BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO MÔN HỌC Kiểm Nghiệm Vi Sinh Thực phẩm
Khoa: Công nghệ Thực Phẩm Lớp: DH07VT Nhóm thực hiện:1. Nguyễn Thị Ngọc Mai _ MSSV: 071560 2. Nguyễn Thị Thảo_ MSSV: 07156038
Mục lục:
Mục lục:
1. Giới Giới tiệu tiệu về về Bacil Bacillus lus cereus cereus:: Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, theo phân loại quốc tế thuộc giới Bacteria, ngành: firmicutes, lớp: Bacilli, bộ: Bacillales, họ: Bacillaceaem, chi: Bacillus, loài: Cereus.Trong chi Bacillus này ngoài loài cereus còn có một số loài như: Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus thuringiensis, Bacillus natto, Paenibacillus larvae . Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều. 1.1. Đặc điểm Bacillus cereus: Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5–1,5 x 2-4 µ. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động.
Hình 1: Hình ảnh Bacillus cereus trên kính hiển vi
Hình 2: Hình ảnh Bacillus cereus trên môi trường BA 1.2. Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mọc. Hiếu khí và kị khí tùy nghi. Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-40 oC. pH 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2 trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì. Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng. Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh có vòng sáng. Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng. Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn 1.3. Tính chất sinh hóa: Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên men mannitol. Khử nitrat thành nitrit. Phản ứng VP (+) Phân giải Tyroxin Catalase (+), Citrate (+) Mọc trên NB + 0,001% lyzozym 1.4. Tính chất gây bệnh- Độc tố-Triệu chứng: Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm. Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng. • • • •
• •
•
•
•
• • • • •
•
•
Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn. Triệu chứng trúng độc: Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc. Biểu hiện đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn. Bệnh có thể kéo dài 24 giờ. Trường hợp nhiễm type 1 có triệu chứng đau bụng tiêu chảy nhưng không sốt. Bắt đầu sau 4-16 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn và kéo dài 12-24 giờ. Phòng: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn hâm nóng trên 80 oC trước khi ăn So sánh độc tố type 1 và type 2: •
2.Đặc tính 5. Bền với nhiệt 8. pH 11. Tính nhạy
3. Type 1 6. 45oC/30 phút 9. ổn định pH 4-11 12. Nhạy với enzym protease và trysin
4. Type 2 7. 120oC/90 phút 10. ổn định pH 2-11 13. Kháng pepsin và trypsin
1. Cơ chế sản sinh độc tố Bacillus cereus: 1.1Giới thiệu chung về độ tố của B.cereus Vì ngộ độc thực phẩm do B.cereus không phải là loại bệnh được nói đến nhiều, sự thật là phạm vi ảnh hưởng của loại bệnh này ít được biết đến, được báo cáo là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và chiếm khoảng 33% trong tổng số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm (đa số các nguyên nhân là do vi rút) ở Norway (1988-1993), 47% ở Iceland (1985-1992). Tỷ lệ thấp hơn nhiều được báo cáo ở các quốc gia khác bao gồm U.S (1.3%) và Canada (2.2%). Ở Anh và xứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995. Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau, thêm vào đó, những ngộ độc khác doB.cer eus gây ra là sự nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng mắt. Hai loại ngộ độc thực phẩm là nguyên nhân bởi rất nhiều nhấn tố gây độc hại khác nhau. Bệnh nôn mửa được mô tả với thời kỳ ủ bệnh ngắn (1-5h), nguyên nhân gây ra ngộ độc này là do chuỗi polypeptide nhỏ (cereulide) đã hình thành trước ở trong thực phẩm (ví dụ như Gạo). Triệu chứng bao gồm sự buồn nôn, sự nôn mửa ra và đau dạ dày
(bảng 1-1). Bệnh tiêu chảy được mô tả với thời kỳ ủ bệnh từ 8 – 16h, triệu chứng bao gồm đau bụng, đi tiêu ra nhiều nước và đau thắt trực tràng (bảng 1-2). Nguyên nhân của triệu chứng này là do sự sản sinh ra độc tố đường ruột trong thời kỳ sinh trưởng củaB.cer eus trong ruột non từ việc ăn vào bụng các tế bào hay bào tử của vi khuẩn. Thông thường cả hai triệu chứng này là tương đối nhẹ, kéo dài ít nhất là 24h và không phải luôn luôn đòi hỏi phải dùng thuốc. Tuy nhiên, nhiều trường hợp ngộ độc gây tiêu chảy có thể xảy ra, nguyên nhân có lẻ là do các tế bào biểu mô chiếm đa số trong ruột non khi các bào tử củaB.cer eus sinh sôi nảy nở và sản sinh ra độc tố đường ruột. Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B. Cereus Tính chất/ Hoạt động Mô tả Liều nhiễm độc Số lượng B.cereus: 105 - 108 tb/g thực phẩm Khối lượng độc tố: 12 - 32 μg/kg Độc tố được sản sinh ra Trong thực phẩm (25 - 30oC) Thời kỳ ủ bệnh ½ đến 5h Khoảng thời gian mang bệnh 6 - 24h Triệu chứng Buồn nôn, nôn mửa Loại thực phẩm thường gặp nhất Cơm nấu chin / chiên, mì ống, phở Tên của độc tố Cereulide Cấu trúc của độc tố Chuỗi polypeptide [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] Khối lượng phân tử 1.2 kDa Sinh kháng thể Không (none) Hoạt động sinh học trên người Gây nôn Cơ quan nhận cảm 5-HT3 Cytotoxic No Hoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bào Khả năng chịu nhiệt 90 phút ở 121oC Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không Việc sản sinh ra độc tố như thế nào Chưa biết, nhưng có thể liên quan đến enzyme 2.2. Cơ chế gây bệnh 2.2.1 Triệu chứng nôn mửa Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của độc tố gây nôn mửa đã được thể hiện ở bảng 1-1. Sự giải thích về cấu trúc của độc tố emetic đã đưa đến những hiểu biết sâu sắc hơn về triệu chứng này. Độc tố emetic có tên là cereulide và là một chuỗi polypeptide ba lần lặp lại của bốn amino và/hoặc oxy-acid (bảng 1-1) Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng nôn mửa do Bacillus cereus sản sinh ra. Bài báo này giải quyết được nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp độc tố này dựa trên sự bất thường của độc tố depsipeptide từ Cacbon số 13 (13C) liệt kê ra trên 3 loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) trên môi trường
tổng hợp trung gian. Sự phân tích này được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino hay oxy acid qua NMR và ESI – MS của phương pháp kính quang phổ trên cereulide và sản phẩm thủy phân là các dipeptide của nó. Sự hợp nhất của nguyên tử cacbon số 13 (13C) là chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu và L-Val, trong khi đó chỉ có 40%13C là kết hợp trong D-Ala của Cereulide. Bacillus cereus được biết là nguyên nhân gây ra hai loại ngộ độc thực phẩm, đó là triệu chứng nôn mửa và triệu chứng tiêu chảy. Phần lớn những ngộ độc do Bacillus cereus gây ra chỉ mới phát hiện sau này. 2.1.1 Triệu chứng tiêu chảy Triệu chứng tiêu chảy do ít nhất hai loại độc tố đường ruột sản sinh ra trong suốt quá trình sinh trưởng của B.cereus trong ruột non. Sự hình thành độc tố đường ruột đầy đủ trong thực phẩm để dẫn đến ngộ độc thực phẩm về lý thuyết mà nói là có thể, nhưng đối với thực phẩm phục vụ cho con người thì đây là điều không thể chấp nhận. Điều này xảy ra khi, số lượng B.cereus tồn tại trong thực phẩm thấp nhất là 106/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường ruột phải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và enzyme proteolytic của tá tràng. Những nhân tố này sẽ làm giảm một cách nhanh chóng hoạt động của độc tố đường ruột thấp ơn 1% sơ với mức độ ban đầu. Thời gian tương đối dài giữa việc ăn vào những sinh vật này với việc xuất hiện những triệu chứng của bệnh. Đặc điểm của triệu chứng tiêu chảy được thể hiện trong bảng 1-3. Mức độ biến đổi của liều lây nhiễm có lẽ do khả năng sản sinh ra các độc tố đường ruột khác nhau và do tính nhạy cảm của mỗi cá nhân là khác nhau. Bảng 1-2 Đặc điểm bệnh tiêu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B. cereus Đặc tính Liều gây nhiễm Thông thường là 105/g hoặc /ml Độc tố được sản sinh ra Trong ruột non Loại độc tố Protein Thời kỳ ủ bệnh 8 – 16h Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24h Triệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi tiêu nhiều nước, thỉnh thoảng buồn nôn Bào tử của B. cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là được phân biệt để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế bào biểu mô của người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B. cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ
