Bacillus Subtilis

BACILLUS SUBTILIS

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE BACILLUS SUBTILIS. B. subtilis es un microorganismo autóctono del suelo que a diferencia de Escherichia coli, prospera en la naturaleza, donde se encuentra ampliamente distribuido en muy diversos habitas y los cuales ha colonizado eficientemente debido a sus cualidades, entre las cuales podemos mencionar; el tener un programa genético que le permite formar esporas, crecer en un amplio rango de temperaturas, la capacidad de moverse, mostrar velocidades de crecimiento altas, producir enzimas hidrolíticas extracelulares y una variedad de antibióticos. Es una de las 40 especies reconocidas del género Bacillus, su identificación es sencilla: forma esporas termoresistentes, es catalasa y Voges-Proskauer positivo, su crecimiento en agar anaeróbico (agar nutritivo) es negativo y la hidrólisis del almidón es positiva. Se ha propuesto una subdivisión sobre la base de diferencias en la composición química de la pared celular, su distribución geográfica y a la frecuencia de transformación homo y heterogámica. B. subtilis subsp. subtilis subsp. nov. (NRRL NRS-744, ATCC 6051, cepa Marburg) y B. subtilis subsp. spizizenii subsp. nov. (NRRL B-23049), las cepas derivadas de la 168 y otras similares se agrupan junto con la especie tipo en el primer grupo y las derivadas de la cepa W23 y relacionadas en el segundo. La cepa 168 es ampliamente usada en la academia y en la industria para la obtención de productos comerciales además esta cepa es competente natural, es decir que en ciertas condiciones incorpora ADN foráneo de manera natural, lo cual facilita la manipulación genética, las estrategias de biología molecular con esta cepa y fue utilizada para secuenciar el genoma de B. Subtilis.

CONSIDERACIONES METABÓLICAS DE B. SUBTILIS. Durante el crecimiento de B. Subtilis en glucosa, sin limitación de oxígeno, se produce ácido acético como subproducto. Esto sucede como respuesta a un exceso en el flujo de entrada de glucosa y por tanto a un incremento en el flujo glicolítico a ácido pirúvico, el cual la célula es incapaz de utilizar en su totalidad para biosíntesis en el ciclo de Krebs. Este fenómeno ocurre cuando existe glucosa

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en el medio en concentraciones suficientes para controlar, por medio de la proteína CcpA (proteína de control catabólica), regiones reguladoras CRE (elementos de respuesta catabólicos) en los promotores de algunos genes entre los cuales están ackA y pta (acetato cinasa y fosfotransacetilasa) de la vía de producción de ácido acético e incluyendo también algunos genes de las rutas del catabolismo de la glucosa. [1]

Tipos de B. subtilis. Bacillus es un género altamente presente en la rizósfera de diversos cultivos debido a su capacidad de formación de esporas que le da una ventaja de supervivencia en la rizósfera vegetal [3]. B. subtilis es un microorganismo mesofilo y termófilo al mismo tiempo, ya que su tasa de crecimiento abarca temperaturas desde los 10 °C hasta los 100 °C. Otro aspecto importante es que también podemos encontrarlas a pH´s ácidos (4-5.5). La evaluación de los niveles de crecimiento tanto a bajo pH y temperatura baja en el tiempo, revelan un patrón bifásico que se explicaría por pequeños periodos de retraso del crecimiento en condiciones de estrés. Debido a las diferencias de adaptación fisiológica entre cepas de la misma especie se puede sugerir la existencia de una gran diversidad intraespecifica de los Bacillus aislados. Asimismo se encontraron correlaciones entre zonas de aislamientos con temperaturas de suelo más frías y las cepas con mejores niveles de crecimiento a 20ºC. Se encontró que las bacterias del género Bacillus constituían un grupo importante. Este género de bacterias Gram positivas tienen la ventaja de poseer diversos mecanismos

para

asegurar

su

sobrevivencia

ante

condiciones

físicas

desfavorables, bajo estas condiciones Bacillus spp. Inicia una serie de respuestas; si estas respuestas fallan para poder mantenerse en estado vegetativo se induce la esporulación. La habilidad de las especies de Bacillus de formar endosporas altamente resistentes les da una ventaja competitiva muy importante en un ambiente como el suelo. Esta capacidad de ser metabólicamente muy diversos les permite tener una colonización exitosa en el ambiente rizosférico. Entre algunos mecanismos promotores de crecimiento identificados en el género Bacillus, se

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encuentran la solubilización de fosfato, la síntesis de fitohormonas como el ácido indol acético y la capacidad de controlar algunos hongos patógenos en la rizósfera.

