BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ----------
LƯU THỊ HƯƠNG
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO Bacillus subtillis natto BẰNG ALGINAT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LƯU THỊ HƯƠNG
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO Bacillus subtillis natto BẰNG ALGINAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn: Th.S. Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: Bộ Môn Công Nghiệp Dược
HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất tới cô giáo ThS. Kiều Thị Hồng – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – trường đại học Dược Hà Nội và DS. Lê Ngọc Khánh, những người đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học. Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược - Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy cô giáo trong trường và tất cả các bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Lưu Thị Hương
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN ....................................................................................2 1.1.
Cố định tế bào. ...................................................................................................2
1.1.1.
Khái niệm. ...................................................................................................2
1.1.2.
Phân loại. .....................................................................................................2
1.1.3.
Ưu nhược điểm của tế bào cố định. ............................................................4
1.1.4. Ứng dụng của cố định tế bào. .........................................................................5 1.2. Tổng quan về alginat. ............................................................................................6 1.2.1. Cấu trúc hóa học. ............................................................................................6 1.2.2. Cơ chế tạo gel . ...............................................................................................7 1.2.3. Tính chất của alginat. ......................................................................................8 1.2.4. Ứng dụng.........................................................................................................9 1.3. Bacillus subtillis natto. ........................................................................................10 1.3.1 Đặc điểm . ......................................................................................................10 1.3.2. Nguồn gốc. ....................................................................................................11 1.3.3. Phân loại khoa học ........................................................................................11 1.3.4. Cấp khí và nhiệt độ .......................................................................................11 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................13 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị. ...............................................................................13 2.1.1. Nguyên liệu – Hóa chất. ...............................................................................13 2.1.2. Máy móc – thiết bị - dụng cụ nghiên cứu.....................................................14 2.1.3. Môi trường nuôi cấy. ....................................................................................14 2.2. Nội dung nghiên cứu. ..........................................................................................15 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate tới cố định tế bào B. subtilis natto. ........................................................................................................................15 2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên số lượng tế bào cố định. ....15 2.2.1.2. Đánh giá khả năng cố định tế bào ở các nồng độ alginat bằng phương pháp đếm. ................................................................................................................15
2.2.1.3. Định tính Enzym ngoại bào có mặt trong dịch sau khi nuôi cấy (ở 37oC, 100 vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau. ..................................15 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí tới cố định tế bào B. subtilis natto. .................................................................................................................................15 2.3. Phương pháp nghiên cứu. ...............................................................................15 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy B. subtilis natto. ...................................................15 2.3.2. Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginat. ...................................16 2.3.3. Phương pháp phá hạt. ...................................................................................18 2.3.4. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính của các Enzym : Protease, cellulase, amylase. ...................................................................................................................18 2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục. ..................................................................19 2.3.6. Phương pháp cấy trộn trong thạch................................................................19 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................21 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình cố định tế bào B. subtilis natto. ...........................................................................................................................21 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên số lượng tế bào cố định. ......21 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình cố định tế bào bằng phương pháp đếm ....................................................................................................24 3.1.3. Định tính Enzym có mặt trong dịch sau khi nuôi cấy (ở 37oC, 100 vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau. .........................................30 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí tới quá trình cố định tế bào B. subtilis natto. ..............................................................................................................33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .....................................................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT B. subtilis natto :
Bacilus subtilis natto
VSV
Vi sinh vật
:
Độ lệch chuẩn
RSD
:
CMC
:
Carboxymethyl cellulose
Na CMC
:
Natri Carboxymethyl cellulose
DANH MỤC CÁC BẢNG Tên các bảng
Trang
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất
13
Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng
14
Bảng 3.1: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt 21 calci alginat 2% Bảng 3. 2: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt
22
calci alginat 4%. Bảng 3.3: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt gel calci alginat ở các nồng độ khác nhau.
23
Bảng 3.4: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt sau khi nuôi cấy (ở 37 , 100 vòng/ phút, 24h)
24
Bảng 3.5: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1gam hạt Alginat 4% sau khi nuôi cấy (ở 37 , 100 vòng/ phút, 24 giờ)
25
Bảng 3.6: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt gel ở các nồng độ alginat khác nhau sau khi nuôi cấy (ở 37oC, 100 vòng/phút, 24 giờ)
26
Bảng 3.7: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch ( dịch sau khi nuôi cấy ở 37 , 100 vòng/ phút, 24h)
27
Bảng 3.8: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch hạt alginat 4% ( dịch sau khi nuôi cấy ở 37 , 100 vòng/ phút, 24h ).
28
Bảng 3.9: Số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy sau khi nuôi cấy ở 37oC, 100 vòng/phút, trong 24 giờ.
28
Bảng 3.10: Sơ bộ thử hoạt tính enzym trong dịch nuôi cấy hạt calci alginat 2%
31
Bảng 3.11: Sơ bộ thử hoạt tính enzym trong dịch nuôi cấy hạt calci alginat 4%
32
Bảng 3.12: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt lắc ở 100 vòng/ phút trong 24 giờ
34
Bảng 3.13: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong 1 gam hạt lắc ở 150 vòng/phút trong 24 giờ.
34
Bảng 3.14: Số lượng tế bào B. subtilis natto được giữ trong hạt alginat 2% lắc ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút.
35
Bảng 3.15: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc ở 100 vòng/phút trong 24 giờ.
36
Bảng 3.16: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ. Bảng 3.17: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút.
36
37
DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình Hình 1.1: Cấu hình của
– D – mannuronic acid và
Trang -L-
Guluronic acid.
6
Hình 1.2: Cấu trúc của phân tử alginat
7
Hình 1.3: Sự kết hợp ion Ca2+ với alginat
8
Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc của B. subtilis natto Hình 2.1: Phương pháp tạo hạt gel Calci alginat Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto phụ thuộc vào nồng độ alginat Hình 3.2 : Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt gel ở các nồng độ khác nhau
11 17 23
26
Hình 3.3 : Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch nuôi cấy (37oC, 100 vòng/phút, trong 24 giờ) ở
29
các nồng độ alginat khác nhau Hình 3.4: Sô lượng tế bào VSV B. subtilis natto trong dịch nuôi cấy hạt Alginat 2% ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút.
. .
39
1
ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, việc cố định tế bào sống trong gel alginat đã trở thành một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi. Cố định tế bào tuy là công nghệ mới và tiên tiến nhưng nó đã được sự quan tâm của các nhà khoa học và sản xuất bởi hiệu quả và tính kinh tế vượt trội của nó so với phương pháp truyền thống sử dụng tế bào tự do và cả kỹ thuật bất động enzym đã được nghiên cứu trước đó. Kỹ thuật cố định tế bào tiến hành đơn giản hơn, cho năng suất cao hơn và đặc biệt là có thể sản xuất liên tục trong các quy trình được tự động hóa. Vi khuẩn B. subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis là một trong các vi khuẩn có khả năng sinh protease và được ứng dụng nhiều [24]. Năm 1980, Giáo sư Sumi người Nhật phát hiện ra trong Natto có chứa nattokinase – một enzym thuộc nhóm protease có khả năng phân giải fibrin [16]. Từ đó tới nay nhiều nghiên cứu về B. subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzym nhóm protease như nattokinase [21], elastase [29], bacillopeptidase [27]... Các chế phẩm của enzym này được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Alginat là chất mang hay được sử dụng nhất trong quá trình cố định tế bào. Nhưng vấn đề đặt ra là ở nồng độ bao nhiêu và điều kiện cấp khí bao nhiêu thì khả năng cố định tế bào của alginat là tốt nhất. Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu cố định tế bào Bacillus subtilis natto bằng alginat” được thực hiện với 2 mục tiêu : 1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên quá trình cố định tế bào B. subtilis natto. 2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên quá trình cố định tế bào B. subtilis natto.
2
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Cố định tế bào. 1.1.1. Khái niệm. Cố định tế bào là sự bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn lên “một vùng không gian nhất định“ nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn.[17] 1.1.2. Phân loại. Phương pháp này được chia thành 4 loại [18]: Cố định trên bề mặt chất mang rắn. Nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel). Keo tụ tế bào (tạo hạt). Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn. 1.1.2.1. Phương pháp cố định trên bề mặt chất mang rắn. Nguyên tắc: Cố định dựa vào tương tác bề mặt giữa tế bào và chất mang. Các lực liên kết là lực hấp phụ vật lý, liên kết tĩnh điện hay liên kết cộng hóa trị. Những lực liên kết này yếu nhưng đủ lớn về số lượng để có thể liên kết hợp lý [10], [18], [28]. Chất mang: là các vật liệu cellulose : gỗ, mùn cưa, DEAE – cellulose... hoặc các vật liệu vô cơ như : hydromica, sứ xốp, thủy tinh xốp... [18], [20]. Ưu điểm: - Ít hoặc không nguy hiểm tới tế bào [10]. - Đơn giản dễ thực hiện, nhanh thu được sự cố định [10], [28], [20]. - Không ảnh hưởng tới quá trình truyền khối [28], [20]. - Diện tích tiếp xúc giữa tế bào cố định và chất mang lớn hơn so với các kỹ thuật khác [20]. -
Có thể phục hồi trở lại tế bào tự do [10].
