UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO BIOTECNOLOGÍA DE LOS PAI
ING. AGROINDUSTRIAL IX
DETERMINACIÓN DE BIOMASA RECUENTO EN CÁMARA DE NEUBAUER
I. INTRODUCCIÓN En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el número de microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en estudio de curvas de crecimiento, análisis de alimentos, preparaciones de inóculos para fermentación, etc. Un parámetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de plantas de agroindustriales dedicadas a procesos de fermentación, panificación entre otros en donde se utilicen inóculo es la concentración de biomasa. Biomasa es un término general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. Existen muchas maneras de medir la concentración de biomasa, como por ejemplo masa, volumen, extensión linear de filamentos, dispersión de luz, conteo de células u organelas. Existen diferentes métodos para cuantificar el número de microorganismos o peso (biomasa) de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos se puede mencionar a la determinación de peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer. La determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utilizado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtración, lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificación. El método de cuenta directa en cámara tiene la ventaja de ser muy rápido y económico, aunque no se pueden distinguir las células viables y no viables. Se puede calcular el número de microorganismos en una muestra a partir del volumen de la cámara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la observación y cuantificación se dificultan en células muy pequeñas (1 – 5 µm) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumen de muestra que se utiliza (0.1 – 0.2 mm3).
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II. OBJETIVOS
Determinar la biomasa presente en una solución de levadura y expresarla en unidades de células/ml.
Aprender el método de recuento en la cámara de Neubauer
III. FUNDAMENTO TEÓRICO 3.1. Medida del crecimiento El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologías. Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las células individuales, esto es iniciar y completar una división celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el número total de partículas bacterianas (Franson, 1992). Existen dos formas para determinar el número total de microorganismos en una muestra:
Recuento microscópico de partículas Recuento electrónico de partículas
Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido a que sólo se tiene en cuenta el número de microorganismos viables, esto es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:
Recuento de colonias Método del número más probable
Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la síntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la síntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la división celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimático para utilizar los recursos del medio y formar biomasa:
Determinación de peso húmedo Determinación de peso seco Determinación de nitrógeno total Determinación química de un ácido nucleíco 2
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Un último grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los microorganismos en los cambios químicos de su entorno como consecuencia del incremento de la biomasa(Tortora, Funke, & Case, 2007).
3.2. Recuentos Directos Recuento microscópico: Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentadas o teñidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina). La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproducibilidad en el llenado de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o medios mínimos sin fuente de carbono) (Rodriguez, 2005) Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados (Palma, 2001).
3.3. La Cámara de Neubauer Es un instrumento utilizado en medicina y biología para realizar el recuento de células en un medio líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc.(Ames & Cañedo, 2004). Esta cámara de contaje está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las cuales se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un cubrecámaras que se adhiere por simple tensión superficial. Luego se introduce el líquido a contar, al que generalmente se ha sometido a una dilución previa con un diluyente, por capilaridad entre la cámara y el cubrecámara; puesto que tiene dos zonas esto permite hacer dos recuentos simultáneamente. Para contar las células se observa el retículo al microscopio con el aumento adecuado y se cuentan las celulas. Con base en la cantidad de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el campo del retículo, se calcula la concentración de células por unidad de volumen de la muestra líquida inicial. La fórmula de valoración del número de células (válida universalmente) es la siguiente: Partículas por mL=(partículas contadas) / (superficie contada (mm²) x profundidad de la cámara(mm) x dilución). (Castillo, 2004). 3
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Figura 1. Representación de la cuadricula de la cámara de Neubauer con el ocular de 10x y 40x En el reticulo central, la camara de Neubauer posee un cuadrado primario que contiene nueve cuadrados secundarios cada uno de ellos divididos a su vez en 16 cuadrados terciarios, el cuadrado central contiene 25 cuadrados, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. En los bordes de este cuadrado central se cuentan los hematíes, utilizando sólo los cuadrados de los bordes del terciario central y uno de los centrales (Aquiahuati, 2004)
IV. MATERIALES Y METODOLOGÍA Materiales -
Pipetas
-
Lámina cubreobjetos
-
Levadura instantánea para panificación
-
Agua destilada
-
Vaso de precipitación.
Equipos -
Microscopio
-
Cámara de Neubauer.
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Metodología -
Preparar una suspensión de levaduras con agua destilada y homogeneizar perfectamente la muestra.
-
Con una pipeta llena llenar la cámara de Neubauer con la suspensión de levaduras y cubrirla con el cubreobjetos.
-
tomar inmediatamente una muestra con una pipeta Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultará la evaluación precisa de la población microbiana
-
Observar al microscopio utilizando el aumento conveniente de acuerdo al tamaño de la estructura (40x es un aumento adecuado).
