Pesquisa Laboratorial do Mestrado- Técnica Câmara de Neubauer – Valdomiro Nery Gonçalves - 31/08/2011
Câmara de Neubauer – Contagem de células microbianas – Determinação da Concentração de células 1. Introdução a Câmara de Neubauer 1.1. Quando se trabalha com microorganismos, na maioria das vezes deseja se determinar a concentração de células da suspensão preparada. 1.2. Uma das formas mais comuns de se obter esta estimativa é através da contagem ao microscópio, utilizando-se uma Câmara de Neubauer, também conhecida como Hemacitômetro ou Câmara de Contagem. 1.3. A Câmara de Neubauer é uma lâmina grossa de uso microscópico, com formato retangular e normalmente de vidro, com uma depressão no centro, utilizada para fazer contagem de células por unidade de volume de uma suspensão. 1.4. Na UP há dois modelos de Câmara de Neubauer, uma com a superfície da câmara espelhada e a outra não espelhada veja fotos abaixo.
Neubauer com Câmara espelhada
Neubauer com Câmara não espelhada
1.5. A Câmara de Neubauer é constituída de duas câmaras, ao centro, uma embaixo da outra, sobre as quais é colocada a lamínula para a leitura no microscópio. Câmara Inferior
Câmara Superior
1.6. No centro destas câmaras há várias linhas perpendiculares com marcações em quadrantes. Observando-se ao microscópio, percebe-se que existem três tipos de quadrantes denominados A, B e C, de medidas conhecidas, que juntos formam um quadrado maior. 1.7. Estes quadrantes são usados para fazer as contagens e assim determinar a concentração de células em um determinado volume de fluido, para poder calcular a concentração de células no líquido global (do qual foi tirado à amostra analisada).
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1.8. Pode-se notar que estes quadrantes têm sub-divisões diferentes, fazendo com que o critério para escolha do quadrante onde serão contadas as células, seja o tamanho destas a serem quantificados. Assim, usualmente, células muito pequenas são contados no quadrante C, as de tamanho intermediário no quadrante B, enquanto células grandes são contadas no quadrante A (que é o caso das leveduras). 1.9. A área total compreendida pelos 9 quadrantes é de 9 mm2 sendo que cada quadrante (A, B e C) são quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a lamínula (especial para ser usada na câmara de Neubauer, estas são mais grossas que as comuns) a distância da lamínula até a lâmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obter um volume de 0,1 mm3 em cada quadrante. 1.10. A precisão da contagem manual utilizando este método depende basicamente:
da mistura correta da amostra, para que a concentração esteja homogênea e que não se formem bolhas; do número de câmaras (quadrantes) contadas; do número de células contadas, onde a concentração viável é de 200 a 500 por 0,1 mm3.
2. Contagem de células e determinação da concentração celular com a Câmara de Neubauer 2.1. Material
Câmara de Neubauer e lamínula Microscópio Ótico Agitador vortex Tubos de eppendorf Estante para tubos de eppendorf Micropipetas de 100 a 1000 µL (duas), uma para coletar amostra e outra para água Micropipeta de 100 µL* para carregar a câmara de Neubauer Ponteiras para os dois tipos de pipetas Piscete com água destilada para as diluições e para limpar a câmara de Neubauer Piscete com álcool 70 % para limpar a câmara de Neubauer Papel macio para limpar/enxugar a câmara de Neubauer e a lamínula Becker de 250 mL para conter água destilada a ser usada nas diluições Becker de 500 mL para colocar os eppendorf e ponteiras de pipeta usadas Becker de 500 mL para conter o álcool e água utilizados na limpeza da câmara e lamínula de Neubauer
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Obs.: A pipeta de 100 µL é uma pipeta alaranjada que facilita muito o carregamento da Câmara de Neubauer. Com as outras pipetas fica mais difícil carregar a câmara. Também se pode utilizar as pipetas de 50 µL que tem o corpo cinza e a ponta e o botão acionador 2
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amarelos. Estas pipetas ficam dentro de uma gaveta identificada com o nome “pipetas”, na sala das autoclaves, no lado esquerdo da estufa de esterilização de vidrarias, última gaveta. 2.2. Método 2.2.1. Preparo da bancada de trabalho 2.2.1.1. Cortar mais ou menos 1 metro de papel Kraft (papel marrom em rolo que esta preso a um suporte de corte), coloca-lo esticado sobre a bancada de laboratório onde se vai trabalhar e organizar sobre o mesmo todos os materiais acima listados.