Nhược điểm:
3
- Hàm lượng của tế bào tự do trong dung dịch cao (tế bào tự do dễ bị tách ra do không có màng chắn giữa dung dịch và các tế bào) [18], [10]. - Nếu điều chỉnh không cẩn thận, sự quá tải trên bề mặt chất mang có thể làm giảm hoạt tính xúc tác [10]. - Sự thiếu không gian phù hợp giữa tế bào và chất mang có thể làm cản trở không gian [10]. 1.1.2.2. Phương pháp nhốt trong khung mạng xốp. Nguyên tắc: Đưa tế bào vào bên trong một mạng đủ chặt để ngăn cản tế bào khuếch tán vào môi trường xung quanh, trong khi vẫn cho phép sự vận chuyển của chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất diễn ra [18], [10]. Chất mang : Là các polyme tự nhiên như alginat, agar, chitosan... [18] hoặc là polymer khác như genlatin, collagen và polyvinyl alcohol hoặc polymer tổng hợp như polyacrylamide, polyurethane và polyvinyl chloride [20]. Ưu điểm: - Đạt được mật độ tế bào trong một đơn vị thể tích chất mang cao hơn so với canh trường vi sinh vật tự do [20]. - Chất mang có tác dụng bảo vệ chống lại thực khuẩn hoặc tế bào ngoại lai cũng như môi trường gây bất lợi [20]. Nhược điểm: - Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối thì độ bền của mạng gel sẽ giảm [18]. - Tế bào trên bề mặt gel phát triển, tăng lên và thoát khỏi bề mặt gel, phát triển trong môi trường như tế bào tự do [18]. 1.1.2.3. Phương pháp keo tụ tế bào (tạo hạt). Sự tập hợp các tế bào gia tăng kích thước của khối tế bào hoặc huyền phù tế bào gắn thành cụm và lắng xuống để dễ dàng sử dụng trong các bình phản ứng. Có thể là keo tụ tự nhiên hoặc keo tụ nhân tạo bằng cách tạo thành các liên kết ngang [18].
4
Ưu điểm: - Đơn giản, dễ thực hiện. - Không ảnh hưởng tới quá trình chuyển khối. Nhược điểm: Do không có màng chắn giữa tế bào và dung dịch nên tế bào dễ tách ra làm tăng hàm lượng của các tế bào tự do trong dung dịch. 1.1.2.4. Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn. Nguyên tắc : Phương pháp này thực hiện bằng hai cách sử dụng membrane vi xốp hoặc sử dụng màng vi bao [18], [19]. Ưu điểm: Canh trường lên men không bị nhiễm tế bào, do đó sản phẩm tạo thành có thể không cần lọc. Nhược điểm: - Khả năng truyền khối kém. - Màng Membrane có thể bị bám bẩn do sự hấp phụ cơ chất trên bề mặt màng. 1.1.3. Ưu nhược điểm của tế bào cố định. 1.1.3.1. Ưu điểm của tế bào cố định hơn tế bào tự do [18]. - Hoạt động tế bào và sự ổn định của chất xúc tác sinh học, chất mang có thể đóng vai trò như chất bảo vệ chống lại ảnh hưởng hóa lý của nhiệt độ, pH, dung môi và thậm chí là kim loại nặng. - Mật độ tế bào trên một đơn vị thể tích của thiết bị phản ứng cao hơn, thời gian phản ứng ngắn hơn. - Sự hấp thu cơ chất tăng và năng suất được cải thiên. - Có thể thục hiên được quá trình liên tục. - Khả năng chịu đựng của nồng độ cơ chất cao tăng và giảm sự ức chế của sản phẩm cuối.
5
- Với quá trình lên men có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp dẫn tới cái thiện chất lượng sản phẩm. - Hoàn thiện sản phẩm dễ dàng hơn do giảm được thủ tục tách chiết và lọc, do đó giảm giá thành cho thiết bị và năng lượng sử dung. - Có thể tái sinh và tái sử dụng chất xúc tác sinh học. - Giảm rủi ro nhiễm vi sinh vật có hại bởi vì mật độ tế bào cao. - Có thể sử dụng thiết bị phản ứng sinh học nhỏ hơn, với sự thiết kế công nghệ đơn giản do đó giảm chi phí vốn. - Giảm thời gian sản xuất ra sản phẩm. 1.1.3.2. Nhược điểm của cố định tế bào. - Có hiện tượng rò rỉ và rửa trôi tế bào nên việc thu nhận và tinh sạch sản phẩm khá phức tạp. - Tế bào cố định đòi hỏi nhiều nguồn dinh dưỡng và năng lượng đa dạng để sinh trưởng phát triển và hoạt động bình thường. Do đó có hiện tượng phân hủy sản phẩm để cung cấp dinh dưỡng. Vì vậy hiệu suất có thể thấp hơn. - Việc thẩm thấu cơ chất, sản phẩm và các cấu tử từ môi trường ra vào tế bào bị cản trở. - Hoạt lực của tế bào cố định thấp hơn tế bào tự do. 1.1.4. Ứng dụng của cố định tế bào. Với kỹ thuật cố định tế bào trên gel alginat, công nghệ sinh học đã công nghiệp hóa được một số công nghệ cao như sản xuất liên tục các loại rượu bằng việc cố định các tế bào nấm men, sản xuất acid hữu cơ, các chất kháng sinh và các hoocmon bằng việc cố định tế bào các vi khuẩn đồng thời nuôi cấy được mô tế bào của động thực vật, các kháng nguyên dòng vô tính đơn..... Các ứng dụng của kỹ thuật cố định tế bào phát triển mạnh mẽ và được công nghiệp hóa ở nhiều nước phát triển với các thành tựu rực rỡ. Tuy nhiên, ở nước ta ứng dụng của cố định tế bào còn chưa phát triển và phổ biến.
6
1.2. Tổng quan về alginat. Alginat có khá nhiều trong tự nhiên, và chủ yếu là từ tảo nâu biển. Ngoài ra còn có nguồn gốc từ các loại vi khuẩn đất. Tuy nhiên tất cả các alginat thương mại hiện nay đều có nguồn gốc từ tảo. Alginat tồn tại dưới hai dạng không tan là acid alginic và alginat calci hoặc magie rất bên vững ở trong tế bào cây rong.[1]. 1.2.1. Cấu trúc hóa học. Alginat có tên gọi chung họ các muối của acid alginic. Alginat là một polymer không phân nhánh bao gồm các monomer -D-mannuronic acid (M) và L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4–glucoside. Có ba loại liên kết có thể gặp trong một phân tử alginat: (M-M-M), (G-G-G), (M-M-G). Công thức cấu tạo của acid alginic là: (C6H6O6)n
Hình 1.1: Cấu hình của
– D – mannuronic acid và
-L-Guluronic acid
Các liên kết này phân bố trong mạch alginat theo các block : Block homopolyguluronic : gồm các gốc guluronic liên kết với nhau Block homopolymannuronic : gồm các gốc mannuronic liên kết với nhau. Block liên hợp : Gồm các gốc mannuronic và guluronic luân phiên nối với nhau.
7
Hình 1.2: Cấu trúc của phân tử alginat a) Các momomer của alginat. b) Chuỗi alginat. c) Sự phân bố các block. 1.2.2. Cơ chế tạo gel . Alginat có khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao hoặc khi phân tử alginat bị acid hóa. Ở phương pháp tạo gel khi kết hợp với cation kim loại hóa trị cao có thể tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngoài và từ bên trong. Chúng tôi nghiên cứu và sử dụng phương pháp tạo gel từ bên ngoài. Đây là phương pháp tạo gel phổ biến nhất vì nó có ưu điểm là tạo gel nhanh và đơn giản. Tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại không cao. Cơ chế tạo gel: Khi nhỏ dung dịch alginat vào dung dịch có chứa cation kim loại có hóa trị cao (thường là
), bề mặt ngoài của hạt alginat sẽ bị gel hóa, và các cation bên
ngoài môi trường sẽ tiếp tục khuếch tán vào bên trong làm phân tử alginat bên trong tiếp tục bị gel hóa. Quá trình này xảy ra trên bề mặt và phát triển vào bên trong.
8
Hình 1.3: Sự kết hợp ion Ca2+ với alginat 1.2.3. Tính chất của alginat. Độ tan Acid alginic không tan trong nước nhưng có khả năng hút nước để trương nở thành bột nhão. Muối alginat của kim loại hóa trị I (
,
) tan trong nước tạo thành
dung dịch có độ nhớt cao, còn muối kim loại hóa trị II hoặc III thì không tan trong nước trừ muối của
[1], [5].