B. SUBTILIS COMO MAPA GENÉTICO. [1] Un estudio realizado por investigadores del Centro de Astrobiología (CAB/CSICINTA) arroja luz sobre la función del ADN extracelular en la evolución mediante transferencia génica horizontal, es decir, entre microorganismos similares, en la bacteria Bacillus subtilis. El ADN extracelular (eDNA, por sus siglas en inglés) es material genético libre que se encuentra en el ambiente donde habitan microorganismos, debido a la muerte celular de los mismos o bien mediante una liberación específica que pueden realizar determinados microorganismos. Entre sus posibles funciones se encuentran su uso como nutriente, la capacidad para ayudar en la cohesión de las células dentro de las comunidades microbianas y también pueden contribuir en la transferencia de material genético entre la misma o diferentes especies.

ESTEQUIOMETRIA DE B. SUBTILIS. Entre las etapas de mayor importancia en los procesos industriales se encuentran aquellas relacionada con la determinación de términos energéticos, los que conllevan en su solución la aplicación de la primera ley de la termodinámica, es decir, el planteamiento y solución de los balances de energía y el estudio de las limitaciones al intercambio energético representado por el segundo principio, una de cuyas acepciones puede ser el balance de exergía. Tanto en una como en otra expresión se necesitan del cálculo o estimación de propiedades.

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Balance

de

exergía

La exergía se define como la capacidad específica de trabajo de un flujo y se designa por: e = (h – h0) – T0 (s – s0) Donde: h:

Entalpía.

s:

Entropía.

T:

Temperatura.

Los

parámetros

p

y

T

representan

al

flujo

y

p0 y

T0 al

medio.

Este concepto es muy cómodo al analizar el grado de perfección termodinámica de cualquier aparato térmico. A un aparato térmico entra un agente de transformación en condiciones p1 y T1 y sale en condiciones p2 y T2; dentro del aparato realiza un trabajo útil. Si el proceso es reversible este trabajo útil será máximo: Wrev. máx. = (h1 – h2) - T0 (s1 – s2) = e1 – e2 Si el proceso es irreversible, existe una pérdida en la capacidad de trabajo: Wútil = W rev. máx. - W perdido La exergía se define como el trabajo máximo que puede obtenerse de la masa de una corriente al llevarla al equilibrio (físico: presión y temperatura, y químico: composición) con el ambiente y puede ser calculada considerando la suma de los efectos físicos y químicos; expone, además, cómo el método de análisis energético permite considerar de manera integral los aspectos energéticos, económicos y ecológicos al analizar procesos industriales. Existen varios métodos para evaluar la exergía química apoyado en la energía libre de formación de los compuestos involucrados, los grupos funcionales, los electrones disponibles o el poder

calorífico.

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Como aproximación puede tomarse como exergía química el poder calorífico del compuesto en cuestión, situación perfectamente aplicable al caso de la biomasa. Debe tenerse presente que cuando no existen procesos de reacción puede asumirse la exergía física como la exergía tota. Cuando ocurren reacciones químicas, generalmente el valor de toda la exergía puede ser asumido como el de la «química». Todas estas sugerencias implican la asignación de un valor prácticamente utilitario a la exergía específica en una situación determinada, como lo es el caso del bagazo en el central azucarero: a la salida del molino se puede considerar sólo la exergía física, pero cuando se usa de combustible en el horno, se

asume

el

valor

del

calor

de

combustión

(exergía

química).

El rendimiento exergético (ηe) mide el grado de perfección termodinámica de un sistema y se define como la relación entre el beneficio y el gasto exergético:

Aparatos que producen trabajo útil:

Aparatos que no producen trabajo útil: En cualquier caso, si los procesos son reversibles: ηe = 1. Este límite superior significa que a diferencia del análisis basado en el rendimiento energético, existe un valor propio para la comparación del rendimiento energético al cual se debe aspirar, y este es 100 %.

