.696
1.164
5.744
10
01:05
1.234
2.059
10.218
15
01:10
0.794
1.327
13.193
20
01:10
0.976
1.630
16.220
0.002
0.009
Blanco Sustrato
Blanco Enzima
0.036
0.066
18.000 16.000 14.000 12.000 10.000 Azucares Redcutores (g/L)
8.000 6.000 4.000 2.000 0.000 0 10 20 30 Tiempo (min)
12.000 10.000
f(x) = 0.97x + 0.75 R² = 1 8.000 Azucares Redcutores (g/L)
6.000 4.000 2.000 0.000 0
5 10 15
Tiempo (min)
t
Dilución
0 5 10 15 20
01:04 01:04 01:08 01:08
Blanco Sustrato
E 1:4 Abs 540nm 0.787 0.395 0.79 0.506 0.495
0.037
P (g/L)
P (g/L)
1.315 0.663 1.320 0.848 0.830
1.247 2.585 5.213 6.714 6.568
0.068
Blanco Enzima
0.003
0.011
8.000 7.000 6.000 5.000 Azucares Redcutores (g/L)
4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 0 10 20 30 Tiempo (min)
8.000 7.000
f(x) = 0.38x + 1.09 6.000 R² = 0.98 5.000 Azucares Redcutores (g/L)
4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 0 5 101520 Tiempo (min)
CUADRO 1: RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA t 0 5 10 15 20
E 1:1 Dilución P (g/L) 0.885 01:10 10.546 01:10 16.235 01:10 18.863 01:10 19.994
E 1:2 Dilución P (g/L) 0.634 01:05 5.810 01:05 10.284 01:10 13.259 01:10 16.286
E 1:4 Dilución P (g/L) 1.247 01:04 2.585 01:04 5.213 01:08 6.714 01:08 6.568
GRAFICA 1: RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
25.000 20.000 15.000 Azucares Redcutores (g/L) E 1:1
E 1:2
10.000
E 1:4
5.000 0.000 0 10 20 30 Tiempo (min)
CUADRO 02: RESUMEN DE ACTIVIDADES ESPECÍFICA Y VOLUMÉTRICA
[ ] de a av ae Enzima (g/L.min) (UI/mL) (UI/mg)
R
2
t (min) linealidad
E 1:1
1.535
25.583
25.5833
0.9783
10
E 1:2
0.965
16.083
32.1667
0.9982
10
E 1:4
0.3806
6.343
25.3733
0.9838
15
ae =1.535
av=
ae [ ]enzima
ae =0.965
g 1 mol 10 6 u mol 3∗10−3 L UI x x x =25.583 L∗min 180 g 1 mol 1 ml mL UI mL UI =25.583 mL mg 1 mg
25.583 =
g 1 mol 106 u mol 3∗10−3 L UI x x x =16.083 L∗min 180 g 1 mol 1 ml mL
UI mL UI av= = =32.167 [ ]enzima mL mg 0.5 mg ae
ae =0.3806
8.03
g 1 mol 106 u mol 3∗10−3 L UI x x x =6.343 L∗min 180 g 1 mol 1 ml mL
UI mL UI av= = =25.373 [ ]enzima mL mg 0.25 mg ae
VI.