Độ nhớt : Natri alginat có độ nhớt dao động trong khoảng 10 – 3500 cps. Độ nhớt phụ thuộc vào các yếu tố : Khối lượng phân tử : Khối lượng phân tử tăng thì độ nhớt tăng. Nhiệt độ : Khi nhiệt độ tăng độ nhớt giảm 2,5% cho 1 , khi duy trì nhiệt độ 90
trong nhiều giờ sẽ làm alginat bị cắt mạch và giảm độ nhớt, trái lại khi hạ nhiệt
độ tới điểm đông đặc sau đó rã băng thì độ nhớt của alginat không thay đổi.
9
pH : Liên kết glycozid rất nhạy cảm với pH do đó dưới các điều kiện thuận lợi cho việc thủy phân, alginat sẽ bị cắt mạch rất nhanh chóng. Độ nhớt của alginat không bị ảnh hưởng trong khoảng pH 5. [1], [5] Độ ổn định : Độ ổn định của các muối alginat xếp theo thứ tự : Na – alginat > Amoni – alginat > Acid – alginic; càng xếp cuối các muối càng kém ổn định. Alginat có độ nhớt cao nhanh rã hơn alginat có độ nhớt trung bình hoặc thấp. Ở nhiệt độ thường bột Na – alginat chỉ bảo quản được trong vài tháng nhưng nếu hạ nhiệt độ xuống thấp và bảo quản trong bóng tối thì sẽ bảo quản được lâu hơn. Alginat khô không bền với oxy, nhiệt độ và các ion kim loại. Khi có mặt các tác nhân này alginat sẽ bị rã ra. [5] Khả năng tạo gel của alginat: Khi phản ứng với các ion hóa trị II, III thì dung dịch alginat sẽ tạo gel. Các gel này sẽ tạo thành ở nhiệt độ phòng hay bất cứ nhiệt độ nào dưới 100
và chúng
không bị tan chảy khi đun nóng. Do cấu hình đặc biệt của đoạn mạch GGG tạo thành dạng gấp nếp như một cái vỉ trứng. Khoảng không gian của các vỉ xếp lên như chỗ đặt quả trứng. Các ion
khớp vào các khoảng trống này liên kết với
nhóm chức carboxyl và các nguyên tử oxy khi đó gel Ca – alginat được tạo thành. Độ bền của gel phụ thuộc vào : -
Chiều dài của các chuỗi tham gia liên kết (khối lượng phân tử) khi khối
lượng phân tử quá lớn mô đun đàn hồi không phụ thuộc vào khối lượng phân tử nữa. -
Tỷ lệ G/M và trình tự sắp xếp các gốc uronat: block G càng nhiều gel càng
bền hơn. -
Ái lực liên kết giữa polyme càng lớn gel càng bền. [5]
1.2.4. Ứng dụng. Sản lượng acid alginic trên toàn thế giới vào khoảng 32.000 – 39.000 tấn/năm. Những nước sản xuất alginat nhiều nhất là Scotlen, Nhật, Mỹ, Tây Ban
10
Nha, Trung Quốc. Ở Việt Nam, có nguồn rong mơ phong phú thích hợp cho việc sản xuất alginat, và thực tế đã sản xuất được alginat thương phẩm đạt chất lượng ở Nha Trang, Khánh Hòa. Alginat được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp : Ngành công nghiệp dệt : Sử dụng alginat chiếm gần 50% tổng sản lượng, alginat được sử dụng chủ yếu để hồ sợi vải và in hoa trên vải. Ngành công nghiệp thực phẩm : Alginat để làm keo, làm kẹo dẻo. Ngành công nghiệp khác: chế tạo keo dán giấy và chất kết dính trong công nghiệp diêm (keo alginat dùng vào việc dính kết hóa chất ở đầu que diêm và ở thành bao diêm). Ngành công nghiệp dược phẩm: làm tá dược rã viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng dược chất, dùng để đóng nang, bao phim. Còn được dùng để làm trơn, ngăn trào ngược dịch dạ dày và là yếu tố ổn định nhũ tương, huyền phù. Ngày nay, khi kỹ thuật bất động tế bào ngày càng phát triển và được đưa vào sử dụng rộng rãi trong thực tế thì vao trò của alginat cũng ngày càng được nâng cao. Trong kỹ thuật này alginat được sử dụng để cố định tế bảo như một gel có nhiều ưu điểm. [1] 1.3. Bacillus subtillis natto. 1.3.1 Đặc điểm . B. subtilis natto là trực khuẩn Gr (+), hiếu khí, nội bào tử hình que có kích thước dưới 1
. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi.
Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [17].
11
Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc của B. subtilis natto. 1.3.2. Nguồn gốc. B. subtilis natto được giáo sư Sawamura phân lập và định danh ban đầu năm 1905. Có nhiều trong cỏ khô, đậu nành. Phát triển trong các cây họ đậu, thực phẩm có nguồn gốc động thực vật khác như tảo biển, cá, thịt, tôm, cua... [17], [32]. Khi mới phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi là một vi sinh vật mới. Nhưng dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B.natto và B. subtilis của Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [26], [32] mà đã sắp xếp B. subtilis natto là một dòng thuộc loại B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác là có khả năng lên men tạo sản phẩm natto. 1.3.3. Phân loại khoa học Giới: Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillaceae; Họ: Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis; Dưới loài: Bacillus subtillis natto [17], [23]. 1.3.4. Cấp khí và nhiệt độ B. subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí nên trong quá trình nuôi cấy cần cung cấp oxy, và vi khuẩn này có thể phát triển ở nồng độ oxy > 3%.
12
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển vi khuẩn là giữa 39 tối ưu là 37
tới 43
, trong đó
. Ở 55 oC, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly giải tế bào sinh dưỡng
diễn ra. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40 oC [11], [22].
13
CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị. 2.1.1. Nguyên liệu – Hóa chất. Vi sinh vật sử dụng: Bacillus subtilis natto Xuất xứ: Nhật Bản.
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất Hóa chất
Nguồn gốc
Pepton
Ấn Độ
Cao thịt
Ấn Độ
Cao nấm men
Trung Quốc
NaCl
Trung Quốc
Alginat
Trung Quốc
CaCl2
Trung Quốc
Thạch bột
Việt Nam
NaCMC
Trung Quốc
Casein
Trung Quốc
Dung dịch xanh methylen
Việt Nam
KI, Iod
Trung Quốc
14
2.1.2. Máy móc – thiết bị - dụng cụ nghiên cứu.
Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng Thiết bị
Nguồn gốc
Tủ lạnh
Daewoo – Hàn Quốc
Máy khuấy từ
Heidolph - Đức
Nồi hấp
ALP – Nhật
Cân phân tích
Sartorius – Đức
Cân kỹ thuật
Sartorius – Đức
Lò vi sóng
Daewoo – Hàn Quốc
Tủ ấm
Memmert – Đức
Tủ cấy
Sanyo – Nhật
Tủ lắc Bioshaker
Taitec - Nhật
Các loại ống nghiệm, que cấy, ống ly tâm,.. khi sử dụng đều được hấp ở điều kiện 1atm/20 phút. 2.1.3. Môi trường nuôi cấy. Công thức môi trường thạch thường: Thành phần
Khối lượng
Pepton
1 gam
Cao thịt
0,5 gam
NaCl
0,5 gam
Thạch bột
2,3 gam
Nước máy vừa đủ
100 ml.
Môi trường nuôi cấy được chọn là môi trường canh thang do môi trường này hay được sử dụng để nhân giống B. subtilis natto và B. subtilis [11], [15].
15
Công thức môi trường canh thang: Thành phần:
Khối lượng
Pepton
1gam
Cao thịt
0,5 gam
NaCl
0,5 gam
Nước máy (vừa đủ)
100ml.
