USO DE LA CÁMARA NEUBAUER I.
INTRODUCCIÓN La cámara de Neubauer es un instrumento utilizado en medicina y biologia para realizar el recuento de células en un medio liquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, liquido sinovial, liquido cefalo cefalorr rraqu aquide ideo, o, etc, etc, por lo cual cual el alumn alumno o deberá deberá desar desarro rolla llarr la habi habilid lidad ad de enfo enfoca carr
de form forma a corr correc ecta ta la cama camara ra de Neub Neubau auer er..
Esta cámara de contaje está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. e trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las cuales se ha marcado marcado con la ayuda de un diamante una cuadr!cula de dimensiones conocidas. e cubre la cámara con un cubrecámaras que se adhiere por simple tensi"n super#cial. Luego se introduce el l!quido a contar, al que generalmente se ha sometido a una diluci"n previa con un diluyente, por capilaridad entre entre la cámara y el cubrecámara$ cubrecámara$ puesto que tiene dos zonas esto permite hacer hacer dos recue recuento ntos s simult simultan aneam eament ente. e. %ara conta contarr las célula células s se obser observa va el ret!c ret!culo ulo al micro microsco scopio pio con el aument aumento o adecua adecuado do y se cuentan las celulas. &on base en la cantidad de células contadas, conociendo el volumen de l!qu !quido que admite el campo del ret!culo, lo, se calc calcu ula la concentraci"n concentraci"n de células por unidad de volumen de la muestra l!quida inicial.
II.
OBJETIVOS
'pr 'prende enderr a util utiliz izar ar la cáma cámara ra Neub Neubau auer er , y simi simila larres para para el recuento de levaduras.
III. III.
(ealizar el recuento de )icroorganismos
&onocer el funcionamiento general de la cámara neubauer.
FUNDA FUNDAME MENTO NTO TEÓRIC TEÓRICO O
*+-E&NL+' /E 'L+E)N-0 +N. N+' %)'(E/'
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III.1. DEFINICIÓN DEFINICIÓN La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio microscopio de campo claro o al de contraste de fases. e trata de un portaobjetos con una depresi"n en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadr!cula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 2 3 2 mm, con una separaci"n entre dos lineas consecutivas de 4.56 mm. 's! pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresi"n central del cubreobjetos está hundida 4.1 mm respecto a la super#cie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos cubreobjetos éste dista de la super#cie marc marcada ada 4.1 mil!me mil!metr tro, o, y el volum volumen en compr comprend endido ido entre entre la super#cie L y el cubreobjetos es de 4.1 mil!metro c7bico, es decir 4.1 microlitro. El cálculo de la concentraci"n de células se puede e3presar as!0 %art!culas 8 9l : ;part!culas contadas< 8 = ;superficie contada ;mm>
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grabadas dos cuadr!culas de recuento, que están separadas una de otra por por una ranura. El fondo de la cámara cámara del campo central es de 4,1 mm más bajo esto es la profundidad de la cámara.
III.2. CARACTERISTICAS CARACTERISTICAS En
la
&ámara
de
Neubauer
trad tradic icio iona nal, l, está está divi dividid dido o en 1A cuadra cuadrados dos media medianos nos y cada cada uno de ellos se halla dividido a su vez en 56 cuadra cuadrados dos pequeB pequeBos os ;C44 ;C44 cuad cuadra rado dos s
pequ pequeB eBos os
en
tota total< l<..
'demás la 7ltima #la y la 7ltima columna columna de cuadrados cuadrados pequeBos pequeBos está dividiDda al medio. En
cambio,
en
la
cámara
de
Neubauer modi#cada el cuadrado grande central está dividido en 56 cuadrados medianos y cada uno de ellos ellos está está dividi dividido do en 1A cuadra cuadrados dos pequeB pequeBos os ;C44 ;C44 cuad cuadra rado dos s pequ pequeB eBos os en tota total< l<.. &ual &ualqu quie iera ra sea sea la cáma cámara ra empleada, este cuadrado grande central es el empleado en el recuento eritrocitario y plaquetario.
III.3. RECUENTO CELULAR CELULAR %ara realizar el recuento celular, debe colocarse el cubreobjetos sobre el portaobjetos de esta cámara e introducir entre ambos la muestra celular previamente preparada. /ebe evitarse que la muestra rebalse, porque si esto sucede las células a contar también se perderán. La velocidad de llenado de la cámara debe ser homogéneo, evitando as! una mala distribuci"n de las célula células s en el prepa prepara rado do que traer traerá á apar apareja ejado do erro errorres en el recuento. La muestra no debe secarse, por lo tanto es recomendable guardar la cámara de Neubauer cargada dentro de una cámara h7meda para que sedimenten las células. Luego se coloca la *+-E&NL+' /E 'L+E)N-0 +N. N+' %)'(E/'
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cáma cámara ra en un micr micros osco copio pio "pti "ptico co y se proc proced ede e al cont conteo eo,, eligiendo para ello los cuadrados apropiados. apropiados. e debe elegir un criterio para de#nir qué células se cuentan y cuáles no, cuando las mismas quedan sobre uno de los bordes del cuadrado. na vez contadas las células se calcula la concentraci"n en la muestra original, considerando0 considerando0 la diluci"n de la muestra hecha para el sembrado, la cantidad de cuadrados considerados, el n7mero de células contadas y el volumen de muestra debajo de cada cuadrado.