tập trung khoanh vùng ở vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng. Một điều có thể xảy ra đối với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn như đã quan sát. Số lượng và loại độc tố liên quan đến triệu chứng tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm từ B. cereus là đề tài tranh cải từ nhiều năm qua và cho đến nay vẫn còn đang tranh luận. Cả dạng đơn và dạng phức của độc tố đường ruột được xác định là nguyê nhân gây ra bệnh tiêu chảy. Có hai sự khác biệt trong ba hợp phần của độc tố đường ruột được sản sinh bởi các thực phẩm nhiễm B. cereus, một số nhóm cũng được mô tả độc tố đường ruột một hợp phần với các phân tử trọng lượng khoảng từ 40 – 100 kDa. Một số hiểu biết hiện tại về độc tố đường ruột của B. cereus được thể hiện ở bảng 1-3 Bảng 1-3 Properties of Enterotoxin Isolated from Bacillus cereus Enterotoxin/Reference Molecular Weight Biogogical Test Used DNA Sequenced Once main Pro 50 kDa Positive on: rabit loop tests No and two other pro vascular permeability tests component and mouse lethality Three component 38.0 kDa Positive on: rabit loop tests, No 39.5 kDa vascular permeability tests, 43 kDa and Vero call test One component 45 kDa Positive on: rabit loop tests No vascular permeability tests, and mouse lethality tests One toxin component 40 kDa Positive on: Vero cell test No and one non-toxin 48 kDa and Ca-co2 (human intestinal component epithelial cells) cell tests One component 41 kDa Positive on: mouse loop tests, Yes vascular permeability tests and mouse lethality tests Những nghiên cứu gần đây về độc tố đường ruột đã khẳng định rằng cả độc tố chỉ có một hợp phần và độc tố nhiều hợp phần đều có liên quan. Những nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp giúp thiết lập nên các giải pháp ngăn ngừa các độc tố sinh ra từ B.cereus trong tương lai gần. Hoặc có thể đưa ra các phương pháp giúp phát hiện ra độc tố cereulide trong tự nhiên bất cứ lúc nào. 3.Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm
Để kiểm soát Bacillus cereus thì có nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào thời gian cho kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính là phương pháp truyền thống và phương pháp phân tích nhanh. 3.1. Các phương pháp truyền thống: Đặc điểm và nguyên tắc: Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật trên các môi trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các loài vi sinh vật khác nhau. Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này còn một số hạn chế như độ nhạy không cao, tốn nhiều nhân công và thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa. Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây bệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng, B.mycoides, B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa. Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0.001% lysozyme, được trình bày trong bảng sau:
Đặc tính
Loài B.cereus B.thuringiensis B.mycoides
B.anthracis
B.megaterium
Gram
+(a)
+
+
+
+
Catalase
+
+
+
+
+
Di động
+/-(b)
+/-
_(c)
_
+/-
Khử nitrate
+
+
+
+
_(d)
Phân hủy Tyrosine
+
+
+/-
_(d)
+/-
Kháng lysozyme
+
+
+
+
_
Phản ứng với lòng đỏ trứng
+
+
+
+
_
Lên men glucose
+
+
+
+
_
Phản ứng VP
+
+
+
+
_
Sinh acid từ manitol
_
_
_
_
+
Tan máu
+
+
+
_(d)
_
Các đặc tính của Bacillus nhóm I a + :90 - 100% các chủng dương tính ; b +/- : 50% các chủng dương tính; c - : 90 – 100% : các chủng âm tính;d - : Hầu hết các chủng âm tính. Do có hình thái đặc trưng trên các môi trường thạch chọn lọc như : Mannitol-Egg Yolk- Polymycin (MYP), Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA), nên B.cereus còn được phát hiện và định lượng bằng môi trường này. Ngoài ra B.cereus cũng được định lượng bằng phương pháp MPN. Qui trình phân tích: 25g mẫu + 225ml môi trường pepton đệm (BPW) -> đồng nhất bằng Stomacher/1 phút để có độ pha loãng 10-1 -> pha loãng thành dãy thập phân để có các độ pha loãng thích hợp. Định lượng B.cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: Phát hiện bằng môi trường chọn lọc: Trải 0.1ml mỗi độ pha loãng lên các môi trường thạch rồi ủ 24h ở 30oC: MYP: do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạo thành MOSSE: khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng. Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiên chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định B.cereus. Các phản ứng khẳng định: Nhuộm Gram:
Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống thạch dinh dưỡng -> ủ ở 30oC/ 24h -> nhuộm Gram -> quan sát dưới kính hiển vi tế bào nhuộm bằng vật kính 100X nhúng trong dầu. Các bước nhuộm Gram: Chọn phiến kính sạch -> vẽ lên kính 1 vòng tròn, đường kính 2cm -> ở vị trí tương ứn với vòng tròn, mặt còn lại nhỏ vài giọt nước cất thành 1 giọt lớn -> chuyển một ít sinh khối khuẩn lạc vào giọt nước trên kính bằng que cấy vòng -> khuấy nhẹ bằng đầu que cấy -> dung dịch huyền phù đồng nhất -> bôi đều trong khu vực của vòng tròn -> để yên cho vệt bôi khô -> đưa phiến kính ở vị trí cạnh vệt bôi qua lại trên ngọn lửa đèn cồn/đèn Bunsen để cố định vệt bôi (tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa) Tương tự cho hai chủng vsv đối chứng trong cùng một phiến kính khác: E.coli làm chủng đối chứng cho Gram (-) và Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho Gram (+). Có hai phương pháp nhuộm Gram: Phương pháp Jensen: nhỏ vài giọt dd methy violet lên vệt bôi -> giữ yên 20giây -> dùng bình xịt nước lên vệt bôi -> rửa sạch phẩm nhuộm -> nhỏ vài giọt KI/I2 lên vệt bôi/ để yên 1phút -> dùng bình xịt cồn 95% lên vệt bôi -> rửa phẩm nhuộm đến khi mất màu -> để yên vài giây -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd safranin/30giây -> rửa sạch bằng nước, thấm nước dư bằng giấy lọc. Phương pháp Hucker: tương tự như phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi bằng dd crystal violet/ 1 phút -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd KI/I2 / 1 phút -> khử màu bằng cách xịt cồn 95% -> rửa lại bằng nước -> nhuộm màu bằng dd safranin/2phút. •
•
Kết thúc qui trình nhuộm, quan sát dứơi kính hiển vi cho ta thấy tế bào nhuộm Gram (+) có màu xanh tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng (E.Coli). B.cereus là trực khuẩn lớn, Gram (+), thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi; bào tử hình bầu dục, không có dạng bào tử nang. Dùng que cấy vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh dưỡng vào 0.5ml BPW vô trùng. Tạo huyền phù hóa dịch cho các phản ứng sinh hóa phía sau. Thử nghiệm lên men glucose: Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth -> ủ ở 35oC/ 24h, kị khí -> lắc mạnh ống nghiệm -> quan sát độ đục ( sự phát triển); sự chuyển màu môi trường từ đỏ sang vàng ( chứng tỏ có sự sinh acid glucose trong điều kiện kị khí).