2.2. Nội dung nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu để giải quyết 2 mục tiêu sau : 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate tới cố định tế bào B. subtilis natto. 2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên số lượng tế bào cố định. 2.2.1.2. Đánh giá khả năng cố định tế bào ở các nồng độ alginat bằng phương pháp đếm. 2.2.1.3. Định tính Enzym ngoại bào có mặt trong dịch sau khi nuôi cấy (ở 37oC, 100 vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau. 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí tới cố định tế bào B. subtilis natto. 2.3. Phương pháp nghiên cứu. 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy B. subtilis natto. a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng. Pha môi trường thạch thường, đun cho đồng nhất. Chia đều vào các ống nghiệm (4-5 ml/ống), nút kín. Hấp tiệt khuẩn các ống ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn xong đặt nghiêng ống nghiệm để cho thạch nguội và đông lại. Tiến hành cấy truyền từ ống giống sang ống môi trường thạch thường mới theo hình zic
16
zắc. Đặt các ống vừa cấy vào tủ ấm, ở
/24 giờ. Bảo quản giống trong tủ lạnh ở
4-5 . Việc cấy truyền giống được thực hiện 1-2 tháng/lần [2], [4]. b) Phương pháp nhân giống trong bình nón. Pha 100ml môi trường canh thang cho vào bình nón 250ml, nút kín. Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn, lấy bình nón ra và để nguội tới khoảng 40 . Cấy giống từ môi trường giữ giống vào bình nón, Nuôi trên máy lắc ở 37 /24 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/ phút. Thu được dung dịch sinh khối tế bào [2], [4]. Thu sinh khối ướt: Ly tâm dịch sinh khối tế bào của B. subtilis natto với tốc độ 4000vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ phần dịch trong ở trên thu được sinh khối ướt. 2.3.2. Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginat. Pha các dung dịch sau : 300ml dung dịch
2% vào bình nón 500ml
400ml dung dịch NaCl 0,9% vào bình nón 500ml 50ml dung dịch Natri alginat 2%, 4% vào bình nón 250ml Đem hấp tiệt trùng ở điều kiện 1atm/20 phút, sau đó lấy ra để nguội. Với các bình alginat có nồng độ 2%, 4%, ta thêm sinh khối ướt đã chuẩn bị ở 2.3.1.b vào, lắc đều, đem khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút để tạo hỗn dịch đồng nhất, sau đó để yên 5 phút để loại bọt khí. Dùng pipet Pasteur nhỏ hỗn dịch này vào cốc đựng 50 ml dung dịch 2% đã tiệt trùng, hạt sẽ tạo thành, để yên 30 phút cho hạt ổn định rồi rửa hạt 3 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng. Ngay sau khi thu được hạt, cho 10gam hạt vào mỗi bình 100ml NaCl 0,9% đã được tiệt trùng và tiến hành nuôi cấy ở máy lắc với tốc độ khác nhau (100
17
vòng/phút hoặc 150 vòng/phút tùy vào từng thí nghiệm). Sau 24 giờ ta tiến hành thu lấy dịch nuôi cấy và hạt. Ly tâm phần dịch sau khi loại hạt để thu lấy sinh khối ướt, phần hạt được phá bằng dung dịch Natri citrat để xác định lượng sinh khối trong hạt.
Hình 2.1: Phương pháp tạo hạt gel Calci alginat Trong quá trình cố định tế bào thì ta cần lưu ý : Khi khuấy phải khuấy đủ thời gian để tạo hỗn hợp đồng nhất, khuấy xong phải để khoảng 5 phút để bọt khí thoát hết ra ngoài rồi mới đem tạo hạt. Sau khi tạo hạt xong phải để yên khoảng 30 phút để ion
có thể thấm
vào bên trong hạt để đảm bảo độ chắc của hạt. Nếu để lâu hơn 30 phút thì vi khuẩn B. subtilis natto có thể thiếu dinh dưỡng và bị chết, dẫn tới sai số. Sau khi vớt hạt phải rửa sạch ion nghiệm tiếp theo [3].
và tế bào bám bên ngoài hạt để tránh sai số cho các thực
18
Lúc đầu các hạt nổi trên mặt nước do ion
chưa thấm vào trong hạt nên
khi tạo hạt phải chú ý nhỏ giọt vào phần mà không có hạt để tránh các hạt dính vào với nhau. 2.3.3. Phương pháp phá hạt. Cho 10 gam hạt thu được vào bình nón có chứa 100ml dung dịch Na citrat 2% đã được tiệt trùng ở 1atm/20 phút, đã để nguội. Phá hạt bằng máy lắc với tốc độ 500 vòng/phút trong khoảng 20-30 phút ở nhiệt độ phòng cho tới khi các hạt Ca – alginat tan thành dung dịch đồng nhất trong Natri citrat. Sau đó ly tâm ta thu được sinh khối ướt của vi khuẩn B. subtilis natto ở trong hạt. 2.3.4. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính của các Enzym : Protease, cellulase, amylase. a) Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính enzym Protease. Nguyên tắc: Xác định khả năng phân giải Protein của protease trên cơ sở đo vòng phân giải casein trên đĩa thạch bởi việc sử dụng casein làm cơ chất [4]. Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 1% casein và 2% thạch trong cốc có mỏ. Thêm 4 giọt xanh methylen vào, khuấy đều và đun cho đồng nhất. Đổ 16ml dung dịch vào các đĩa petri có đường kính 11 cm. Khi thạch đông lại thì đục thạch thành các giếng thạch có đường kính 0,6cm. Nhỏ 0,05ml dịch mẫu thử vào các giếng thạch. Ủ trong tủ ấm 37 /24 giờ và đọc kết quả bằng các đo vòng phân giải casein [7]. b) Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính Enzym amylase. Nguyên tắc: Xác định khả năng phân giải tinh bột thành các oligosaccharid và đường đơn không bắt màu với thuốc thử Lugol [KI + Iod] của amylase. Dùng tinh bột làm cơ chất xác định bằng cơ sở đo vòng phân giải tinh bột trên đĩa thạch [4]. Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 1% tinh bột, 2% thạch trong cốc có mỏ 250 ml, khuấy đều và đun cho đồng nhất. Đổ 16ml dung dịch trên vào các đĩa petri.
19
Khi thạch đông lại thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm. Nhỏ 0,05ml dịch lắc hạt vào các giếng thạch. Ủ trong tủ ấm 37 /24 giờ. Dùng Lugol nhỏ lên bề mặt thạch để quan sát vòng phân giải tinh bột [4]. c) Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính enzym cellulase. Nguyên tắc: Xác định khả năng phân giải CMC thành các oligosaccharid không bắt màu với thuốc thử Lugol (KI + Iod) của cellulase. Dùng CMC làm cơ chất xác định bằng cơ sở đo vòng phân giải CMC trên đĩa thạch [2], [4]. Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 0,5% CMC, 2% thạch trong cốc có mỏ 250 ml (Chú ý ngâm CMC trương nở hoàn toàn), khuấy đều và đun cho đồng nhất. Đổ 16ml dung dịch trên vào các đĩa petri. Khi thạch đông lại thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm. Nhỏ 0,05ml dịch mẫu thử vào các giếng thạch. Ủ trong tủ ấm 37 /24 giờ. Dùng Lugol nhỏ lên bề mặt thạch để quan sát vòng phân giải CMC [4]. 2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục. Chuẩn bị các ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất, nút kín, đem hấp tiệt trùng ở 1atm/20 phút, để nguội tới nhiệt độ phòng. Hút chính xác 1ml dịch sinh khối ướt vào ống nghiệm thứ nhất ta được 10ml có nồng độ pha loãng , tiếp tục hút 1ml trong ống thứ nhất cho vào ống thứ hai được 10ml dịch có nồng độ 10,
, tiếp tục pha loãng tới các ống với nồng độ cần đo là khoảng 10-9, 10-
10-11, 10-12. Sau đó sử dụng phương pháp đổ thạch để đếm số lượng tế bào.
2.3.6. Phương pháp cấy trộn trong thạch. Hấp tiệt trùng 30ml thạch thường ở điều kiện 1atm/20 phút. Để nguội khoảng 50
sau đó trộn 10ml dịch có nồng độ cần đo đã pha loãng ở trên vào, lắc
đều. Sau đó đổ đều vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 20ml. Để ở tủ ấm 37
trong 24 giờ. Sau
đó mang ra đếm số khuẩn lạc mọc lên trên bề mặt của thạch. Từ đó tính được số lượng VSV cần đo.
20
Số VSV = Số khuẩn lạc
Công thức tính độ lệch chuẩn RSD
SD =
RSD =
SD: Độ lệch chuẩn. RSD: Độ lệch chuẩn tương đối
21
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình cố định tế bào B. subtilis natto. 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên số lượng tế bào cố định. Mục tiêu: Xác định lượng tế bào được cố định trong gel alginat ở các nồng độ khác nhau. Tiến hành: - Nuôi cấy thu hỗn dịch vi khuẩn theo phương pháp được nêu ở mục 2.3.1. - Cố định tế bào vi khuẩn với các nồng độ alginat 2%, 4% theo phương pháp được nêu ở mục 2.3.2. Sau đó đếm số lượng tế bào vi khuẩn cố định được theo phương pháp nêu ở mục 2.3.5 và 2.3.6. Kết quả thu được trình bày ở bảng sau: Ở nồng độ alginat 2%: Bảng 3.1: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt calci alginat 2% Số lượng tế bào Lần thí nghiệm Lần 1
200
25
4
Lần 2
325
48
1
Trung bình
262,5
36,5
2,5
0,37
0,45
0,85
Độ lệch chuẩn (RSD) Nhận xét:
Số lượng tế bào vi khuẩn B. subtilis natto cố định trong 1 gam hạt gel calci alginat 2% vào khoảng 2,5x1011 – 3,65x1011 tế bào.
