DETECCIÓN DE S almonella 1. INTRODUCCIÓN El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae, integrada por bacilos Gram negativos anaerobios facultativos. Poseen, por lo tanto, las características generales de las enterobacterias: son fermentadores de la glucosa, catalasa positiva, oxidasas negativo, reducen nitratos a nitritos y suelen ser móviles; representa una excepción Salmonella gallinarum y Salmonella pullorum, siempre inmóvil. La Salmonella es una bacteria que puede causar una infección gastrointestinal conocida como salmonelosis. Esta infección puede ocurrir en los humanos y animales. Son viables en diferentes condiciones ambientales sobreviven a la refrigeración y congelación, mueren por calentamiento (mayor a los 70°C). La mayoría de las personas infectadas dura entre cuatro a siete días. La persona puede enfermar lo suficiente como para requerir hospitalización. Las complicaciones graves y la muerte son raras, y más probablemente suceden en las personas muy jóvenes, muy viejas y en las que tienen otros problemas de salud. La Salmonella debería ser considerada como potencialmente patógena para el hombre. La única vía de entrada de estos microorganismos en el cuerpo humano es la oral, por lo que es de suma importancia el análisis de los alimentos para detectar su presencia.
2. FUNDAMENTO i.
Enriquecimiento no selectivo: se utiliza cuando se cree que un tratamiento (deshidratación, irradiación o congelación), o ciertas condiciones (bajo pH), hayan lesionado las salmonelas en los alimentos.
ii.
Enriquecimiento selectivo: estimula la multiplicación de las salmonelas y reduce o inhibe el crecimiento de los organismos competitivos, tales como los coliformes, Proteus y Pseudomonas, cuyo crecimiento superaría al de las salmonelas. La Comisión recomienda el uso de caldo selenito-cistina y de caldo tetrationato
verde brillante, ambos incubados a 43°C. El caldo tetrationato junto con el tiosulfato inhibe los coliformes mientras que las bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella y Proteus pueden crecer sin dificultad. Las sales biliares inhiben a todos los M’os
intestinales acompañantes y el verde brillante inhibe la flora Gram positiva.
iii.
Siembra en Medios Selectivos y Diferenciales: Agar MacConkey: es un medio selectivo y diferencial para aislar M’os fermentadores y no fermentadores, de baja selectividad para
usar con inóculos pequeños. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben M’os Gram positivos. La presencia de lactosa permite el
desarrollo de las cepas lac (+), que se manifiesta por el viraje del indicador debido a la producción de ácido, luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia y un halo por la precipitación de las sales biliares por acidez del medio. Las bacterias no fermentadoras de lactosa ( Salmonella Typhi , S. Paratyphi , Shigella dysenteriae), no alteran el medio, dando
colonias incoloras y transparentes.
Agar SS ( S almonella-S hig ella): es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y
animales, sirve para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La presencia de verde brillante a alta concentración de tiosulfato y el citrato inhiben la flora acompañada. Los que fermentan lactosa producen ácido que en presencia del r ojo neutro
propicia colonias de color rojo, los que no fermentan lactosa forman colonias incoloras El Tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formación de sulfuro de hierro. La degradación de la lactosa a ácido provoca el viraje del indicador rojo neutro a rojo.
iv.
Pruebas Bioquímicas Agar Triple Azúcar Hierro (TSI): es un medio diferencial, compuesto de tres azúcares: Glucosa, lactosa y sacarosa. El color original de este medio es rojo ladrillo. El hierro es el indicador para poner en evidencia la producción de hidrogeno sulfurado (H 2S), la producción de H 2S se manifiesta por color negro en el medio se simboliza de acuerdo a la intensidad de 1 + á 4 +.La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio o por lo que el medio se elevada, se simboliza según su intensidad de 1 + á 4 +. La acidez se pone de manifiesto por su cambio al color amarillo, se simboliza con la letra A. La alcalinidad en este medio se manifiesta por su cambio al color grosella, se simboliza con la letra K. El ataque de glucosa se manifiesta por la alcalinidad en la parte inclinada (K) y acidez en el fondo (A), se simboliza K/A. El ataque de lactosa y/o sacarosa se manifiesta por el cambio total del medio al color amarillo, se simboliza A/A. Los M’os que no atacan ninguno de los azúcares, el color del medio, a pesar del crecimiento bacteriano, es casi igual y se simboliza N/N.