Thử nghiệm khả năng khử nitrate: cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate Broth -> ủ 35oC/24h -> bổ sung vài giọt dd của thuốc thử nitrate -> có màu cam xuất hiện trong 10phút (chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit)
•
Ống A đã cấy vi khuẩn trên canh trường Nitrate Broth chưa bổ sung thuốc thử
•
Ống B và C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine và sulfanilic acid. Ống B cho kết quả dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết quả âm tính với nitrite.
Thử nghiệm VP: Ở vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ glucose qua con đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là pyruvic acid. Để khôi phục dự trữ NAD+ trong tế bào phục vụ cho con đường đường phân ở các loài vi sinh vật, sau đó pyruvic acid tiếp tục được chuyển hóa khác nhau tạo ra các sản phẩm lên men cuối cùng khác nhau. Họ Enterobacteriacceace có đặc tính chung là lên men sinh tổng hợp acid như acid formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2. Họ này có thể được chia thành hai nhóm là nhóm không sinh 2,3-butanediol (ví dụ : E.coli) và nhóm sinh 2,3-butanediol (ví dụ: Enterobacter). Phân tử 2,3-butanediol có thể được chuyển hóa qua lại thành acetoin: trong điều kiện có oxi và môi trường có tính kiềm nhờ xúc tác của enzyme 2,3-butanediol dehydrogenase. Ngược lại acetoin có thể bị khử thành 2,3 butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase; ngoài ra acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệm VP. Như vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các loài trong Enterobacteriaceace dựa trên sự oxi hóa acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxi hóa acetoin thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong peptone kết tụ thành phức diacetylguanidine có màu đỏ. Trong thuốc thử Koblentz và O’Meara có chứa creatine có tác dụng bổ sung nguồn nhân guanidine.
Các bước tiến hành: Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), có pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối (trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz thì cấy nhìu sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24h trên môi trường KIA hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 37oC / 24-48h hoặc đến 10 ngày. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Có 3 loại thuốc thử VP là: Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B là 40% KOH hoặc NaOH. Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%, dung dịch B là 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH. Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH •
•
•
Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường. Lắc nhẹ ống 1 phút để oxi hóa acetoin. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4h. Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đối chứng như E.Coli (VP -) bề mặt môi trường không đổi màu và Enterobacter cloacae (VP +) có màu đỏ trên bề mặt môi trường.
Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng tyrosine -> ủ 35oC/48h -> xuất hiện khuẩn lạc ( chứng tỏ tyrosine bị phân hủy) Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2.5ml môi trường Nutrient Broth chứa 0.001% lysozyme, thực hiện tương tự với môi trường không chứa lysozyme -> ủ ở 35oC/24h -> kiểm tra sự tăng trưởng trong môi trường chứa và không chứa lysozyme -> những ống có kết quả âm tính ủ thêm 24h -> kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay không. Dựa vào bảng để khẳng định dòng đã chọn là B.cereus hay không Các thử nghiệm phân biệt các loài trong Bacillus nhóm I: Thử nghiệm tính di động: Phương pháp 1: Dùng que cấy vòng cấy thẳng dịch 24h nuôi vào giữa môi trường kiểm tra di động -> ủ 30oC/ 18-24h -> kiểm tra dưới ánh đèn kiểu mọc, dọc theo đừơng cấy. Kế quả: loài di động mọc khuýêch tán vào môi trường theo hướng xa đường cấy, loài không di động mọc trong và dọc theo đường cấy. •
•
Phương pháp 2: bổ sung 0.2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạch nghiêng Nutrient Agar -> cấy huyền phù vi khuẩn vào -> ủ thạch nghiêng ở 30oC/6-8h -> nhỏ nước vô trùng lên kính hiển vi, đặt sinh khối vi khuẩn vào -> quan sát dưới kính hiển vi để kiểm tra sự di động.
Hầu hết các chủng B,cereus, B.thuringiensis là di động; B.anthracis và B.mycoides không di động. Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ lên giữa đĩa Nutrient agar -> ủ ở 30oC/48-72h -> kiểm tra sự phát triển của rễ giả (B.cereus không tạo cấu trúc rễ giả, thường tạo nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides (cấu trúc giống như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy).
Bacillus cereus (không có cấu trúc rễ giả)
Bacillus Mycoides (có cấu trúc rễ giả)
Thử nghiệm làm tan máu: cấy chủng lên môi trường thạch máu Trypticase Soy -> ủ ở 35oC/24h -> B.cereus làm tan máu mạnh, tạo vùng tan máu hòan tòan (β) 2-4 mm xung quanh vùng phát triển. B.thuringiensis và B.mycoides cũng tan máu β. B.anthracis thường không làm tan máu sau 24h.