22
Theo kết quả của Chhum Sokheng năm 2011 (tiến hành phương pháp cùng nồng độ 2%) [8], số lượng tế bào nấm men mà Chhum Sokheng cố định được vào khoảng 2,09 x 107 5,65 x 108 tế bào. Có sự sai khác giữa hai lần thí nghiệm do: -
Kích thước nấm men lớn hơn so với kích thước vi khuẩn B. subtilis natto nên
lượng tế bào cố định trong hệ gel của nấm men thấp hơn lượng tế bào vi khuẩn B. subtilis natto. -
Do sử dụng 2 loại alginat khác nhau nên số lượng tế bào nấm men cố định
được khác với tế bào vi khuẩn B. subtilis natto cố định được. Ở nồng độ alginat 4% Bảng 3.2: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt calci alginat 4% Lần thí nghiệm
Số lượng tế bào 1010
1011
1012
Lần 1
150
30
8
Lần 2
320
48
11
Trung bình
235
39
9,5
0,51
0,33
0,22
Độ lệch chuẩn (RSD) Nhận xét:
Số lượng tế bào vi khuẩn B. subtilis natto cố định trong 1 gam hạt gel calci alginat 4% vào khoảng 2,35x1012 – 9,5x1012 tế bào. Có thể nhận thấy sự khác biệt về số lượng tế bào B. subtilis natto khi thay đổi nồng độ alginat. Số lượng tế bào cố định được tăng lên khi nồng độ alginat tăng từ 2% lên 4%. Kết luận chung về khả năng cố định tế bào B. subtilis natto khi thay đổi nồng độ alginat được trình bày trong bảng 3.3 (tr.23).
23
Bảng 3.3: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt gel calci alginat ở các nồng độ khác nhau. Nồng độ alginat (%) Số lượng tế bào gói được trong 1 gam hạt gel
2%
4%
2,5x1011 – 3,65x1011
2,35x1012 – 9,5x1012
Nhận xét: Từ bảng 3.3 ta có đồ thị hình 3.1 để biểu diễn sự khác nhau của số lượng tế bào B. subtilis natto được cố định trong hạt gel ở nồng độ alginate 2% và 4%.
Số lượng tế bào x 1011
70 59.25
60 50 40 30 20 10
3.075
0 2%
4%
Nồng độ alginat Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto phụ thuộc vào nồng độ alginat. Nhận xét: Ở nồng độ alginat khảo sát từ 2% - 4%: Số lượng tế bào gói được trong 1 gam hạt gel của vi khuẩn B. subtilis natto đạt giá trị trong khoảng 1011 - 1012 tế bào. Tuy nhiên khi tăng nồng độ alginat từ 2% lên 4% số lượng tế bào tăng lên khoảng 10 lần (từ 1011 tới 1012 tế bào/gam hạt). Số lượng tế bào B. subtilis natto cố định được trong 1 gam hạt ở nồng độ alginat 4% đạt giá trị cao hơn so với số lượng tế bào B.
24
subtilis natto được cố định trong 1 gam hạt ở nồng độ alginat 2%. Kết quả thu được ở bảng 3.3 có thể giải thích như sau: Khi nồng độ alginat tăng từ 2% lên 4%, mật độ lỗ gel nhiều hơn, block GGG tăng lên do đó sẽ có nhiều chỗ hơn. Có thể khi nồng độ alginat 4% thì trạng thái xốp, rỗng sẽ thấp hơn nồng độ alginat có nồng độ 2% nên khả năng cố định tế bào cao hơn [9]. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình cố định tế bào bằng phương pháp đếm Mục tiêu: Xác định khả năng cố định tế bào trong gel alginat ở các nồng độ khác nhau. Tiến hành : - Nuôi cấy tế bào B. subtilis natto theo phương pháp 2.3.1. - Cố định tế bào với nồng độ alginat 2%, 4% theo phương pháp cố định đã được nêu ở 2.3.2 - Đếm số lượng tế bào bằng phương pháp pha loãng liên tục và phương pháp nuôi cấy trộn trong thạch để xác định được số lượng tế bào ở 2.3.5 và 2.3.6. Kết quả thu được nêu trong bảng 3.4 và 3.5: Ở nồng độ alginat 2% : Bảng 3.4: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt sau khi nuôi cấy (ở 37 , 100 vòng/ phút, 24h) Số lượng tế bào Lần thí nghiệm Lần 1
17
15
1
Lần 2
20
19
6
Trung bình
18,5
17
3,5
Độ lệch chuẩn (RSD)
0,11
0,17
1,01
25
Nhận xét: Sau khi nuôi cấy trong môi trường canh thang (ở 37 , 100 vòng/ phút, 24h). số lượng tế bào vi khuẩn B. subtilis natto cố định trong 1gam hạt gel Ca- alginat 2% vào khoảng 1,85 x
– 3,5 x 1011 tế bào. So sánh với bảng 3.1 ta thấy số lượng
tế bào trước và sau khi nuôi cấy (ở 37 , 24 giờ, 100 vòng/ phút, 24h) đạt giá trị tương đương nhau ( khoảng 1011 tế bào/gam hạt). Ở nồng độ alginat 4% Bảng 3.5: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1gam hạt Alginat 4% sau khi nuôi cấy (ở 37 , 100 vòng/ phút, 24 giờ) Số lượng tế bào Lần thí nghiệm Lần 1
65
35
9
Lần 2
71
24
5
Trung bình
68
29,5
7
0,06
0,26
0,4
Độ lệch chuẩn (RSD) Nhận xét :
Sau khi nuôi cấy các hạt cố định trế bào trong môi trường canh thang (ở 37 , 100 vòng/ phút, 24h), số lượng tế bào có trong 1 gam hạt là 6,8 x
–7x
tế bào So sánh kết quả của bảng 3.2 và 3.5 cho thấy số lượng tế bào vi khuẩn B. sutilis natto giữ được trong hạt gel có nồng độ alginate 4% sau khi nuôi cấy (điều kiện 37oC, 100 vòng/phút, sau 24 giờ) đạt giá trị tương đương với số lượng tế bào VSV trước khi nuôi cấy. Để so sánh sự ảnh hưởng của nồng độ alginat tới khả năng bảo vệ tế bào ta có bảng 3.6 (tr.26).
26
Bảng 3.6: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt gel ở các nồng độ alginat khác nhau sau khi nuôi cấy (ở 37oC, 100 vòng/phút, 24 giờ) Nồng độ alginat (%)
2
Số lượng tế bào gói được trong 1gam hạt gel
1,85
- 3,5
4 6,8
-7
Nhận xét: Từ bảng 3.6 ta có thể thấy số tế bào VSV còn lại của hạt gel calci alginat sau khi nuôi cấy ở 37oC, 100 vòng/phút , sau 24 giờ có nồng độ 2% thấp hơn hạt gel calci alginat có nồng độ 4% khoảng 20 lần. 450 384
Số lượng tế bào x 1010
400 350 300 250 200 150 100 50
18.425
0 2%
4%
Nồng độ alginat Hình 3.2 : Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt gel ở các nồng độ khác nhau. Nhận xét: Từ bảng 3.3 và bảng 3.6 ta có thể thấy khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn tăng khi nồng độ alginat tăng từ 2% lên 4%. Ở 2% thì số lượng tế bào sau khi nuôi cấy chiếm 60% so với số lượng tế bào trước khi nuôi cấy. Còn ở 4% thì tỉ lệ này là 65%. Từ đó cho thấy khả năng bảo vệ tế bào của hạt gel phụ thuộc vào nồng độ alginat, nồng độ alginat càng cao thì khả năng bảo vệ càng lớn. Do nồng độ alginat càng cao
27
thì trạng thái xốp, rỗng của hạt càng thấp, nên khả năng thoát VSV càng ít hơn. Từ đó khả năng bảo vệ tế bào cũng cao hơn [9]. Từ bảng 3.3 và 3.6 số lượng tế bào VSV ở trước và sau khi nuôi cấy ta thấy số lượng VSV sau nuôi cấy ít hơn số lượng VSV trước nuôi cấy. Vì vậy ta làm thí nghiệm dưới đây để xác định số lượng tế bào VSV thoát ra dịch nuôi cấy. Ở nồng độ alginat 2%: Bảng 3.7 : Số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch ( dịch sau khi nuôi cấy ở 37 , 100 vòng/ phút, 24h) : Số lượng tế bào Lần thí nghiệm Lần 1
62
9
2
Lần 2
58
5
0
Trung bình
60
7
1
0,05
0,4
1,41
Độ lệch chuẩn (RSD) Nhận xét :
Sau khi nuôi cấy trong môi trường canh thang ( ở 37 , 100 vòng/ phút, 24h). Số lượng tế bào vi khuẩn B. subtilis natto có trong dịch nuôi cấy là 6 x 1x
–
tế bào. Từ đó có thể thấy sau khi nuôi cấy hạt gel có nồng độ alginate 2%
thì có sự thất thoát vi sinh vật trong hệ gel ra ngoài môi trường nuôi cấy. Ở nồng độ alginat 4%, số lượng tế bào VSV thoát ra ngoài dịch nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.8 (tr.28).