2.2.2. Preparo da câmara de Neubauer 2.2.2.1. Toma-se a câmara de Neubauer lava-se com jatos de água do piscete, depois lava-se com jatos de álcool 70 % e em seguida seca-se com o papel macio tomando cuidado para deixar bem seco e não grudar nenhum fiapo de papel na câmara. Faz-se o mesmo procedimento com a lamínula. Observação importante: Sempre deve-se lavar a câmara e a lamínula após cada leitura, para se efetuar novas leituras ou quando for guardá-las. 2.2.2.2. Depois se toma a câmara de Neubauer e passa-se saliva com o dedo nas duas laterais das câmaras para facilitar a fixação da lamínula. Em seguida deve-se fixar a lamínula sobre a câmara de Neubauer, conforme desenho abaixo, pressionando levemente com os polegares a lamínula (tomando cuidado para não tocar na parte que cobre a câmaras para não prejudicar a leitura devido as digitais) fazendo pequenos movimentos para cima e para baixo até sua fixação. Obs: Para se certificar que a lamínula esta devidamente fixada na câmara, inclina-se esta deixando-a verticalmente alinhada a bancada de trabalho; se não cair é porque esta bem fixa. Laterais das câmaras
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2.2.3. Colocação da amostra para contagem na Câmara de Neubauer 2.2.3.1. Com uma micropipeta de 100 ou 50 µL, coleta-se a amostra a ser analisada e deposita-se cuidadosamente entre a câmara e a lamínula tomando cuidado para preencher totalmente o volume da camara mas sem deixar vazar e/ou cair amostra sobre a lamínula. Para tanto deve-se aproximar a pipeta da câmara, com uma gota na ponta, sem encostar na lamínula (veja desenho abaixo) o suficiente para que a amostra seja arrastada por capilaridade.
Obs: Na hora de carregar a pipeta e de colocar a amostra deve-se tomar o cuidado para não formar bolhas na pipeta, pois estas afetam o carregamento da câmara.
Veja que se pode carregar tanto na câmara de cima como na câmara de baixo e fazer duas leituras, sempre tomando o cuidado, na hora de colocar a amostra, para não vazar de uma câmara para outra. 2.2.3.2. Após a colocação da amostra na câmara aguarda-se um momento para que haja a sedimentação das células e procede-se a contagem ao microscópio. Geralmente é mais fácil de visualizar as leveduras com a objetiva de 40 X.
Obs: Caso seja necessário, pode-se melhorar a visualização das células utilizando algumas gotas de corantes como o cristal violeta ou azul de metileno na água a ser utilizada na diluição da amostra em análise. 2.2.3.3. Para leveduras e bactérias, pela prática é melhor escolher para trabalhar os quadrantes “A”, sendo que a contagem é viável, ou seja, a contagem é facilitada quando há de 8 - 20 células em cada um dos 16 quadrados deste quadrante. Quando há mais do que 20 células em cada quadrado fica muito difícil conta-las, sendo então necessário fazer a diluição da amostra. 2.2.4. Diluição da amostra para contagem na Câmara de Neubauer 2.2.4.1. Para efetuar a diluição da amostra primeiramente temos que agitá-la no vortex, para perfeita homogeneização, tomamos 100 μL (0,1 mL) com uma micropipeta, colocamos em um eppendorf e adicionamos 900 μL (0,9 mL) de água destilada (diluição 1:10). 2.2.4.2. Também devemos homogeinizar cuidadosamente esta nova solução no vortex com o eppendorf fechado para não vazar, e procedemos ao carregamento da câmara conforme descrito nos itens 2.2.2 e 2.2.3 e seus sub itens. 2.2.4.3. Caso o número de células por quadrado ainda não esteja dentro da faixa ótima para contagem, procede-se nova diluição, agora tomando 100 μL (0,1 mL) do eppendorf diluído, após homogeneização do mesmo no vortex, e colocando em outro eppendorf com a adição de 0,9 mL (900 μL) de água (agora efetuamos uma diluição 1:100). E assim fazemos sucessivamente até que seja viável a contagem das células.
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2.2.5. Leitura e Determinação da concentração de células na Câmara de Neubauer 2.2.5.1. Vimos que para leveduras é aconselhável utilizar os quadrantes “A” da câmara de Neubauer. Vimos que existem 4 quadrantes “A” iguais na câmara e pode-se optar por fazer a contagem em qualquer um deles. Uma maior precisão pode-se obter contando todas as áreas “A” na câmara e depois tira-se a média. 2.2.5.2. É interessante estabelecer uma sequencia de contagem dos quadrados e segui-la sempre para evitar erros. Por exemplo pode-se seguir a sequencia indicada no desenho abaixo.
2.2.5.3. Para fazer a leitura podemos dispor de um desenho de 16 quadrados para ir anotando os números de células lidos em cada um dos 16 quadrados do quadrante “A”. Veja o exemplo abaixo. 9
11
0
7
9
3
8
3
8
3
6
5
5
7
10
1
Total de células nos 16 quadrados é igual a 95.
2.2.5.4. Para calcular a concentração de células fazemos o seguinte raciocínio:
Vimos que o volume de cada quadrante é de 0,1 mm3 ou em 0,0001 cm3 ou mL Logo ao contarmos o número total de células de um quadrante temos quantas células temos em 0,0001 mL ou em 1 x 10-4 mL Assim podemos fazer a seguinte regra de três: Se em 1 x 10-4 mL Em 1 mL
------temos --------teremos- ---
Número de células contadas (C) N células
Multiplicando em cruz temos: N = C x 104 células/mL No caso de termos feito alguma diluição temos que multiplicar pelo fator de diluição: N = C . D x 104 células/mL Assim no nosso exemplo acima onde tivemos 95 células contadas, e supondo que fizemos uma diluição 1:10, temos: N = C . D x 104 = 95. 10 . 104 = 9,5 x 106 células/mL
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