Sự tạo độc tố protein dạng tinh thế: cấy huyền phù tế bào 24h lên ống thạch nghiêng nutrient agar -> ủ 30oC/ 24h -> để yên ở nhiệt độ phòng /2-3ngày -> nhuộm bằng phẩm màu fuchsin -> quan sát dưới kính hiển vi. Tinh thể độc tố của B.thuringiensis xuất hiện sau 3 đến 4 ngày nuôi cấy, phát hiện được bằng kỹ thuật nhuộm khi bào tử nang vỡ ra (tinh thể độc tố hình tứ giác dạng kim cương được nhuộm màu tối, nhỏ hơn bào tử). Do đó nếu không quan sát được bào tử tự do cần để thêm vài ngày rồi kiểm tra lại. B.cereus và các Bacillus khác cùng nhóm không tinh thể độc. Cách tính kết quả: Số tế bào B.cereus/1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha lõang và hiệu chỉnh bằng tỉ lệ khẳng định (phần trăm khuẩn lạc được xác nhận là B.cereus). Ví dụ: số khuẩn lạc đếm được ở độ pha lõang 10-4 là 65, có 4 trong 5 khuẩn lạc được chọn xác nhận là B.cereus (được kiểm tra bằng các phản ứng sinh hóa). Số tế bào B.cereus/1g thực phẩm = 65 x 4/5 x 10000 x 10 = 5200000 (nhân 10 vì có 0.1 ml mẫu được trải dĩa) 3.2.Các phương pháp phân tích nhanh: Theo nguyên lí của các phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chia phương pháp này thành hai nhóm nhỏ: nhóm dựa trên nguyên tắc của sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể (phương pháp miễn dịch) và nhóm dựa trên sự bắt cặp bổ sung các nucleotit 3.2.1 .Phương pháp miễn dịch: •
•
Nhóm các phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên bề mặt của tế bào vi sinh vật. Dựa trên nguyên tắc này có rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thành phương pháp phát hiện nhanh vi sinh vật. 3.2.2Phương pháp Elisa 3.2.2.1. Giôùi Thieäu Chung Veà Elisa Elisa (Enzyme linked Immunosorbent Assay) ñöôïc taïm dòch laø phöông phaùp phaân tích haáp thuï mieãn dòch lieân keát vôùi enzyme, laø phöông phaùp phaân tích trong ñoù söû duïng khaùng theå ñaëc hieäu ñeå nhaän dieän khaùng nguyeân (thöôøng laø Protein). Phöông phaùp Elisa ñöôïc phaùt trieån töø kó thuaät RIA (Radio Immuno Assay) vaøo nhöõng naêm 1960, bôûi Rosalyn Sussman Yalow vaø
3.2.2Phương pháp Elisa 3.2.2.1. Giôùi Thieäu Chung Veà Elisa Elisa (Enzyme linked Immunosorbent Assay) ñöôïc taïm dòch laø phöông phaùp phaân tích haáp thuï mieãn dòch lieân keát vôùi enzyme, laø phöông phaùp phaân tích trong ñoù söû duïng khaùng theå ñaëc hieäu ñeå nhaän dieän khaùng nguyeân (thöôøng laø Protein). Phöông phaùp Elisa ñöôïc phaùt trieån töø kó thuaät RIA (Radio Immuno Assay) vaøo nhöõng naêm 1960, bôûi Rosalyn Sussman Yalow vaø Solomon Berson. Kó thuaät naøy nhaän bieát khaùng nguyeân döïa treân söï ñaùnh daáu phoùng xaï khaùng theå. Phöông phaùp phaân tích Elisa ñöôïc öùng duïng nhieàu trong lónh vöïc y hoïc, döôïc hoïc hay thöïc phaåm döïa treân lieân keát khaùng theå vaø khaùng nguyeân nhö: chuaån ñoaùn beänh ung thö, HIV, caùc beänh do vi sinh vaät khaùc hay trong xeùt nghieäm nhanh söï nhieãm vi sinh vaät trong thöïc phaåm. Öu ñieåm noåi baät cuûa phöông phaùp naøy laø ñoä nhaïy cao, phaùt hieän ñöôïc lieân keát khaùng theå-khaùng nguyeân ôû möùc ñoä nhaát nhoû, thôøi gian cho keát quaû nhanh hôn caùc phöông phaùp xeùt nghieäm hoùa sinh, vi sinh truyeàn thoáng. ÔÛ ñaây, khaùi nieäm khaùng theå hay khaùng nguyeân laø coù tính töông ñoái vì trong nhieàu tröôøng hôïp khaùng theå naøy coù theå laïi laø khaùng nguyeân ñoái vôùi khaùng theå khaùc. Caùc enzyme söû duïng trong ñaùnh daáu thöôøng laø: peroxida s e, beta-galactoxidase, alkaline phosphatase
Hình 3.1 : Caùc gieáng vaø pipettes trong phaân tích Elisa 3.2.2.2. Caùc phöông phaùp phaân tích Elisa Phöông phaùp Elisa tröïc tieáp ( Direct Elisa ) Trong tröôøng hôïp naøy, khaùng nguyeân naèm troän laãn trong dung dòch ñeäm seõ ñöôïc cho vaøo ñaùy gieáng. Khaùng nguyeân seõ lieân keát coá ñònh vaøo beà maët cuûa ñaùy gieáng. UÛ moät thôøi gian ngaén, sau ñoù tieán haønh röûa troâi. Nhöõng khaùng nguyeân naøo khoâng lieân keát seõ ñöôïc ñöa ra ngoaøi. Theâm dung dòch chöùa khaùng theå coù gaén enzyme vaøo gieáng, khaùng theå seõ lieân keát vôùi khaùng nguyeân taïo phöùc hôïp gaén chaët vaøo gieáng. UÛ moät thôøi gian ñeå phöùc hôïp oån ñònh, sau ñoù tieán haønh röûa troâi. Nhöõng khaùng theå naøo khoâng lieân keát vôùi khaùng nguyeân seõ ñöôïc röûa troâi. Theâm dung dòch cô chaát coù heä ñeäm vaøo gieáng. Neáu coù söï toàn taïi cuûa phöùc hôïp khaùng theå_E_khaùng nguyeân thì cô chaát döôùi taùc dung cuûa E seõ taïo maøu cho dung dòch. Döïa vaøo söï xuaát hieän maøu vaø cöôøng ñoä maøu trong dung dòch seõ ñònh tính vaø ñònh löôïng ñöôïc khaùng nguyeân.
Phương pháp Elisa gián tiếp (indirect Elisa) Khaùng nguyeân seõ ñöôïc cho vaøo ñaùy gieáng. Khaùng nguyeân seõ lieân keát coá ñònh vaøo beà maët cuûa ñaùy gieáng. UÛ moät thôøi gian ngaén, sau ñoù tieán haønh röûa troâi. Nhöõng khaùng nguyeân naøo khoâng lieân keát seõ ñöôïc ñöa ra ngoaøi.
Ñöa khaùng theå muïc tieâu ñaëc hieäu vaøo gieáng, uû moät thôøi gian vaø tieán haønh röûa troâi, chæ nhöõng khaùng theå ñaëc hieäu môùi ñöôïc giöõ laïi cuøng khaùng nguyeân treân beà maët ñaùy gieáng. Ñöa tieáp dung dòch ñeäm chöùa khaùng theå thöù caáp coù gaén emzyme vaøo, khaùng theå naøy seõ lieân keát vôùi khaùng theå muïc tieâu. Taïo phöùc hôïp khaùng nguyeân_khaùng theå muïc tieâu_khaùng theå thöù caáp_E. Cuõng tieán haønh uû vaø röûa troâi. Khi cho dung dòch chöùa cô chaát vaøo gieáng, cô chaát döôùi xuùc taùc cuûa E seõ coù phaûn öùng taïo maøu. Phöông phaùp naøy chæ khaùc vôùi daïng tröïc tieáp laø phaûi söû duïng khaùng theå thöù caáp ñeå gaén E do khaùng theå muïc tieâu khoâng theå gaén vôùi E.