28
Bảng 3.8 : Số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch hạt alginat 4% ( dịch sau khi nuôi cấy ở 37 , 100 vòng/ phút, 24h ). Số lượng tế bào Lần thí nghiệm Lần 1
231
27
3
Lần 2
250
24
4
Trung bình
239,5
25,5
3.5
0,02
0,83
0,04
Độ lệch chuẩn (RSD) Nhận xét :
Sau khi nuôi cấy trong môi trường canh thang ( ở 37 , 100 vòng/ phút, 24h). Số lượng tế bào vi khuẩn B. sutilis natto trong dịch là 2,55 x
– 3,5 x
tế bào. Điều này chứng tỏ trong quá trình nuôi cấy hạt có nồng độ alginate 4% tế bào bị thất thoát ra khỏi hệ gel vào môi trường nuôi cấy. Từ bảng 3.7 và 3.8 ta thấy số lượng VSV trong dịch thoát ra giảm dần từ nồng độ alginat 4% tới nồng độ alginate 2%. Ở nồng độ 2% số lượng tế bào VSV trong dịch nuôi cấy là 6 dịch nuôi cấy là 2,4
tế bào trong khi ở 4% số lượng tế bào trong
-1 – 3,6
tế bào. Để so sánh số lượng tế bào B. subtilis
natto có trong dịch nuôi cấy sau khi nuôi cấy hạt gel có nồng độ alginate 2% và 4% ở 37oC, 100 vòng/phút, trong 24 giờ ta có bảng 3.9. Bảng 3.9: Số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy sau khi nuôi cấy ở 37oC, 100 vòng/phút, trong 24 giờ. Nồng độ alginat (%) Số lượng tế bào trong dịch trong 1 gam hạt gel
2 6
-1
4 2,4
– 3,5
29
Nhận xét: Có thể thấy sau khi nuôi cấy hạt cố định ở 37oC, 100 vòng/ phút sau 24 giờ, dịch nuôi cấy có chứa tế bào VSV B. subtlis natto do: Khi nuôi cấy các hạt cố định thì các tế bào nhỏ bị rơi ra khỏi hạt trong quá
-
trình nuôi cấy, sau đó trong môi trường canh thang nó lại tiếp tục được sinh trưởng và phát triển. Các tế bào VSV vẫn tiếp tục sinh sản và phát triển trong hạt gel do. Từ đó
-
các tế bào có thể phát triển và các tế bào trên bề mặt hạt phát triển, phá vỡ bề mặt hạt gel và thoát ra ngoài môi trường dịch nuôi cấy. Để so sánh số lượng tế bào VSV thoát ra ngoài dịch nuôi cấy ta lập đồ thị ở hình 3.3 dưới đây.
90 80
Số lượng tế bào x106
80 70 60 50 40 30 19.2
20 10 0 2%
Nồng độ alginat
4%
Hình 3.3 : Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch nuôi cấy (37oC, 100 vòng/phút, trong 24 giờ) ở các nồng độ alginat khác nhau.
30
Nhận xét: Từ đồ thị trên ta có thể thấy khả năng cố định tế bào, giữ tế bào cao nhất ở nồng độ alginat 4% và giảm ở nồng độ 2%. Khả năng thoát tế bào ra ngoài thì cũng giảm từ 2% alginat tới 4% alginat. Ta có thể thấy khi nuôi cấy các hạt cố định, quá trình lắc sẽ làm các tế bào bị rơi ra khỏi hạt cố định. Tuy nhiên lượng tế bào rơi ra khỏi hạt cố định chỉ nằm trong khoảng
- 108 tế bào/gam hạt trong khi số lượng tế bào VSV cố định được trong
hạt là
-
tế bào/gam hạt. Vi khuẩn B. subtilis natto sau khi được cố định
vào trong hạt gel calci alginate vẫn có khả năng sinh trưởng và phát triển. 3.1.3. Định tính Enzym có mặt trong dịch sau khi nuôi cấy (ở 37oC, 100 vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau. Theo các nghiên cứu được công bố, trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto có nhiều loại enzym khác nhau [11]. Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy lần lượt là 37oC và 24 giờ đã được công bố là tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp protease của B. subtilis natto [11], [12], [14], [22]. Vì vậy thí nghiệm tiến hành để sơ bộ xác định sự tồn tại của một số enzym ngoại bào [30]. Dịch nuôi cấy là môi trường canh thang với các thông số được lựa chọn là 37
,
trong 24 giờ, tại 100 vòng/ phút. Theo các nghiên cứu đã công bố có nhiều loại enzym khác nhau trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto [17], [30]. Mục đích : Khảo sát sự tồn tại của Enzym ngoại bào khi nuôi cấy B. subtilis natto trong dịch dịch nuôi cấy (ở 37
, trong 24 giờ, 100 vòng/ phút) chứa hạt cố
định. Tiến hành : Nuôi cấy B. subtilis natto, tạo hạt và nuôi cấy hạt trong môi trường canh thang ở 37
, trong 24 giờ, 100 vòng/ phút. Thu phần dịch trong. Thử
khả năng phân giải casein, tinh bột, NaCMC của dịch ở các hạt có nồng độ alginat khác nhau : 2%, 4%.
31
Ở nồng độ alginat 2% : Bảng 3.10 : Sơ bộ thử hoạt tính enzym trong dịch nuôi cấy hạt calci alginat 2%
Đường kính vòng Đường kính vòng Đường kính vòng Lần thí nghiệm
phân giải casein Dịch
Mẫu trắng
phân giải tinh bột Dịch
Mẫu trắng
phân giải NaCMC Dịch
Mẫu trắng
Lần 1
1,8
(-)
0,85
(-)
0,99
(-)
Lần 2
1,82
(-)
0.87
(-)
0,95
(-)
Lần 3
1,77
(-)
0,86
(-)
0,96
(-)
Lần 4
1,75
(-)
0.86
(-)
0,97
(-)
Lần 5
1,8
(-)
0,87
(-)
0,97
(-)
Lần 6
1,87
(-)
0,85
(-)
0,96
(-)
Ghi chú (-) : Không xuất hiện vòng phân giải cơ chất Đơn vị đường kính vòng phân giải cơ chất : cm Nhận xét: Kết quả trên cho thấy dịch thu được sau khi nuôi cấy B. subtilis natto (ở 37 , trong 24 giờ, 100 vòng/phút) ở trạng thái cố định hạt calci alginat có nồng độ 2% đều có khả năng phân giải cơ chất casein, tinh bột, NaCMC. Mẫu trắng không cho vòng phân giải cơ chất casein, tinh bột, NaCMC do đó đã loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả thí nghiệm. Điều này chứng tỏ ở trạng thái cố định trong gel có nồng độ alginat 2%, tế bào B. subtilis natto vẫn phát triển bình thường và sinh các Enzym ngoại bào.Trong dịch nuôi cấy hạt cố định có nồng độ alginat 2% có mặt cả protease, amylase và cellulase.