-
Contar las células presentes en los cuadros elegidos (generalmente se cuentan en los cuadrados de los cuatro ángulos y el centro, o en forma diagonal empezando por el primero de la parte superior izquierda. También se deben contar las levaduras que están ubicadas tocando la primera de las tres líneas que se encuentran circundando el cuadro, las que se encuentran en laparte superior y la derecha del cuadrado. Se cuentan en total 10 cuadrados, cinco en cada cámara).
Figura 2. Representación de las cuadrículas de la cámara de Neubauer en el ocular 10x.
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V. RESULTADOS Y DISCUSIONES Los resultados del recuento de células de levadura se observan en la tabla 1.
Tabla 1. Número de células de levaduras contabilizadas. Cuadriculas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 SUMAS
Cuadrados I
II
III
IV
V
3 6 3 6 6 8 5 10 6 8 8 7 8 7 5 3 99
8 5 4 4 7 2 5 7 7 6 5 4 8 5 8 6 91
7 6 8 6 4 6 5 12 6 6 8 9 8 4 9 11 115
3 5 6 3 4 4 10 8 5 4 12 3 3 7 3 4 84
6 10 4 3 7 5 5 5 4 4 6 3 5 6 7 7 87
Tabla 2. Promedio y Coeficiente de Variabilidad del conteo de levaduras. Promedio
95,2
Desviación Estándar
12,4
Coef. Variabilidad
13,04
En la tabla 2. Podemos observar que el coeficiente de variabilidad es 13% aproximadamente; esto nos indica el grado de variabilidad o dispersión que existe entre los datos. Según Nuñez (1992) si CV es menor o igual que 20% se dice que el promedio es representativo, o que los datos son homogéneos y si el CV es mayor al 20%, el promedio no es representativo de los datos, o los mismos no son homogéneos, es por ello que afirmamos que los datos son homogéneos y el método de recuento en microscopio utilizando la cámara de Neubauer es adecuado para la determinación de biomas. 6
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Cálculo de las levaduras / mL:
Según Hernández (2002) Es importante determinar al mosto la concentración de células para que luego se dosifique la cantidad especifica para alcanzar una concentración en el rango de (1,5 a 2,0) x 107cel/mL de mosto. Por lo que la concentración halla se próximo al rango. (Muñoz, 2007)El conteo en la cámara deNeubauer debe efectuar en los 25 cuadrantes de la cámara, hasta obtener un número de 300 células con el fin de tener una confianza del conteo del 90%. Es importante contar en total en total 10 cuadrados, cinco en cada cámara, es decir de la cámara de arriba y la de abajo (Aquiahuati, 2004) sin embargo en la práctica realizada solo se contaron 5 cuadrados por lo que el porcentaje de error se incrementará.
VI. CONCLUSIONES Se determinó la biomasa presente en una solución de levadura y expresó en unidades de células/ml obteniéndose un resultado de 2,4 x 107Cel/mL con un promedio de 95, 2 células por cada cuadro de 0,2mm x 0,2mm y un coeficiente de variabilidad de 13% aproximadamente.
VII.RECOMENDACIONES Realizando el recuento en cámara de Neubauer se observan tanto los microorganismos viables como los no viables, además una inadecuada distribución de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores. Es por ello que se recomienda otros métodos para determinar la biomasa como es el método de peso 7
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húmedo y peso seco, también se puede realizar contaje de placas, método del número más probable, filtros de membrana entre otros. Para realizar un recuento en cámara de Neubauer se recomienda agitar bien la dilución con el fin de tener una muestra más homogénea y al momento de colocar la muestra sobre la cámara tener la precaución para no derramarla sobre la placa cubreobjetos de tal manera que el conteo sea el adecuado.
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ames, T., & Cañedo, V. (2004). Manual de Laboratorio para el manejo de hongos entomopatógenos. Lima: Centro Internacional de la Papa. Aquiahuati, M. (2004). Manual de prácticas: Laboratorio de microbiologia celular. México: Universidad Autónoma Metropolitana. Castillo, G. (2004). Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas. Mexico: IMTA. Franson, M. (1992). Metodos Normalizados para el análisis de aguas potables y residuales. Madrid: Ediciones Díaz de Santos. Hernández, A. (2002). Microbiología Industrial. Costa Rica: Editorial EUNED. Muñoz, A. (2007). Microbiología. Madrid: Editorial Paraninfo. Nuñéz, A. (1992). Estadística Basíca para planificación. Madrid: Siglo XXI Editores. Palma, G. (2001). Biotecnología de la Reproducción. Machala: Universidad Tecnológica de Machala. Rodriguez, E. (2005). Bacteriología General: Principios y Prácticas de laboratorio. Costa Rica: Editorial Universidad de Costa Rica. Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Introducción a la Microbiología. Buenos Aires: Ed. Medica Panamericana.
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ANEXOS
Anexo 1. Levadura en pasta utilizado para determinar la biomasa
Anexo 2. Dilución de la levadura y homogeneización de la muestra.
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Anexo 3. Cámara de Neubauer instalado en el microscopio para su observación
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