Hình 3.3 : Sô ñoà nguyeân taéc Elisa giaùn tieáp Phöông phaùp Elisa Sandwich: Tröïc tieáp
Mẫu cần phân tích được cho vào trong đĩa giếng đã được phủ kháng thể chuyên biệt. Kháng nguyên trong mẫu sẽ kết hợp với kháng thể trên đĩa giếng và trở nên bất động. Đĩa giếng này tiếp tục được rửa để loại bỏ những kháng nguyên không kết hợp được với kháng thể. Sau đó, phức hợp kháng thể - enzym (gồm kháng thể liên kết với enzym qua liên kết cộng hóa trị) được thêm vào. Kháng thể của phức hợp này sẽ kết hợp với kháng nguyên bất động trên đĩa giếng còn lại sau khi rửa để hình thành 1 bánh sandwich gồm: kháng thể – kháng nguyên – kháng thể/enzyme trên đĩa giếng. Sau khi loại bỏ kháng nguyên hoặc kháng thể, các cộng hợp tự do, cơ chất và chất phát màu tương ứng với enzyme sẽ được cho vào và màu sẽ xuất hiện trong các giếng thử. Việc định lượng hàm lượng kháng thể hoặc kháng nguyên được thực hiện bằng cách đo mật độ quang giữa mẫu và chất chuẩn nhờ máy máy đọcELISA.
Gián tiếp
Xác định Bacillus Cereus bằng phương pháp Elisa Hai loaïi ñoäc toá gaây ra truùng ñoäc thöïc phaåm do Bacillus cereus sinh ra laø Emetic oxin (ñoäc toá gaây noân) vaø Diarrhoeal Enterotoxin (ñoäc toá gaây tieâu chaûy). Phöông phaùp xaùc ñònh Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin (BDE) baèng kó
thuaät phaân tích Elisa ñöôïc Terca International Pty ñöa ra qua boä Kit Tecra® Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immuno Assay, hieän nay ñang aùp dung taïi nhieàu Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immuno Assay, hieän nay ñang aùp dung taïi
Hình 3.7 : Kit Tecra® Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual ImmunoAssay. Caùc thaønh phaàn chính cuûa Kit Wash Concen • Positive Cont • Conjugate • Substrate
Hình 3.8 : Các thành phần của Kit
Caùc thieát bò vaø duïng cuï keøm theo: Maùy li taâm • Boä ño pH • Pipettes • Boä gieáng nhöïa(wells) • Baûng so maøu (colour card) • Maùy so maøu (Plate reader) Chuaån bò maãu vaø duïng cuï: Laáy 10g moãi maãu thöïc phaåm nghi chöùavi khuaån B.cereus, theâm vaøo 20ml dung ñeäm Tris 0.25 mol1-1 . Xay nghieàn maãu. Ly taâm maãu trong 10phuùt baèng maùy ly taâm toác ñoäc cao. Loïc boû baõ sau li taâm, theâm vaøo dòch maãu moâi tröôøng ñeäm vaø chænh pH cho tôùi 8
Hình 3.9 Dụng cụ đo pH Hình 3.10 Máy ly tâm Laáy duïng cuï töø boä Kit vaø ñeå ôû nhieät ñoä phoøng trong moâi tröôøng voâ truøng 30 phuùt. Pha loaõng dung dòch röûa, hoaøn nguyeân positive control, conjugate, substrate Chuaån bò maãu thöû aâm (maãu thöïc phaåm bieát chaéc chaén khoâng coù bacillus cereus), caùch laøm töông töï nhö caùc maãu döông ôû treân.
Trong tröôøng hôïp khoâng coù maãu thöû aâm coù theå laáy maãu aâm do nhaø saûn xuaát cung caáp. Chuaån bò caùc gieáng (wells), ngaám gieáng baèng dung dòch röûa trong 10 phuùt, thaùo dung dòch röûa vaø ñeå raùo.
Hình 3.11 Giống Các bước tiến hành : Bước 1: Cho 200 µl moãi maãu thöû vaø chaát chuaån (positive control) vaøo moãi gieáng, nuùt chaët caùc gieáng vaø uû trong 2h ôû nhieät ñoä 35-37oC. Sau ñoù thaùo boû dòch maãu vaø röûa gieáng 4 laàn baèng dung dòch röûa (wash solution)
Böôùc 2: Theâm vaøo moãi gieáng sau khi röûa 200 µl conjugate (chaát tieáp hôïp), nuùt chaët gieáng vaø uû trong 1h ôû 20 – 25oC. Thaùo boû conjugate vaø röûa laïi 5 laàn baèng dung dòch röûa.
Böôùc 3: Theâm vaøo gieáng 200 µl substrate (chaát neàn), ñeå trong 30 phuùt ôû nhieät ñoä 20 – 25oC Theâm tieáp 20 µl stop solution neáu coù theå
Böôùc 4: So maøu vaø ñoïc keát quaû theo catalogue: coù theå ñoïc baûng do maøu hau baèng maùy
Kết quả và thảo luận: Cuõng vôùi boä Kit Tecra, A.Tan thuoäc vieän coâng ngheä öùng duïng vi sinh ñaõ xeùt nghieäm treân caùc maãu thöïc phaåm vaø beänh phaåm coù ñoäc toá BDE cuûa loaøi Bacillus cereus.