3.17
DISCUSIONES La actividad enzimática fue determinada por la aparición de azúcares reductores mediante el método DNS. La mezcla de reacción, conteniendo 2.9 mL de sustrato (sacarosa al 2 %) en un amortiguador de citrato fosfato pH 5.0, un equivalente a 0.1 mL de concentrado enzimático para tener un volumen final de 3 ml, fue incubada por 3 min a 55°C; al término del tiempo, la reacción fue detenida mediante inactivación térmica de 100°C durante 3 minutos y haciendo un shock térmico en hielo. Se procedieron hacer blancos tanto para el sustrato y para la enzima debida a que el caldo crudo libre de células de Kluyveromyces marxianus NRRL Y – 7571 en sus forma soluble no se encuentra completamente pura y hay que determinar algunos azúcares reductores presentes. La inulinasa (E.C. 3.2.1.7) es una enzima miembro de la familia de glicósido hidrolasa 32(GH32), la cual catalisa la hidrólisis de inulina a fructosa. La purificación de inulinasa microbiana extracelular es hecha por métodos convencionales de centrifugación, ultrafiltración, precipitación con solventes o sales, cromatografía de intercambio iónico y de permeación en gel, mientras que las inulinasa intracelular requiere disrupción celular antes de practicar los métodos reportados para las enzimas extracelulares (Kushi et al., 2000). Según Barreiro-Palma en “Comprobación de la selectividad de la técnica de precipitación por acetona de la inulinasa extracelular (E.C.3.2.1.7) de Kíuyueromyces marxianus CDBB-L-278”. La actividad enzimática de la inulinasa presente en los concentrados obtenidos se determinó mezclando 1 ml de cada uno de ellos con 9 ml de una solución de sacarosa al 4% y midiendo los azúcares reductores cada 60 seg después de iniciada la reacción, por un lapso de 4 min, manteniendo la temperatura a 50 °C. La solución de sacarosa (J.T. Baker) se preparó en solución amortiguadora de acetatos (0.1 M, pH 5.0). Los azucares reductores se determinaron por el método de Nelson-Somogyi, para lo cual se preparó una curva patrón con una mezcla equimolar de glucosa y fructosa (J.T. Baker). La actividad enzimática se midió en ug de glucosa-fructuosa producidos por minuto por ml de solución de enzima. Se utilizó un espectrofotómetro Shimadzu UV-160A. A partir de la concentración de proteínas y de las actividades enzimáticas de los concentrados de los sobrenadantes de los caldos
de fermentación se obtuvo la actividad enzimática específica la cual podemos observar en la última columna de la Tabla 1. Como podemos ver las actividades más altas se obtienen con la ultrafiltración en todos los medios de cultivo. Como era de esperarse la mayor actividad específica de inulinasa se obtuvo en el medio de inulina adicionado de fosfato de potasio, ya que este anión libera la inulinasa asociada a la pared celular de la levadura.
Según Corona-Gonzales (et. al., 2005) en “Optimización de la producción de inulinasas por saccharomyces sp. a partir de agave tequilana weber variedad azul”. Se determinó la actividad enzimática al colocar 1 ml de la enzima diluida (sobrenadante de muestras) y 15 ml de una solución al 5 por ciento de polifructosas de Agave tequilana weber variedad azul (sustrato), en buffer de acetatos (pH 4.8 y 0.1M), se prepararon una muestra y dos blancos, uno para el sustrato y otro para la enzima. Se colocaron las tres preparaciones en baño de agua a 50°C por 30 minutos, la reacción se detuvo a ebullición por 5 minutos y se determinaron azúcares reductores a 540 nm por el método de DNS. El análisis estadístico mostró que el mayor efecto se obtiene con una temperatura de 30°C, pH 5.5 y 30 g/L de polifructosas, con estas condiciones se produjeron 240.6 U/ml de inulinasas. La producción de inulinasas más alta reportada en cultivo en lote es 374 U/ml elaborada por Aspergillus niger van Teighem, una cepa mutada con luz UV. Trabajos recientes con Kluyveromyces bulgaricus informan producción de inulinasas de 124.4 U/ml y con Aspergillus niger 80 U/ml. Por otra parte, se ha descrito que la glucosa o fructosa libres en presencia de inulina por lo general moderan la formación de inulinasas. Para corroborar esta prueba el medio de cultivo (estéril) de las fermentaciones se analizó antes de inocular y se encontró que a pH 5.5 las polifructosas son el sustrato principal, sin embargo, a pH 4 las polifructosas son hidrolizadas completamente a fructosa y glucosa. De aquí que a valores de pH bajos exista represión