Agar Lisina Hierro (LIA): Puede utilizar la lisina del medio LIA, por los mecanismos de descarboxilación, desaminación o bien ser negativos frente a este aminoácido. Para diferenciar estas reacciones el medio tiene en su composición glucosa y el indicador azul de bromocresol. El color original del medio es ligeramente azulado. La descarboxilación de la lisina produce alcalinidad en todo el medio, por lo que tanto, el color azulado se intensifica, se simboliza K/K y se considera como Lisina Positiva. La desaminación empieza en la parte inclinada variando esta porción al color rojo ladrillo, el fondo se tornará amarillo y se interpreta como Lisina Negativa, se simbolizará R/A. Si no se produjera ninguna de las dos reacciones descarboxilación o desaminación el
medio LIA se observará azulado en la parte inclinada y amarillo en el fondo por fermentación de la glucosa, se simbolizará K/A puede presentarse amarillo en su totalidad, es A/A. Estas dos lecturas se interpretan como Lisina Negativa. Si no ha variado el color del medio, a pesar del crecimiento bacteriano, se simbolizará N/N. Se presenta por la acidez, producto del ataque a la glucosa, se neutraliza por la alcalinidad producida por la decarboxilación o bien por que el gérmen ha sido incapaz de utilizar la glucosa. Por lo tanto no corresponderán a la familia Enterobacteriaceae.
3. OBJETIVO
Realizar la detección de Salmonella sp. en una muestra determinada (Huevos crudos) y hacer la confirmación con las pruebas bioquímicas.
4. MATERIALES Y MÉTODO 4.1 MATERIALES 4.1.1 MATERIAL
Matraz de 250 y 500ml Tubos de ensayo
Placas Petri de 100 x 15 mm.
Pipetas de 1 ml.
Aguja y Asa de Kolle
Espátula
Papel Kraft
4.1.2 EQUIPOS
Estufa a 35 – 37°C.
Balanza.
Cocina eléctrica.
4.1.3 MEDIOS DE CULTIVO
Agua Peptonada Tamponada.
Caldo tetrationato sin distribuir y en tubos con 10 ml.
Agar SS
Agar MacConkey
Agar triple azúcar hierro (TSI) inclinado.
Agar lisina hierro inclinado (LIA).
4.2 MÉTODO
4.2.1 AISLAMIENTO DE SALMONELAS Esta parte incluye tres etapas fundamentales:
a) ENRIQUECIMIENTO PREVIO DE SALMONELAS (FDA, 2 007) Cuadro N° 01: Métodos de enriquecimiento previo para salmonelas. Producto
Caldo de preenriquecimiento
Huevos completos desecados, yemas Caldo lactosa o agua de peptona de huevo desecadas, clara de huevo tamponada. desecadas,
huevos
líquidos
pasterizados y congelados, mezclas preparadas en polvo, galletas, fórmula para niños, huevos crudos, carnes crudas, pasta conteniendo huevo, tintes y sustancias colorantes. Levadura desecada (inactivada)
Agua destilada
Leche en polvo descremada y leche Agua destilada con 2 ml de solución al en polvo entera
1% de verde brillante por litro.
Caramelos y bombones
Leche en polvo reconstituida con verde brillante
Sub
productos
grasos
animales Caldo lactosa con 1% de Tergitol o
fundidos, coco.
agua de peptona tamponada con 0.22% de Tergitol.
Fuente: ICMSF, 2000.
Preparación de Muestra: Huevo entero Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un recipiente estéril de boca ancha o en otro recipiente apropiado y agregar 225 ml de Agua Peptona Tamponada. Agitar suavemente hasta disolución sin grumos. Dejar 60 minutos + 5 minutos a temperatura ambiente, incubar 24 h + 2 h a 35°C.
b) ENRIQUECIMIENTO
SELECTIVO
DE
SALOMONELLAS (ICMSF, 2 000) Pasar 1 ml del cultivo de preenriquecimiento a 10 ml. de caldo Tetrationato verde brillante. Incúbese a 43 + 0.05°C durante 24 horas.
c) SIEMBRA EN PLACA EN MEDIO DE AGAR SELECTIVO PARA SALMONELAS (ICMSF, 2 000) Pasar una asada del medio de enriquecimiento selectivo a la superficie de una placa de cada uno de los dos medios de agar selectivo (Agar SS Y Agar MacConkey) y extender de tal manera que se obtengan colonias aisladas. Incubar las placas de Agar SS durante 24 horas a 3537 °C. Las colonias típicas de Salmonella son incoloras y en el medio se evidencia un color oscuro evidenciando el sulfuro. Incubar las placas de agar MacConkey a 35-37°C durante 48 horas. Las colonias típicas de Salmonella son incoloras, transparente.