Öu ñieåm cuûa Kit Tecra® Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immuno Assay laø phaùt hieän ñoäc toá BDE nhanh chæ sau 4 giôø vôùi ñoä nhaïy cao <1ng/ml sample. Kit deã söû duïng, goïn nheï vaø cô ñoäng. Chính vì nhöõng yeáu toá
naøy maø hieän naycaùc boä dung cuï xeùt nghieäm nhanh ñang ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong caùc phoøng thí nghieäm treân theá giôùi. 3.2.3Kĩ thuật latex agglutination (LA) Sử dụng các hạt cao su có mầu có đính kháng thể đặc hiệu để định tính nhanh các chủng vi khuẩn đã được phân lập. Khi có mặt kháng nguyên tương ứng, quá trình kết tụ (agglutination) sẽ diễn ra và có thể quan sát trực tiếp bắng mắt thường (tạo ra hạt hoặc dải có màu). Kĩ thuật này có thể sử dụng để xác định nhanh vi sinh vật nhiễm tạp trong môi trường thuần sau khi phân lập từ thực phẩm. 3.2.4 Kĩ thuật lai phân tử( DNA- hybridization): Kỹ thuật này có thể sử dụng đầu dò với đoạn rARN đích do vậy có tính chính xác và độ nhạy cao. Đây là kĩ thuật cho phép phát hiện sự có mặt của nhiều loài vi sinh vật một lúc với thời gian nhanh. Tuy nhiên kỹ thuật cũng phức tạp và phải tốn công thiết kế các mẫu dò và sử dụng vật liệu phóng xạ. 3.2.5Kỹ thuật PCR: Kó thuaät PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis (Nobel 1993) phaùt minh, laø moät kyõ thuaät hieän phoå bieán trong sinh hoïc phaân töû, döïa treân phaûn öùng khuyeách ñaïi gene. Trong ñoù moât ñoaïn DNA ñöôïc nhaân leân raát nhieàu laàn moät caùch nhaân taïo bôûi enzyme DNA Polymerase maø khoâng caàn söû duïng vi sinh vaät soáng. Trong töï nhieân, enzyme DNA Polymerase coù trong noäi baøo sinh vaät chuyeân thöïc hieän chöùc naêng xuùc taùc cho caùc phaân öùng nhaân ñoâi sôïi DNA theo nguyeân taéc boå sung. Phaûn öùng naøy xaûy ra trong giai ñoaïn phaân chia teá baøo. Tuy nhieân quaù trình naøy cuõng coù khaû naêng thöïc hieän ôû trong ñieàu kieän oáng nghieäm (Invitro). ÔÛ ñoù, sôïi DNA cuõng ñöôïc taùch ñoâi thaønh hai sôïi ñôn bôûi nhieät ñoä cao (95oC). Vôùi xuùc taùc Enzyme DNA Polymerase, moãi sôïi DNA ñôn ñöôïc boå sung theâm taïo sôïi keùp. Tuy nhieân vôí nhieät ñoä cao nhö theá naøy thì E raát deã bò phaân huûy vaø maát ñi hoaït tính. Hieän nay, ngöôøi ta ñaõ tìm ra ñöôïc nhöõng loaïi E chòu nhieät ñoä
raát cao, ñöôïc taùch töø loaøi vi khuaån chòu nhieät (Thermophilic) nhö vi khuaån Thermus aquaticus, nhöõng E naøy goïi laø Tag, Flu. Nhieät ñoä 110oC Tag vaø Flu vaãn khoâng bò bieán tính. Veà cô baûn, ñeå thöïc hieän ñöôïc kó thuaät PCR caàn moät soá caùc phaàn sau : • Ñoaïn DNA maãu (Template) chöùa ñoaïn DNA caàn khueách ñaïi • Ñoaïn moài (Primer) xaùc ñònh ñieåm baét ñaàu vaø ñieåm keát thuùc • Enzyme DNA Polymerase nhaân ñoâi ñoaïn DNA • Nucleotide laø nguyeân lieäu cho phaûn öùng nhaân ñoâi DNA • Dung dòch ñeäm Ngoaøi ra, do PCR thöïc hieän trong chu trình nhieät (khoaûng 20-30 laàn) neân caàn coù maùy ñun noùng vaø laøm nguoäi moâi tröôøng phaûn öùng trong caùc oáng nghieäm. Thieát bò ñieän di caàn thieát ñeå xaùc ñònh kích thöôùc DNA ( thöïc teá laø troïng löôïng ñoaïn DNA ñaõ ñöôïc khueách ñaïi) • •
Hình 2.1: Máy PCR Nguyeân lyù cuûa söï khuyeách ñaïi PCR coù theå toùm taét nhö sau :Moät chu trình phaûn öùng goàm 3 böôùc, trong maùy PCR toång soá chu trình laëp laïi laø 30 laàn vôùi thôøi gian raát nhanh. • Böôùc 1 : Duoãi xoaén DNA ôû nhieät ñoä 94oC trong thôøi gian 1 phuùt. Chuoãi DNA keùp ñöôïc thaùo xoaén taïo 2 sôïi ñôn. • Böôùc 2 : Gaén moài ôû 54oC trong khoaûng 45 giaây. Primer seõ baét dính treân ñoaïn DNA ñôn caàn nhaân ñoâi moät caùch ñaëc hieäu Böôùc 3 : Keùo daøi ôû 72oC trong 2 phuùt. Enzyme seõ xuùc taùc phaûn öùng keùo daøi maïch DNA boå sung cho tôùi khi gaëp ñieåm keát thuùc.
Hình 2.2 : Sô ñoà sao cheùp DNA
Hình 2.3 : Caùc böôùc cuûa phaûn öùng PCR Hoãn hôïp sau khi chaïy PCR seõ ñöôïc nhuoäm maøu vaø phaân tích baèng ñieän di treân baûn gel Agarose. Löôïng DNA sau khi khuyeách ñaïi seõ coù cuøng trong löïông phaân töû vaø taäp trung ôû cuøng moät vi trí treân baûn gel. Keát quaû ñieän di seõ ñem so saùnh vôùi thang DNA chuaån ñeå bieát trong löôïng phaân töû cuûa ñoaïn DNA khueách ñaïi, cuõng chính laø maûnh DNA luùcbanđầu
Hình 2.4 : Keát quaû ñieän di saûn phaåm chaïy PCR Xaùc ñònh B.cereus baèng PCR Nhö ñaõ trình baøy ôû phaàn môû ñaàu, Bacillus cereus laø loaøi vi khuaån gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm vôùi hai trieäu chöùng : Noân möûa (Emetic) vaø tieâu chaûy (Diarrheic). Trong ñoù ñoäc toá gaây moân möûa (Emetic toxin) laø loaïi beàn nhieät do moät loaïi gene coù teân Cereulide Synthetic (CRS) cuûa vi khuaån toång hôïp. Nagoya City Public Health Research Institute, Nagoya University keát hôïp cuøng haõng Takara ñaõ ñöa ra boä Kit xeùt nghieäm nhanh Bacilus cereus cuøng vôùi quy trình xeùt nghieäm döïa treân kó thuaät PCR. Boä Kit naøy xeùt nghieäm hai loaïi gene toång hôïp : • CRS cuûa Bacillus cereus • LE ( Lecithinase enzyme gene) cuûa bacillus cereus vaø caùc loaøi cuøng chi nhö bacillus atharcis, bacillus thuringiensis
Hình 2.5 : Bộ Kit PCR Thaønh Phaàn Chính Cuûa Kit: (25 µl X 50 Reactions) • 5 x PCR Premix * 500 µl ( Goàm hoãn hôïp dNTP, IC, enzyme TaKaRa Ex TaqTM HS) • Hoãn hôïp CRS Primer 50 µl (Ñeå phaùt hieän cereulide synthetic enzyme gene) • Hoãn hôïp LE Primer 50 µl (Ñeå phaùt hieän lecithinase gene) • Hoãn hôïp I.C Primer 50 µl (Ñeå phaùt hieän internal control) • Khuoân maãu döông CRS 10 l • Khuoân maãu döông LE 10 l Baûo Quaûn Boä Kit : -20oC Caùc Loaïi Hoùa Chaát Vaø Duïng Cuï Khaùc: • Nöôùc chöng caát vaø ñöôïc tieät truøng • NuSieve 3:1 agarose ( Lonza biosciences) • Heä ñeäm ñieän di (TBE powder (Cat.#T905) • Thang chuaån DNA pHY marker (Cat.#3404A/B) Ф X174 Hin C II digest (Cat.#3406A/B) 100 Bp DNA (Cat.#3407 A/B) • Heä ñeäm chæ thò (6x : 30% glycerol, 0.03% bromophelnol blue, 0.03% xylene cyanol, 30mM EDTA, do haõng TaKaRa cung caáp)