catabólica por azúcares residuales. Estos desenlaces demuestran que el pH influye bastante sobre la producción de la enzima para este microorganismo en particular, y se confirma la represión por azúcares libres. Se ha dicho que las concentraciones altas de la fuente de carbono causan represión catabólica con especies de Kluyveromyces por lo que se utilizaron menores a 20 g/L. La localización de las inulinasas (intracelulares o extracelulares) varía con los grados de crecimiento y las temperaturas por abajo del rango óptimo de crecimiento elevan la fracción de la enzima en el sobrenadante y disminuyen la enzima asociada a la pared. El proceso de extracción de la inulinasa, además de determinar el rendimiento y si la enzima es extracelular o intracelular, determina otras características como su peso molecular (MW), su modo de acción sobre la molécula de inulina, su actividad hidrolítica sobre la sacarosa, respuesta a los cambios de pH y temperatura, propiedades cinéticas y efecto de la concentración de sustrato (Chi et al., 2009). Se ha reportado diferentes valores de MW dependiendo de la fuente de microorganismo, del método de determinación, así por ejemplo para la K. marxianus var. bulgáricus varía de 57 a 77 KDa (Kushi et al., 2000) y para K. marxianus CBS 6556 se determinó un valor de 64 KDa (Rouwenhorst et al., 1990). Se ha determinado que las inulinasas pueden ejercer dos modos de acción diferentes sobre la molécula de inulina, una acción extrema y una acción interna, correspondiendo dos clases de inulinasas llamadas exo-inulinasas y endo-inulinasas respectivamente. Las exoinulinasas (74 KDa, pH 5.1 – 7.0) empiezan con la separación de la primera molécula de D-fructosa y va hasta el último enlace para liberar glucosa de la unidad de sacarosa y la endo-inulinasa (64 KDa) actúa sobre enlaces internos y rinde un conjunto de inulooligosacáridos (inulotriosa, inulotetrosa y inulopentosa) pero sin actividad invertasa. Estas propiedades dependen del origen microbiano de la enzima. De este punto de vista la mejor cepa sería la que tenga ambas propiedades, como el caso del A. ficuum (Pandey et al., 1999), dado que una mezcla de endo y exo inulinasa puede resultar en una mejor conversión de inulina a fructosa que solo utilizar enzimas puras aisladas, dado que las endo-inulinasas romperían las moléculas de inulina en muchos oligosacáridos, aumentando así los puntos de ataque para las exo-inulinasas, con el consecuente incremento de la velocidad de reacción de inulina a fructosa.
Por tanto queda probado que las exoinulinasas también ejercen actividad catalítica sobre la sacarosa, desdoblándola en glucosa y fructosa, es decir tienen actividad de invertasa. Se afirma que la actividad invertasa es mayor en enzimas producidas por levaduras que en aquellas obtenidas a partir de mohos (Ricca et al., 2007). Notoriamente una actividad invertasa de inulinasa es deseable. Laloux et al. (1991) sostienen que las inulinasas poseen sitios catalíticos comunes, pero diferentes sitios de enlace para la hidrólisis de inulina y sacarosa. La actividad y estabilidad depende de la respuesta de la enzima a los cambios de temperatura y pH. Los valores de temperatura y pH dependen del tipo de microorganismo usado como fuente, generalmente se da valores más altos para bacterias y levaduras que mohos. Así se tienen los rango de valores de pH, para mohos 4.5 – 7.0, para levaduras 4.4- 