32
Ở nồng độ alginat 4%: Bảng 3.11: Sơ bộ thử hoạt tính enzym trong dịch nuôi cấy hạt calci alginat 4%
Lần thí nghiệm
Đường kính vòng
Đường kính vòng
Đường kính vòng
phân giải casein
phân giải tinh bột
phân giải NaCMC
Dịch
Mẫu trắng
Dịch
Mẫu trắng
Dịch
Mẫu trắng
Lần 1
1,63
(-)
(-)
(-)
0,97
(-)
Lần 2
1,65
(-)
(-)
(-)
0,95
(-)
Lần 3
1,69
(-)
(-)
(-)
0.96
(-)
Lần 4
1,63
(-)
(-)
(-)
0,95
(-)
Lần 5
1,62
(-)
(-)
(-)
0,97
(-)
Lần 6
1,6
(-)
(-)
(-)
0,95
(-)
Ghi chú (-) : Không xuất hiện vòng phân giải cơ chất Đơn vị đường kính vòng phân giải cơ chất : cm Nhận xét : Kết quả trên cho thấy dịch thu được sau khi nuôi cấy B. subtilis natto (ở 37 , trong 24 giờ, 100 vòng/phút) ở trạng thái cố định hạt calci alginat có nồng độ 4%, có khả năng phân giải cơ chất casein, NaCMC mà không có khả năng phân giải tinh bột. Mẫu trắng không có vòng phân giải cơ chất do đó đã loại trừ được ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả thí nghiệm. Điều này chứng tỏ ở trạng thái cố định trong gel có nồng độ alginat 4%, tế bào vẫn sinh trưởng và sinh các enzym ngoại bào, tuy nhiên trong dịch nuôi cấy có nồng độ alginat 4% thì có mặt của protease và cellulase mà không có mặt enzym amylase. Bàn luận : Các kết quả trên cho thấy cố định tế bào vi khuẩn B. subtilis natto ở nồng độ alginat 2% và 4% thì dịch có khả năng phân giải casein, NaCMC, cố định VSV ở nồng độ alginate 2% có khả năng phân giải tinh bột còn cố định VSV ở 4% không
33
có khả năng phân giải tinh bột . Điều đó chứng tỏ B. subtilis natto có sinh enzym ngoại bào ( protease, amylase, cellulase) sau khi cố định. Theo nghiên cứu trên thế giới [32] và kết quả của Đinh Thị Thanh Thảo năm 2013 (tiến hành trên cùng giống vi khuẩn) [6], protease tập trung chủ yếu vào phần dịch nổi hay dịch trong. Có thể thấy, ở nồng độ alginat 2% có các enzym ngoại bào trong dịch nuôi cấy, tuy nhiên ở nồng độ 4% dịch nuôi cấy chỉ có enzym protease và cellulase mà không có enzym amylase.. Kết luận sơ bộ : Số lượng tế bào được cố định trong hạt có nồng độ alginat 4% là cao hơn so với hạt có nồng độ 2% khoảng 10 lần. Và tế bào B. subtilis natto vẫn sinh trưởng, phát triển, sinh sản và tạo enzym khi được cố định trong gel alginate. 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí tới quá trình cố định tế bào B. subtilis natto. Phần 3.1 ta thấy ở nồng độ alginat 2% có khả năng sinh enzym protease, amylase và cellulase. Tuy nhiên, khi lắc hạt, các tế bào VSV nằm trong hạt sẽ thoát ra ngoài môi trường dịch nuôi cấy. Nếu dịch nuôi cấy là môi trường canh thang thì các tế bào sẽ phát triển, sinh sản và dẫn tới sai số trong quá trình đếm. Chính vì vậy ở thí nghiệm này ta sẽ dùng nước muối sinh lý làm dịch lắc hạt, tránh việc các tế bào vi khuẩn B. subtilis natto thoát ra sinh trưởng và phát triển tiếp sẽ dẫn tới sai số trong quá trình khảo sát. Lựa chọn nồng độ alginat 2%, nhiệt độ lắc là 37oC, thời gian lắc là 24 giờ.
Mục tiêu: Xác định khả năng cố định tế bào của gel alginat ở các điều kiện
cấp khí khác nhau.
Tiến hành: - Nuôi cấy vi khuẩn theo phương pháp được nêu trong mục 2.3.1. - Cố định tế bào vi khuẩn theo phương pháp được nêu 2.3.2 - Lắc trong môi trường nước muối sinh lý ở 37oC trong 24 giờ, 100 vòng/phút
hoặc 150 vòng/phút
34
- Đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng liên tục và phương pháp nuôi cấy trong thạch trộn ở mục 2.3.5 và 2.3.6. Sau khi tiến hành thí nghiệm ta có kết quả thu được: Bảng 3.12 : Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt lắc ở 100 vòng/ phút trong 24 giờ Số lượng tế bào Lần thí nghiệm Lần 1
435
53
4
Lần 2
521
36
7
Trung bình
478
44,5
5,5
0,13
0,27
0,39
Độ lệch chuẩn (RSD) Nhận xét:
Sau khi nuôi cấy (ở 37
, trong 24 giờ, 100 vòng/phút). Số lượng tế bào B.
subtilis natto có trong 1 gam hạt sau khi nuôi cấy ở 100 vòng/phút là : 4,45 tế bào. So sánh với bảng 3.1 ta thấy số lượng ban đầu khoảng 1011 tế
– 5,5
bào/ gam hạt điều này chứng tỏ có sự thất thoát tế bào trong quá trình lắc hạt cố định vi khuẩn B. subtilis natto. Bảng 3.13: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong 1 gam hạt lắc ở 150 vòng/phút trong 24 giờ. Số lượng tế bào Lần thí nghiệm
Lần 1
134
11
3
Lần 2
241
18
5
Trung bình
187,5
14,5
4
Độ lệch chuẩn (RSD)
0,40
0,34
0,35
35
Nhận xét: Sau khi nuôi cấy (ở 37
, trong 24 giờ, 150 vòng/phút). Số lượng tế bào B.
subtilis natto có trong 1 gam hạt sau khi lắc ở 150 vòng/ phút là : 1,45
–4
tế bào. So sánh với số liệu ở bảng 3.1 ta thấy có sự thất thoát tế bào sau khi lắc hạt cố định vi khuẩn B. subtilis natto ở 150 vòng/phút. Để so sánh khả năng giữ tế bào vi khuẩn B. subtilis natto trong hạt gel khi lắc ở điều kiện cấp khí khác nhau ta có bảng 3.14 Bảng 3.14 : Số lượng tế bào B. subtilis natto được giữ trong hạt alginat 2% lắc ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút Số vòng lắc (vòng/phút) Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1gam hạt alginat
100
4,45
150 – 5,5
1,45
–4
2% Nhận xét: Từ bảng 3.14 trên ta thấy sau khi nuôi cấy (ở 37
, trong 24 giờ) số lượng tế
bào VSV giữ trong 1 gam hạt alginat 2% lắc ở 100 vòng/phút so với hạt lắc ở 150 vòng/phút là như nhau. Tuy nhiên khi so sánh với bảng 3.1 ta thấy có sự thoát ra của tế bào vi khuẩn B. subtilis natto khi lắc hạt cố định trong điều kiện cấp khí. Chính vì vậy chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm tiếp theo để khảo sát khả năng thoát tế bào VSV ra môi trường dịch lắc.
36
Lắc ở 100 vòng/phút Bảng 3.15: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc ở 100 vòng/phút trong 24 giờ Số lượng tế bào Lần thí nghiệm
Lần 1
90
11
3
Lần 2
106
5
0
Trung bình
98
8
1,5
Độ lệch chuẩn (RSD)
0,12
0,53
1,41
Nhận xét: Sau khi nuôi cấy (ở 37
, trong 24 giờ, 100 vòng/phút). Số lượng tế bào có
trong dịch lắc ở 100 vòng/phút trong 24 giờ là 8
– 1,5
tế bào. Có tế
bào VSV thoát ra môi trường dịch lắc hạt cố định khi lắc ở 100 vòng/phút. So sánh với bảng 3.1 ta nhận thấy số lượng tế bào B. subtilis natto thoát ra là nhỏ hơn khoảng 104 lần so với tế bào VSV được cố định trong hạt gel. Vậy số lượng tế bào VSV thoát ra là không đáng kể. Lắc ở 150 vòng/phút Bảng 3.16: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ. Số lượng tế bào Lần thí nghiệm
Lần 1
300
38
8
Lần 2
450
54
12
Trung bình
375
46
10
Độ lệch chuẩn (RSD)
0,28
0,25
0,28
37
Nhận xét: Sau khi lắc (ở 37 , trong 24 giờ, 150 vòng/phút). Số lượng tế bào có trong dịch lắc 150 vòng/ phút là : 3,75 –1 tế bào. So sánh với số lượng tế bào VSV cố đinh được trong hạt gel có nồng độ alginat 2% ở bảng 3.1 ta thấy số lượng tế bào VSV thoát ra ngoài dịch lắc nhỏ hơn số lượng tế bào VSV được cố định trong hạt gel alginat khoảng 103 lần nên số lượng tế bào VSV thoát ra là không đáng kể. Để so sánh ảnh hưởng của điều kiện cấp khí tới sự thoát ra ngoài môi trường dịch lắc của tế bào VSV ta có bảng 3.17. Bảng 3.17: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút. Số vòng lắc (vòng/phút) Số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy
100
8
– 1,5
150
3,75
–1
Nhận xét: Từ bảng 3.17 ta có thể thấy số lượng tế bào vi khuẩn B. subtilis natto thoát ra dịch lắc hạt cố định ở 100 vòng/ phút nhiều hơn khoảng 10 lần so với hạt cố định được lắc ở 150 vòng/phút. Để thấy rõ hơn sự so sánh này ta có hình 3.4 (tr.38) dưới đây.