CINÉTICA DE CRECIMIENTO. El oxígeno es el aceptor de electrones mas utilizado en la naturaleza, sin embargo y debido a su poca solubilidad en medios acuosos se agota fácilmente y el ambiente tiende a volverse anaerobio. Una vez que el oxígeno se ha consumido,

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una serie de procesos de oxidación anaeróbica sigue en secuencia. Dicha secuencia está influenciada por la presencia de diversos aceptores finales de electrones. Después de la desaparición del oxígeno, sigue la reducción de nitratos, la reducción de sulfatos y la formación de metano. [2] Se define como fermentación al proceso que se da cuando el sustrato es catabolizado y algún intermediario de la ruta sirve a su vez como aceptor del poder reductor producido, dando como producto final una nueva molécula y energía en forma de ATP producido por fosforilación a nivel de sustrato. Las enterobacterias, levaduras, bacterias lácticas y muchos otros microorganismos pueden fermentar azúcares como la glucosa o la lactosa, incluso parcialmente en presencia de oxígeno. Los

productos

acumulados

durante

a

fermentación

ácido-mixta

con

enterobacterias son: etanol, ácido acético, ácido láctico, ácido fórmico, ácido succínico, CO e hidrógeno. Estos productos se generan a partir de varias rutas 2

metabólicas que tienen como precursor al ácido pirúvico (fig. 1.1). La vía del butanodiol se presenta en microorganismos de los géneros Klesiella, Serratia y Bacillus, entre otros. Se lleva a cabo en tres reacciones a partir del ácido pirúvico, teniendo como intermediarios al acetolactato y la acetoina. Los diversos productos de estas vías forzosamente deben lograr un balance redox. Está reportado que cuando hay limitación de oxígeno, B. subtilis lleva a cabo la fermentación ácido mixta y formación de butanodiol a partir de ácido pirúvico, el cual es convertido por la piruvato deshidrogenasa en acetilCoA. El crecimiento de B. subtilis cuando fermenta glucosa es muy poco, y se ha encontrado que se incrementa la capacidad fermentativa y el crecimiento cuando se

adicionan

simultáneamente

piruvato

butanodiol, acetoina, lactato y acetato.

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y

glucosa,

obteniéndose

etanol,

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Fig. 1.1.- fermentación acido mixta.

CONSUMO DE SUSTRATO

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Estos incluyen fuentes de carbono orgánico, nitrógeno, fósforo, azufre e iones metálicos incluyendo el hierro. Las bacterias secretan moléculas pequeñas que unen el hierro (sideróforos, por ejemplo;

enterobactina, micobactina). Los

sideróforos (con el hierro unido) son entonces internalizados vía receptores de mebrana por la célula bacteriana. El huésped humano también tiene proteínas transportadoras de hierro (por ejemplo: la transferrina). Por lo tanto las bacterias que compiten con el huésped por el hierro de forma ineficiente no son patógenos exitosos. El desarrollo de nuevas tecnologías para obtener productos químicos de gran volumen están basadas en el uso de sustratos abundantes y económicos, tales como los residuos agroindustriales, los cuales contienen principalmente mezclas de xilosa, glucosa y celobiosa. Bacillus subtilis puede utilizarse para estos fines por su capacidad de metabolizar una amplia variedad de azúcares. Sin embargo sus características metabólicas para usar xilosa y celobiosa en aerobiosis y para fermentar glucosa, xilosa y celobiosa no han sido estudiadas. Teniendo en cuenta que La aplicación de la estequiometría requiere conocer los rendimientos. Estos se definen como la relación entre el producto obtenido y el sustrato consumido (usualmente la fuente de carbono y energía). Por ejemplo el rendimiento celular se define como: Y¨x   s

dX dS

X y S representan la concentración de biomasa y sustrato respectivamente. Por lo que al reordenar esta ecuación y derivando con respecto al tiempo tenemos: 

dS 1 dX   dt Y¨ x dt s

Ó tambien,

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rs 

1  rx Yx s

Usando rx    X en la ecuación anterior tenemos rs 

 Yx s

X .