6.5 y para las bacterias 4.8 – 7.0 (Ricca et al., 2007). Singh et al. (2007b), determinaron que la exo-inulinasa de Kluyveromyces marxianus YS-1 exhibió considerable actividad a un valor de pH óptimo de 5.5 en que mantuvo estable su actividad catalítica al 100% durante 3 h a la temperatura óptima de 50 ºC. Se observa que todavía existe la necesidad de investigar la actividad y estabilidad de la inulinasa contra la temperatura, así como los modelamientos y simulación de procesos o cinética de desactivación de la enzima. Por otra parte se han evaluado los parámetros cinéticos de inulinasas provenientes de diferentes fuentes de microorganismos en torno a solo un valor de temperatura óptima. Kushi et al. (2000) determinaron los valores de los parámetros cinéticos aparentes Km y Vmax de la inulinasa purificada por HPLC de Kluyveromyces marxianus var. Bulgaricus ATCC 16045 en presencia de inulina y sacarosa siendo 86.9 mg/ml y 53.7 U/mg de proteína y 4.58 mg/ml y 441.0 U/mg de proteína a 55 ºC y pH 4.4 óptimos, respectivamente, demostrando que la enzima producida es una exo-inulinasa con más alta afinidad y reactividad por la sacarosa que por la inulina. De Paula et al. (2008) también determinaron los valores de los parámetros cinéticos de un caldo crudo exento de células conteniendo inulinasa de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus ATCC 16045 siendo de Km igual a 61.83 mM y Vmax igual a 37.60 U/mg de proteína a 55 ºC y pH 3.5 óptimos. VII.
CONCLUSIONES Se determinó el rango de linealidad y actividad enzimática tanto volumétrica como específica de la enzima inulinasa en una caldo
crudo libre de células obteniendo que para una concentración de enzima 1:1 el tiempo que se tomó para evaluar su linealidad fue de 10 minutos obteniendo una correlación R2=0.98 esto conlleva a un valor de 25.583 y 25.583, UI/mL y UI/mg respectivamente; para una concentración de enzima 1:2 el tiempo que se tomó para evaluar su linealidad fue de 10 minutos obteniendo una correlación R 2= 0.99 esto conlleva a un valor de 16.083 y 32.167 UI/mL y UI/mg respectivamente; para una concentración de enzima 1:3 el tiempo que se tomó para evaluar su linealidad fue de 15 minutos obteniendo una correlación R2= 0.98 esto conlleva a un valor de 6.343 Y 25.373 UI/mL y UI/mg respectivamente. VIII.
RECOMENDACIONES Los trabajos futuros estarán encaminados a probar concentraciones superiores a sustrato 2% para evaluar el incremento de actividad enzimática, variando condiciones de pH, T, y encontrar los valores más óptimos para la inulinasa en presencia de sacarosa e inulina. Es importante conocer más acerca de la actividad de la enzima en un medio compuesto con sacarosa para la producción de glucosa y fructuosa, evaluar parámetros como pH, T y evaluar datos que favorecen o limitan la actividad de la enzima, el conocimiento de su composición permitirá explotar mejor sus propiedades.
IX.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Barreiro-Palma, José Manuel. 1998. Comprobación de la selectividad de la tecnica de precipitacibn por acetona de la inulinasa extracelular (E.C.3.2.1.7) de Kíuyueromyces marxianus CDBB-L-278. 2. Castillo-Calderón, A.; Chamy-Maggi, R. 2010. Producción de inulinasa por levaduras de Kluyveromyces marxianus. Scientia Agropecuaria 1(2010) 235 – 245. 3. Chi, Z.; Chi, Z.; Zhang, T.; Liu, G. 2009. Inulinase-expressing microorganisms and applications of inulinases. J Appl Glycosci, 51: 247-254. 4. Corona-González, R.; Pelayo-Ortiz, C.; González-Álvarez, V.; Zuñiga-Partida, V. 2005. Otimización de la producción de inulinasas por saccharomyces sp. a partir de agave tequilana weber variedad azul. E-Gnosis , Vol. 3, Art. 8. 5. De Paula, F.; Cazetta, M.; Monti, R.; Contiero, J. 2008. Sucrose hydrolysis by gelatin-immobilized inulinase from Kluyveromyces marxianus var. Bulgaricus. Food Chemistry, 111: 691-695.
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