4.2.2 EXPLORACION
BIOQUÍMICA
PARA
LA
IDENTIFICACIÓN DE SALMONELAS (FDA, 2 007)
TSI y LIA: Picar suavemente el centro de la colonia con aguja de inoculación e inocular el TSI por punción en el fondo y estriar el pico de flauta. Sin flamear inocular el LIA por punción en el fondo 2 veces y estriar el pico de flauta. Como la reacción de la lisina decarboxilasa es estrictamente anaeróbica, el LIA debe tener un fondo profundo (4cm). Guardar las placas a 5°C – 8°C. Incubar el TSI y LIA a 35°C durante 24 h + 2 h. Tapar los tubos sin apretar para mantener condiciones de aerobiosis y prevenir la excesiva producción de H 2S.
LECTURA DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
TSI: Diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.
COLOR: Amarillo-Naranja (fondo ácido) y Rojo (pico de flauta alcalino).
INDICADOR: ROJO DE FENOL
SUSTRATO: AGAR
Salmonella spp. : K/A
H2S
GAS (+)
(+)
LIA: Especialmente Salmonella spp., basado en la descarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico
COLOR: Purpura (fondo alcalino)
INDICADOR:
PURPURA
DE
BROMOCRESOL
SUSTRATO: AGAR
Salmonella spp.: K/K
H2S: (+)
GAS: (-)
Descartar como no Salmonella los cultivos que dan fondo ácidos en LIA y pico de flauta y fondo ácidos en TSI.
Cuadro N°02: Interpretación para otras pruebas Bioquímicas y serológicas Resultado para Resultado
Prueba
(a)
Glucosa (TSI) Lisina
decarboxilasa
(LIA) H2S (TSI y LIA) Ureasa Caldo
lisina
decarboxilasa Caldo
dulcitol
rojo
fenol Caldo KCN Caldo malonato Indol Antisuero polivalente flagelar Antisuero polivalente somático Caldo
lactosa
S almonella s pp
rojo
fenol Caldo sucrosa rojo fenol Voges Proskauer Rojo de metilo Citrato de Simmons Fuente: FDA, 2 007
Positivo
Negativo
fondo amarillo
fondo rojo
(+)
fondo violeta
fondo amarillo
(+)
ennegrecimiento
sin ennegrecimiento
(+)
rojo- violeta
sin cambio de color
(-)
violeta
amarillo
(+)
amarillo y/o gas
sin gas y sin cambio de color
(+) (b)
crecimiento
sin crecimiento
(-)
azul
sin cambio de color
(-) (c)
color rojo fuerte en
color amarillo en la
la superficie
superficie
aglutinación
sin aglutinación
(+)
aglutinación
sin aglutinación
(+)
amarillo y/o gas amarillo y/o gas
sin gas y sin cambio de color sin gas y sin cambio de color
(-)
(-) (c) (-)
rosa a rojo
sin cambio de color
(-)
rojo
amarillo
(+)
crecimiento, azul
sin crecimiento, sin cambio de color
V
(a) (+): 90% o más positivo en 1 o 2 días, (-): 90% o más negativo en 1 o 2 días, V: variable (b) La mayoría de las S. arizonae son negativas (c) La mayoría de las S. arizonae son positivas
ESQUEMA DEL PROTOCOLO 1. ENRIQUECIMIENTO PREVIO DE SALMONELAS
DIA 1
25 g de muestra
Agua Peptonada Tamponada 225ml
Incubar a 35-37ºC, 18-24 horas
2. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO DE SALMONELAS
1 ml del cultivo preenriquecido en 10 ml de…
Caldo Selenito cistina
DIA 2
Caldo Tetrationato verde brillante
Incúbese a 43 + 0.05 °C / 24 h
Agar SS Colonias típicas de Salmonelas son incoloras y en el medio se evidencia un color oscuro evidenciando sulfuro.
DIA 3
Agar MacConkey Colonias típicas de Salmonelas son amarillas
5. EXPRESIÓN DE RESULTADOS De acuerdo a los resultados de la interpretación indicar presencia o ausencia de Salmonella spp. en la cantidad de muestra analizada (por gramos o mililitros para muestras líquidas).
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ICMSF. (2000). Microorganismos de los Alimentos 1. Su significado y métodos de enumeración. Zaragoza (España): ACRIBIA S.A. Bacteriological Analytical Manual. Chaper 5, Salmonella. December 2007.Edition. FDA U.S. Food and Drug Administration.
