Fecha de entrega: Jueves 22 de Abril de 2015
INSTITUTO TECNOL TECN OLOGIC OGICO O DE TEPIC Practica 9: “Reacciones de oscurecimiento enzimtico!
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Miguel Ángel Rubio Sánchez Ing. Bioqu!ic" Cienci" #e $li!en%o& M.C. Ro&" C"&%'o M"'%nez L"bo'"%o'io #e $náli&i& #e $li!en%o& De("'%"!en%o #e Ingenie'" )u!ic" * Bioqu!ic"
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Índice Introducción Objetivos Material y reactivos Metodología Análisis y resultados Conclusión !ibliogra"ía Cuestionario
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Introducción El pardeamiento enzimático es una reacción de oxidación en la que interviene como substrato el oxígeno molecular, catalizada por un tipo de enzimas que se puede encontrar en prácticamente todos los seres vivos, desde las bacterias al hombre. La enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando se hace referencia a animales, a que en ellos la tirosina es el principal substrato! La polifenoloxidasa, E" #.#$.#%.# tiene dos actividades enzimáticas, una hidroxilando monofenoles &'cresolasa() otra oxidando difenoles a quinonas.El pardeamiento enzimático es un con*unto comple*o de reacciones, que se inicia por la o las reacciones catalizadas de forma enzimática. La primera de ellas, cuando el sustrato presente es un monofenol, es su transformación en difenol. La segunda, la transformación del difenol en quinona.
El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce fundamentalmente mediante la compartimentalización de los sustratos. El enzima se encuentra en los plástidos cloroplastos &en los vegetales superiores), tambi+n en el citoplasma celular, mientras que los compuestos fenólicos que pueden servir de sustratos se acumulan en vesículas. "uando se rompe la compartimentalización por un dao mecánico, como el triturado, corte o congelación descongelación, la reacción de pardeamiento se puede producir. -ambi+n se produce la inhibición del enzima por los productos de la reacción. demás de manteniendo la compartimentalización, la reacción de pardeamiento se puede frenar actuando sobre diferentes factores/
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Evitando el contacto del oxígeno con la superficie de corte 0a*ando al temperatura 1educiendo el p2 3esnaturalizando el enzima 4eneralmente estos factores actúan de forma combinada. sí, el descenso de p2 puede actuar inicialmente reduciendo la actividad del enzima
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Objetivos • • • •
1econocer el pardeamiento enzimático.
Material y reactivos Materia
= "uchillos = ?asos de precipitado =78 ml # 4radilla # -ermómetro #8 "a*as 5etri 7 ?idrios de relo* # 5ipeta de #8 ml # -ripie # >echero # 1e*illa = -ablas para picar #C tubos de ensao
Reactivos
Equipos
>anzana ro*a 4ala Licuadora "atecol al #@ gua destilada Acido cítrico al #@ 7@ "arbonato acido al #@ Acido ascórbico al 7, =.7, #@ Acido clorhídrico Bulfato acido de sodio C,$,=@ 5irogallol al #@ :enol al #@
Metodología ntes de comenzar, preparar el *ugo de manzana
5elar quitar las pepitas con rapidez
5esar 67 gr
2omogenizar con #78 ml de agua destilada durante #89#7 seg
;sar rapidamente
:iltrar con gasa
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$%&eri'ento A( )$l trata'iento de los tejidos de 'an*ana y su e"ecto en la reacción de obscureci'iento+ i.
"ortar #D$ de manzana en = trozos
3esmenuzar uno de los trozos ponerlo en un vidrio de relo* *unto al otro entero
"omparar el oscurecimiento producido
Fbservar el color del interior del troxo de manzaa
2allar cual pardea mas rapidamente
ii,
"uando el trozo entere este marron dividirlo en E partes por rotura por corte. iii,
5oner #8 ml de *ugo de manzana en un tubo de ensao en una ca*a petri
Fbservar en cual se presenta maor oscurecimiento
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$%&eri'ento !( )$l e"ecto del calor en la reacción+ Pone' ,-!l #e .ugo #e !"nz"n" en lo& %ubo& $/B/C/D
C"le%"' el %ubo $ en el !eche'o
0e'1i' #u'"n%e , !in
M"n%ene' el %ubo D " %e!(e'"%u'" "!bien%e
Pone' el %ubo C en un b"2o #e "gu" " ,--4C
Pone' el %ubo B en b"2o #e "gu" " 3-4C
Co!("'"' el g'"#o #e o&cu'eci!ien%o en lo& 5 %ubo&
$l 6n"l he'1i' %'ozo& #e !"nz"n" , !in
E7(one' "l "i'e * ob&e'1"'
$%&eri'ento C( )Investigación de las sustancias de la 'an*ana causantes de la reacción de &ardea'iento+
Pone' 5 %'ozo& #e !"nz"n" en 1"'io& 1i#'io& #e 'elo.