38
Số lượng tế bào x 106 (cfu/g)
80 68.75
70 60 50 40 30 20 11.5 10 0 100 vòng/phút
150 vòng/phút
Tốc độ lắc Hình 3.4: Số lượng tế bào VSV B. subtilis natto trong dịch nuôi cấy hạt Alginat 2% ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút. Từ biểu đồ trên ta thấy, số lượng VSV thoát ra khi nuôi cấy B.subtilis natto được cố định trong hạt gel có nồng độ alginat 2% ở 150 vòng/ phút nhiều hơn so với số lượng VSV thoát ra khi nuôi cấy B.subtilis natto được cố định trong hạt gel có nồng độ alginat 2% ở 100 vòng/phút. Kết luận sơ bộ: Điều kiện cấp khí trong quá trình nuôi cấy hiếu khí có ảnh hưởng đến số lượng tế bào bị thất thoát ra dịch lắc, còn số lượng tế bào trong hạt thì không bị ảnh hưởng bởi điều kiện cấp khí (trong khoảng 109 – 1010 tế bào/gam hạt). .
39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1.
Kết luận :
Qua quá trình nghiên cứu đề tài đã thu được các kết quả như sau: 1.1.
Khảo sát khoảng nồng độ alginat 2% và 4% để cố định tế bào B. subtilis
natto thu được số lượng tế bào cố định khoảng 1011 – 1012 tế bào/gam hạt. Khả năng cố định với nồng độ alginat 4% cao hơn so với nồng độ alginat là 2%. Khả năng bảo vệ của hạt gel có nồng độ alginat 4% là tốt hơn so với hạt có nồng độ algiant 2%. Tuy nhiên dịch nuôi cấy các hạt cố định ở nồng độ 2% có chứa 3 enzym ngoại bào là protease, amylase và cellulase, còn ở nồng độ 4% không có enzym amylase. Từ đó ta thấy tế bào B. subtilis natto vẫn sinh trưởng, phát triển và sinh enzyme sau khi được cố định. 1.2.
Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí tới cố định tế bào B. subtilis natto,
trong các điều kiện cấp khí khác nhau ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút ta thấy số lượng tế bào B. subtilis natto được giữ trong hạt không thay đổi, nhưng số lượng tế bào B. subtilis natto thoát ra ngoài dịch lắc hạt cố định có sự sai khác nhau. Số lượng tế bào VSV thoát ra dịch lắc hạt cố định trong điều kiện cấp khí 100 vòng/phút thấp hơn khoảng 10 lần so với dịch lắc hạt cố định trong điều kiện cấp khí 150 vòng/phút. 2.
Đề xuất :
`Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi xin đưa ra một số đề xuất : 2.1.
Tiến hành khảo sát khả năng cố định tế bào B. subtilis natto ở nồng độ
alginat 3%. 2.2.
Tiến hành khảo sát khả năng cố định tế bào B. subtilis natto của hạt gel có
nồng độ alginat 4% ở điều kiện cấp khí 100 vòng/phút.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Trần Văn Ân (1982), Góp phần nghiên cứu chất lượng rong mơ và chiết Alginat từ rong mơ ở hòn Chống – Nha Trang , Luận án phó tiến sỹ khoa học Hà Nội 1982, tr 120-123. 2. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung,Vương Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học. NXB Đại học Sư phạm Hà Nội, tr 25-34, 96-100. 3. Lê Gia Hy (2006), Vi sinh vật học đại cương (tập II). Viện công nghệ sinh học, viện khoa học và công nghệ Việt Nam, Hà Nội. 4. Lê Xuân Phương (2008) , Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng , tr. 33-36, 43-49, 87 5. Ngô Đặng Nghĩa (1999), “ Tối ưu hóa quy trình công nghệ sản xuất Alginat Natri từ rong mơ Việt Nam và ứng dụng của nó trong một số lĩnh vực của sản xuất“, Luận án tiến sỹ kỹ thuật, tr 13 – 27 6. Đinh Thị Thanh Thảo (2013). Nghiên cứu tách chiết enzym Protease bằng amoni sulfat từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto. Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ, trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 22-23. 7. Nguyễn Thị Thảo, Quyền Quỳnh Thi (2004), “Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của chủng Serrartia sp.DT3”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 2(2), tr. 205-216. 8. Chhum Sokheng (2011). Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ alginat và kích thước vi sinh vậy lên quá trình cố định tế bào. Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ, trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 27 – 31.
Tài liệu tiếng Anh 9. Australian Journal of Basic and Applied Sciences (2009). “The Effect of Sodium Alginate Concentrations on Viability of Immobilized Lactobacillus Acidophilus in Fruit Alginate Coating During Refrigerator Storage”, p. 3213 – 3226
10. Bickerstaff, Gordon F., Immobilization of enzyms and cells, 367p. 11. Ishtiaq Ahmed, Muhammad Anjum Zia (2011), “ Purification and kinectic parameters characterization of an alkaline protease produced from Bacillus subtilis through submerged fermentation technique”, World Applied Scienes Journal, 12(6), p. 751 – 757. 12. Jian X., Xue – li Z., Guang C. (2005), “Optimization of liquid fermentation conditions of nattokinase”, Journal of Jilin Agricultural University, p. 5. 13. Mikio Shimizu (1992), “ Purification and Characterization of Phytase from Bacillus subtilis (natto) N – 77”, Bioscience biotechnology and biochemistry, 56(8), p.1266 - 1269. 14. Xie Qiuling Guo Jong (1999), “ The optimization of fermentation conditions of nattokinase”, Journal of south China university of technology (natural science), p. 5. 15. Gitishree Das, M. P. Prasad (2010), “Isolation, purification & mass production of protease enzyme from Bacillus subtilis”. International Reseach Journals of Microbiology, 1(2), p. 26 – 31. 16. Holsworth (2002), “ Nattokinase and Cardiovascular Health “, Special Report, p. 2. 17. Keith H. Steinlraus (2004), Industrialization of indigenous fermented foods, p. 227-230. 18. Kourkoutas, Y., Bekatorou, A., Banat, I. M., Marchant, R. Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol berverages production: a review, Microbiology, Vol 21, 2004, 377-397. 19. Kourkoutas, Y. Kanellaki, M. Koutinas, A.A., Apple Pieces as immobilization support of various microorganisms, LWT, Vol. 39, 2006, 980-986. 20. Martynenco, N. N and Gracheva , L. M., Physiological and Biochemical Characteristics of Immobilized Champagne Yeasts and their Participation in Champagnizing Processes :A Review , Applied Biochemistry and MicroBiology, Vol. 39, No. 5, 2003, 439 - 445.
21. Misugu Fujita et al (1993), “ Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan”, Biochemical and Biophysical reseach communication, p. 1340 – 1347. 22. Panuwa Chantawannakul, Anchalee Oncharoena (2002), “ Characterization of protease of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailand”, Science Asia, 28, p. 241 – 245 23. Paul De Vos et al (2009), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology – the Firmicutes, 3, Springer Science Business Media, p. 20 - 24. 24. R. Gupta, Q. K. Beg (2002), “ Bacterial alkaline proteases: molecular approaches
and
industrial applications
“,
Applied
Microbiology
and
Biotechnology, 59, p. 15 – 32. 25. Sadia Almas, Abdul Hameed (2009), “Purirification and characterization of a novel protease from Bacillus strain SAL1”. African Journal of Biotechnology, 8(15), p. 3603 – 3609. 26. Seki T., Oshima T. (1975), “ Taxonomic study of Bacillus by deoxyribonucleic acid – deoxyribonucleic acid hybridization and interspecific transfomation”, International Journal of Systematic Bacteriology, 25(3), p. 258 - 270. 27. Shogo Tokudome, Kazunobu Omura (2005), “ A newly derived protein from Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic efects”, Journal of Pharmacological Sciences, 99, p. 247 – 251. 28. Souza, S. F., Melo, J. S., Deshpande, A. and Nadkarni , G. B., Immobilization yeast cells by adhesion to glass surface using polyethylenimine, Biotechnology letters. Vol 8, No. 9, 1986, 643-648. 29. Sumi Hiroyuki, Yoshikawa Misako(1999), “ Elastase activity in Natto, and ít relation to nattokinase”, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 73(11), p. 1187-1190. 30. Sun yan, Wang JiaQi (2011), Screening of protease and cellulase producing Bacillus subtilis natto strain and its growth characteristics “, Dongbei Nongye Daxue Xuebao Journal, 42(3), p. 39 – 43.
31. Y., Ogawa, H.Hosoyama, M. Hamano, M. Motai (1991), “ Purification and properties of
– glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis natto”,
Agrcultural Biology and Chemistry, 55, p. 2972 – 2977. 32. Tamang J., Thapa S. (2002),Phylogenetic analysis of Bacillus strains isolated from fermented soybean foods of Asian : Kinema, Chungkokjang and Natto” , Journal of Hill Resarch, 15(2), p. 56 - 62. 33. Xiaoyan Zu, Zhenya Zhang (2010), “Thrombolytic activities of nattokinase extracted from B. subtilis fermented soybean curd residues”, International Journal of Biology, 2(2), University of Tsukuba.