IV. IV.
MATE MATERIA RIALE LES S Y MÉTOD MÉTODOS OS
V.
*ata de laboratorio.
uantes de late3.
)icroscopio compuesto o fotonico.
&ámara de Neubauer.
PROC PROCED EDIM IME ENTO NTO
%reparaci"n de la muestra0 Lavar la cámara y el cubre con agua destilada y alcohol de FAG. ecar bien con papel suave. %oner el cubreobjetos encima de la cámara.
*+-E&NL+' /E 'L+E)N-0 +N. N+' %)'(E/'
C
Homoge Homogeniz nizar ar remo removie viendo ndo bien bien el cultivo cultivo en donde donde reside residen n las levaduras. -omar -omar con con pipeta una muestra. muestra. %oner la punta de la pipeta en una de las dos ranuras de la cámara y por capilaridad, las levaduras se distribuirán en la cámara. i se crea una cámara de aire repetir la operaci"n desde el principio. Iijar la cámara de recuento en la platina del microscopio para realizar la observaci"n microsc"pica. Esperar unos minutos antes de contar para que las levaduras se depositen en la cámara. %reparativos del microscopio0 El enfoq enfoque ue del micro microsco scopio pio se empie empieza za con con el objeti objetivo vo de menor menor aumento que posteriorm posteriormente ente pasaremos pasaremos a uno de más. más. e centra el objetivo del microscopio a ojo en el centro te"rico de la cruz de la cáma cámara ra,, lueg luego o se colo coloca ca el obje objeti tivo vo lo más más cer cerca posi posibl ble e del del cubreobjetos cubreobjetos pero sin tocarlo y posteriormente se irá alejándolo hasta que la imagen sea sea la más clara clara y n!tida posible. posible. e aconseja trabajar a C44 aumentos. %ara contabilizar las levaduras totales se aconseja siempre hacer la media de levaduras contenidas en varios grupos de cuadros. Las cámaras tienen C44 cuadrados 7tiles.
%reparaci"n de muestras
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Esterilizar los materiales
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,bservaci"n en microscopio VI. VI.
&ontabilizar las muestras
CONC CONCL LUSIO USIONE NES S
El conteo en cámara es efectivo, siempre y cuando se realice con una muestra, para no realizar este conteo con muchas muestras de concentraci"n desconocida podemos valernos de una curva patr"n, leyendo muestras ya contabilizadas en un espectrofot"metro, espectrofot"metro, as! al leer 'bs. /e una mezcla podemos determinar la concentraci"n por interpolaci"n en la curva patr"n.
'l obtener diferentes muestras en relaci"n al tiempo con las que cons constr trui uimo mos s la curv curva a patr patr"n "n tamb tambié ién n calc calcul ular ar la velo veloci cida dad d de reproducci"n y as! utilizar los )..en procesos estandarizados.
Iactores como la homogenizaci"n de y 8o de la muestra o azul tripán tripán,, resuspe esuspensi nsi"n "n de la muestr muestra, a, e3act e3actitu itud d y presi presi"n "n de los vol7 vol7me mene nes s toma tomado dos s por por las las micr microp opip ipet etas as,, y la dest destrreza eza de la persona para contar las células pueden afectan los resultados, por lo que que son son muy muy impo import rtan ante tes s esto estos s aspe aspect ctos os,, para para obte obtene nerr resul resulta tados dos con#a con#able bles. s. e consid consider er" " que los facto factorres anter anterior iores es fueron controlados controlados adecuadamente dentro de lo l o posible ;calibraci"n dudosa de las micropipetas< pero lo resultados están dentro de un rango aceptable.
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A
VII. VII.
BIBLI BIBLIOGR OGRAF AFIA IA 1. -ecni ecnica cas s y métod étodos os de labo labora rato tori rio o cl!n cl!nic ico o. aon aonza zale les s de *uitrago J. 544C egunda edici"n. Ediciones )asson. *arcelona, EspaBa. parte +++, pag.5KD5KF 5. 'natomia 'natomia patol" patol"gica. gica. teves teves ', LoMe LoMe J. 5441 segunda segunda edici"n edici"n al espaB espaBol. ol. Edicio Edicione nes s Harcou Harcourt rt,, )adri )adrid d EspaBa EspaBa.. &apit &apitulo ulo 16, 16, enfermedades de los ganglios linfáticos, %ag 214D211.
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