La cual puede ser expresada también como rs  qs  X donde qs es la velocidad específica de consumo de sustrato. Al comparar las dos ecuaciones anteriores tenemos:

qs 

 Yx s

es evidente que el crecimiento puede ser caracterizado mediante tres parámetros: KS, um e Yx/s. Estos dependen tanto del microorganismo como del medio de cultivo empleado, por lo que su evaluación debe realizarse para cada caso en particular.

5.3 CONSUMO DE SUSTRATO PARA

MANTENIMIENTO Los microorganismos requieren energía para su mantenimiento y para procesos tales como la motalidad. La ecuación rs 

1  rx establece que el consumo de sustrato sólo es posible Yx s

cuando hay crecimiento, sin embargo cuando el sustrato considerado es la fuente de carbono y energía, puede darse el caso en que el crecimiento es nulo (r x = 0) y el consumo de sustrato no. A este consumo de sustrato que no redunda en aumento de biomasa se lo asocia con el mantenimiento de funciones vitales tales como recambio de material celular, mantenimiento de gradientes de concentración y movilidad.

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La expresión cinetica del mantenimiento es: rm  km  X

Dónde: km es el coeficiente de mantenimiento. El mantenimiento se puede expresar cuantitativamente como la masa de sustrato oxidado por unidad de masa celular y por unidad de tiempo necesario para proveer de energía al proceso. Que esta descrita por:

rm 

k ,m  X Ym s

Donde: k´m e el coeficiente de mantenimiento especifico (t-1) y Ym/s es la producción de energía de mantenimiento por unidad de sustrato consumido por el proceso.

5.3

REQUERIMIENTO

DE

OXIGENO Los aerobios obligados deben ser capaces de crecer en presencia de oxígeno

y

no

llevan

a

cabo

fermentación. Los anaerobios obligados no llevan a cabo fosforilación oxidativa. Más aún, ellos mueren en presencia de oxígeno ya que carecen de ciertas enzimas como la catalasa [la cual rompe el enlace del peróxido de hidrógeno, H2O2, a agua y oxígeno], la peroxidasa [por la cual NADH+ H2O2 se convierten a NAD y O2] y la super-óxido dismutasa [por la cual el super-óxido, O2; es convertido a H2O2]. Estas enzimas de-toxifican los radicales libres producidos a partir del peróxido de hidrógeno y del oxígeno producidos durante el metabolismo aerobio (en presencia

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de oxígeno). Los anaeróbios aerotolerantes son bacterias que respiran anaeróbicamente, pero pueden sobrevivir en presencia de oxígeno. Los anaerobios facultativos pueden llevar cabo tanto la fermentación como la respiración aeróbica. En presencia de oxígeno, la respiración anaeróbica de estos organismos generalmente se apaga y entonces respiran aeróbicamente. Las bacterias micro-aerofílicas crecen bien a bajas concentraciones de oxígeno, pero no resisten altas concentraciones. 5.4

EFECTO

DEL

PH

Y

LA

TEMPERATURA

SOBRE

EL

CRECIMIENTO Los microorganismos pueden crecer en una variada gama de pH que va desde pH = 2 para los acidófilos hasta pH = 11 para alcalófilos. En general los microorganismos que toleran pH ácidos no toleran pH alcalinos y viceversa. Independientemente del pH que pueda soportar un microorganismo, es importante conocer cuál es el pH óptimo para el crecimiento. En la fig.1 está representada en forma general la variación de um con el pH para hongos y bacterias. De la misma surge claramente que en general los hongos tienen un pH óptimo cercano a 5 mientras que para bacterias se da alrededor de pH = 7; además debido a la forma "achatada" de las curvas, variaciones de 0.5 unidades de pH alrededor del óptimo no tienen mayor influencia. Durante el crecimiento los microorganismos modifican el pH del medio de cultivo, normalmente haciéndolo disminuir; por tal motivo es frecuente incluir en el medio substancias que actúen como tampón (buffer) a fin de evitar que el pH se aleje del óptimo. El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada reacción química individual, de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento de ésta resulta en una mayor velocidad de reacción. Esto se traduce en un aumento de pm con la temperatura (ver Fig.2).

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En el caso del B. Subtilis tiene un rango de ph de 4,9 - 9,3 y crecen a temperaturas de 10 - 48º, pero la temperatura óptima es entre 28 - 35º.

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