Hoùa chaát nhuoäm maøu DNA (Ethidium bromide, hoaëc SYBR green, hoaëc Gelstar Nucleic acid stain (Haõng Lonza Biosciences)) • Maùy gia nhieät ( tôùi 95oC) • Maùy li taâm töông thích vôùi caùc oáng nghieäm 1.5ml • TaKaRa PCR Thermal Cycler DiceTM (Cat.#TP600,650) • Duïng cuï ñieän di • Nguoàn ñieän • Ñeøn cöïc tím • Polaroid Camera chuïp aûnh ñieän di •Ống nghieäm 1.5 ml (TaKaRa (Cat.#9047)) • Micropipettes loaïi 20 µl vaø 200 µl • Nuùt ñaäy Micropipettes • Maøng Polaroid • Khay nhuoäm maøu Agarose Gel Caùch Thöùc Tieán Haønh Chuaån bò maãu: • Maãu vi sinh vaät ñaõ phaân laäp • Laáy moät löôïng vi khuaån töø khuaån laïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng NGKG (Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd) baèng micropipette. Theâm vaøo maãu 100 µl nöôùc tieät truøng. • Gia nhieät maãu leân 95oC trong 5 phuùt. • Laáy 1 µl maãu sau gia nhieät ñeå chaïy PCR. Maãu töø thöïc phaåm • Laáy 1 löôïng nhoû maãu thöïc phaåm, cho maãu vaøo moâi tröôøng SCD (Tryptosoya bouillon, Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd) coù chöùa theâm Polymixin. Theå tích moâi tröôøng gaáp 10 laàn theå tích maãu. Xay maãu nhuyeãn. •
Ñeå maãu ôû nhieät ñoä 35oC trong 5-6h hoaëc qua ñeâm • Ly taâm 1.3ml maãu trong 1 phuùt (1000voøng/phuùt). Laáy 1ml phaàn phía treân dòch maãu sau li taâm cho vaøo trong oáng nghieäm saïch vaø ly taâm ôû vaän toác 12,000 voøng/phuùt trong 3 phuùt. • Boû phaàn baõ noåi phía treân, theâm vaøo oáng nghieäm 100 µl heä ñeäm TE. • Gia nhieät tôùi 95oC trong 5 phuùt. • Laáy 1ml dòch sau gia nhieät chuaån bò chaïy PCR Phaûn öùng PCR Cho vaøo oáng nghieäm PCR saïch caùc hoãn hôïp sau: • 5x PCR premix 10 µl • CRS primer mixture 10 µl • LE primer mixture 10 µl • I.C primer mixture 10 µl • dH2O 36 µl Total = 49 µl - Theâm vaøo 1 µl dòch maãu sau gia nhieät taïo maãu döông Ngoaøi ra coøn chuaån bò maãu aâm cho phaûn öùng baèng caùch cuõng laáy 49 µl hoãn hôïp treân, nhöng theâm vaøo 1 µl nöôùc saïch tieät truøng. Ñaäy caùc oáng vaø laép ñaët vaøo Thermal cycler. Chaïy PCR vôùi caùc thoâng soá sau : • 94oC trong 30s • 55oC trong 30s, laëp laïi 40 laàn •
72oC trong 30s Phaûn öùng PCR keát thuùc trong khoaûng 2h. Baûo quaûn maãu sau khi chaïy PCR ôû -20oC Chuaån bò baûn gel agarose • Cho vaøo bình tam giaùc saïch heä ñeäm ñieän di vaø theâm vaøo töø töø NuSieve 3:1 agarose ( Lonza biosciences) khi ñaït noàng ñoä 3% theå tích Gia nhieät trong 2-3 phuùt baèng loø vi soùng. Sau ñoù khuaáy ñeàu cho tôùi khi hoãn hôïp ñoàng nhaát. Tieáp tuïc gia nhieät theâm laàn nöõa. • Thieát laäp baûn gel • Khi dòch Agarose gel nguoäi xuoáng 50-60oC, tieán haønh theâm hoùa chaát nhuoäm maøu Ethidium bromide 0.5 µg/ml, khuaáy ñeàu hoãn hôïp gel • Ñoå gel leân baûn gel vaø taïo raõnh treân baûn gel. • Ñeå baûn gel ôû nhieät ñoä phoøng trong 30 phuùt ñeå gel cöùng laïi. • Sau khi gel ñaõ ñaït ñoä cöùng, ñöa baûn gel vaøo thieát bò ñieän di Chaïy ñieän di • Keát noái caùc daây ñieän theo ñuùng cöïc • Theâm 2 µl heä ñeäm chæ thò vaøo moãi oáng saûn phaåm chaïy PCR vaø laéc ñeàu hoãn hôïp. •
Roùt töø töø hoãn hôïp vaøo caùc raõnh treân baûn gel baèng micropipette. Löu yù hai raõnh beân phaûi vaø traùi baûn gel ñöôïc roùt DNA maker (Thang DNA chuaån 100 bp). Keát quaû vaø thaûo luaän Keát quaû sau khi ñieän di theå hieän söï coù maët cuûa caùc ñoaïn gene nhö sau:
Cereulide synthetic enzyme (CRS) gene: 426 bp
Lecithinase (LE) gene: 227bp
Internal Control (I.C.): 106 bp
Hình 2.6 : Keát quaû ñieän di •
Hình aûnh ñieän di A coù nghóa laø coù Bacillus cereus hoaëc caùc loaøi bacillus khaùc trong maãu thöû coù soá löôïng ít hôn giôùi haïn döôùi cuûa pheùp thöû, hoaëc cuõng coù theå do nhieãm loaøi vi sinh vaät khaùc loaøi bacillus. • Hình aûnh B coù nghóa laø trong maãu coù chöùa Bacillus cereus gaây ñoäc toá Cereulide (CRS) • Hình aûnh C chöùng toû maãu thöû chöùa Bacillus cereus khoâng gaây ñoäc toá Cereulide (CRS), hoaëc chöùa caùc loaøi cuøng chi bacillus khaùc (Bacillus thuringensis, bacillus antharcis). Maãu phaûn öùng aâm Nagative control reaction ( maãu phaân tích laø nöôùc tieät truøng) seõ cho keát quaû ñieän di treân hình A Neáu maãu phaûn öùng aâm cho keát quaû ñieän di nhö hình B,C thì ñaõ xaûy ra quaù trình nhieãm khuaån laï khaùc trong suoát quaù trình thöïc hieän pheùp phaân tích. Luùc naøy caàn phaûi raø soaùt laïi quaù trình ñeå ñaûm baûo söï voâ truøng trong phaân tích vaø tieán haønh thöû laïi. Neáu maãu aâm khoâng cho keát quaû ñieän di thì phaûn öùng PCR chaïy khoâng ñuùng kó thuaät, hoaëc cuõng coù theå coù caùc yeáu toá khaùc aûnh höôûng ñeán nhö : hoùa chaát laï, boä kit bò hö hoûng…
3.2.7Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR: Nguyên tắc : Kỹ thuật Real Time PCR hay còn gọi là PCR động về cơ bản dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR. Tuy nhiên nó cho phép hiển thị và theo dõi trực tiếp qúa trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu trình nhiệt qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang. Dựa vào độ phát huỳnh quang ta có thể định lượng các đoạn DNA hình thành Do mồi có tính phát quang cho nên có thể đánh dấu chúng với các chất nhuộm khác nhau, nhờ thế để có thể nhân các đoạn khác nhau trong cùng một phản ứng PCR. Tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là phải tổng hợp các mẫu dò khác nhau cho các trình tự nhận biết khác nhau.[10] Các phương pháp định lượng bằng Real time PCR • Phương pháp sử dụng chất nhuộm mầu SYBR Green: Chất nhuộm mầu này được gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi được gắn với sợi DNA kép thì cường độ phát huỳnh quang tăng lên, khi bản sao tạo ra càng nhiều thì tín hiệu phát ra của chất mầu sẽ tăng lên theo tỉ lệ thuận. Ưu điểm của phương pháp này là SYBR sẽ đính vào bất cứ chuỗi DNA kép nào có mặt. • Phương pháp đầu dò thuỷ phân TaqMan: Kỹ thuật này sử dụng các đầu dò có thể phát huỳnh quang, các mẫu dò là một oligonucleotit trong đó một đầu được gắn với chất nhuộm mầu có phát huỳnh quang, đầu kia được gắn với chất nhuộm có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang. Khi có mặt đoạn DNA cần nhân, mẫu dò sẽ gắn vào DNA khuôn ở vùng dưới của mồi theo hướng 5’. Ở trạng thái này không có hiện tượng phát huỳnh quang. Khi bắt đầu tiến hành quy trình PCR với sự hoạt động của enzyme taq-polymerase mồi được kéo dài cho tới khi gặp mẫu dò thì mẫu dò sẽ bị phân giải bởi hoạt tính 5’ nuclease của taq-DNA polymerase.Sự phân giải mẫu dò sẽ làm giải phóng chất nhuộm mầu có khả năng phát huỳnh quang khỏi ảnh hưởng kìm hãm của chất nhuộm có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang. Sự phát huỳnh quang này có thể nhận biết được. •
Phương pháp đầu dò lai Trong kỹ thuật này một đầu dò được gắn với một chất cho huỳnh quang ở đầu 3’ và một đầu dò thứ hai gắn với một chất nhuộm huỳnh quang. Khi hai đầu dò này tiến lại gần nhau, cách nhau khoảng 1-5 nucleotide, chất phát quang phát ra từ chất cho huỳnh quang sẽ kích thích chất nhận huỳnh quang và kết quả là phát ra tín hiệu huỳnh quang.
Hình 3 Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time PCR Ưu điểm : • Kỹ thuật này khắc phục được những nhược điểm của PCR như sau: • -Không cần chạy điện di kiểm tra kết quả PCR • -Có thể định lượng chính xác sản phẩm PCR, trong khi sử dụng PCR thông thường việc phân biệt dựa trên độ lớn của vạch thu được sau điện di
• -Độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn, thời gian tiến hành phản ứng ngắn • -Có thể tiến hành với nhiều đoạn DNA cùng lúc trong cùng một ống nghiệm nên giảm khả năng nhiễm mẫu 4.Kết luận chung: Bào tử và các tế bào sinh trưởng của B. cereus xuất hiện một cách rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt là trong đất (trong đất có thể chứa 105 – 106 bào tử/g), nó có thể được tìm thấy trong các nguồn thực phẩm dạng tươi hay đã qua chế biến ngoại trừ các thực phẩm đã được thanh trùng bằng nhiệt hay chiếu xạ. Phần lớn các giống vi khuẩn B. cereus có thể phát triển trong các thực phẩm có độ chua thấp ở nhiệt độ dưới 150C và trên 550C (nhiệt độ tối thích là 30 – 350C), phát triển được trog khoảng pH 5.0 và 8.8 Độc tố emetic (gây nôn mửa) của B. cereus rất bền nhiệt, có thể tồn tại ở 1260C trong 90 phút. Ngược lại, độc tố diarrheal (gây tiêu chảy) rất nhạy cảm với nhiệt độ và bị vô hoạt khi nấu chín ở nhiệt độ 560C trong 5 phút. Chủng loại, cấu trúc và thành phần cấu tạo độc tố đường ruột của B. cereus cần được nghiên cứu xa hơn. Cần các thao tác kiểm tra trên ống nghiệm đối với độc tố emetic và kiểm tra cụ thể hoạt động về mặt sinh học đối với độc tố diarrheal. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Tô Minh Châu(2005), Giáo trình vi sinh cơ sở 2. Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trương Thị Hoà, Lê Thị Lan Chi (2003), Vi sinh vật nhiễm tạp trong công nghệ thực phẩm, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 3. Nguyễn thị Kim Hoa (2004), Phát triển kỹ thuật PCR trong phân tích listeria monocytogenes gây bệnh thực phẩm, Luận văn thạc sỹ khoa học, Hà Nội. 4. Lâm Xuân Thanh (2004), Giáo trình công nghệ các sản phẩm sữa, NXB KHKT, Hà Nội. 5. Trần Linh Thước, Các phương pháp kiểm tra vi sinh vật trong nước và thực phẩm, NXB giáo dục và đào tạo. 6. Phùng Thị Thủy (2006) Góp phần kiểm soát sự nhiễm tạp vi sinh vật trong quá trình
sản xuất sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật PCR, Luận văn thạc sỹ khoa học Tiếng Anh 1. Applied Biosystems (AB). SYBR Green PCR and RT-PCR reagents. 2001 2. B.Janatova, J. Lukaaova(2001) heat resistaince of bacillus spp.Spore isolated from cow’s milk and farm ebvironment ” Acta Vet. .Brono,70 3. Candrian U,Furrer B, Hofelein C, Meyer R, jermini M, Luthy J.(1991), ”Detection of Escherichia coli and identification of enterrotoxigenic strains by primer-directed enzymatic amplification of specific DNA sequences” :39-51 4. Sanjoy Das, P.K. Surendran* & Nirmala Thampuran,2007, PCR-based detection of enterotoxigenic isolates of Bacillus cereus from tropical seafood. 5. DOUGLAS J. BEECHER AND AMY C. LEE WONG, 1994, dentification and Analysis of the Antigens Detected by Two Commercial Bacillus cereus Diarrheal EnterotoxinImmunoassay Kits. 6. M. A. ANDERSSON, R. MIKKOLA, J. HELIN, M. C. ANDERSSON, AND M. SALKINOJA-SALONEN, 1998, A Novel Sensitive Bioassay for Detection ofBacillus cereus Emetic Toxin and Related Depsipeptide Ionophores. 7. Marcela Vyletělová, Juraj Banykó, Detection of Enterotoxins in Bacillus cereus by Multiplex PCR Method, BCET-RPLA and ELISA Assay, Research Institute for Cattle Breeding, Ltd., Výzkumníků 267, 788 13 Vikýřovice, Czech Republic. 8. http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/VSATTP/qddanhmuc/gioihanonhiem. asp 9.http://aem.asm.org/cgi/content/full/68/10/4853 10.http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm 11.http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf 12.http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html 13. http://www.takara-bio.com 14.http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-14.html 15.http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-20a.html