Re!o."' c"#" uno con un" #e l"& &iguien%e& &olucione&8 C"%ecol ,9/ Pi'"g"llo ,9/ :enol ,9 * "gu" #e&%il"#"
Ob&e'1"' lo& %'o7o& * co!("'"' el o&cu'eci!ien%o
$%&eri'ento -( ).ara controlar las reacciones de &ardea'iento en*i'ático, /rata'iento &or calor+ i,
+ M"n%ene' lo& %ubo& en l" ll"!" #u'"%e 3/ ,-/ ,3/ ;-/ <&eg 'e&(ec%i1"!en% e
En='i"' con "gu"
Ob&e'1"' el o&cu'eci!ein%o en c"#" %ubo
$2"#i' " c"#" %ubo , go%" #e C"%ecol , 9
Pone' 5 %'ozo& #e !"nz"n" en "gu" hi'1ien#o #u'"n%e ;-/ <-/ +- * ,>- &eg.
En='i"' con "gu" * co'%"' (o' l" !i%"#
$g'eg"' C"%ecol ,9 en lo& co'%e&
Co!("'"' &"bo' * %e7%u'" con lo& #e l" !"nz"n" ='e&c"
Re(e%i' l" ('ueb" o!i%ien#o l" "#icion #e c"%ecol
Ob&e'1"'
Pone' 3 !l #e .ugo # e !"nz"n" en 3 %ubo& #e en&"*o
ii.
$%&eri'ento $( )$l e"ecto del &0+
Pone' 3 %'ozo& #e !"nz"n" &ob'e 1i#'io& #e 'elo
Re!o"' c"#" uno con un" #e l"& &iguien%e& &olucione&8 $ci#o ci%'ico ,9/ $ci#o ci%'ico -.39/ ?ugo #e li!on/ $gu" * C"'bon"%o "ci#o #e &o#io
De"' 'e(o&"' * co!("'"' el ("'#e"!ien%o
+
$%&eri'ento ( )$"ecto del ácido ascórbico+
Pone' 3 %'ozo& #e !"nz"n" &ob'e 1i#'io #e 'elo
T'"%"' c"&" uno con l"& &iguien%e& &olucione&8 $ci#o "&co'bico 39/ $ci#o "&co'bico >.39/ $ci#o "&co'bico ,9/ "gu" * "ci#o clo'hi#'ico >M
$no%"' el %ie!(o en que un %'ozo &e (ong" !"& !"''on que el %'ozo con "ci#o clo'hi#'ico
$%&eri'ento ( )$"ecto del sul"ito acido de sodio+
To!"' 5 %ubo& #e en&"*o
$g'eg"' un" #e l"& &iguien%e& &olucione&8 , !l #e &ul6%o "ci#o #e &o#io "l <9/ "l 59 * "l >9/ * , !l #e c"'bon"%o "ci#o #e &o#io "l ,>9
$2"#i' " c"#" %ubo 3 !l #e .ugo #e !"nz"n"
$%&eri'ento 0( )$"ecto de las sustancias naturales e%istentes en di"erentes variedades de 'an*ana+
Con&egui' un lo%e con #i=e'en%e& cl"&e& #e !"nz"n"
Co'%"' %'ozo& #e c"#" un"
Co!("'"' el g'"#o #e o&cu'eci!ien%o
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Análisis y resultados Experimento A: “El tratamiento de los tejidos de manzana y su efecto en la reacción de oscurecimiento”
>anzana en proceso de oxidación
En la primera parte de este experimento, la manzana desmenuzada, o en este caso picada &debido a la composición física de esta) se oxido más rápido que la entera debido a que ha más superficie de contacto con el oxígeno, lo que acelera la reacción. Esto se puede apreciar en la imagen superior en el extremo derecho
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La manzana troceada se oxidaba más, que la cortada, debido a que el trozado da lugar a muchas formas irregulares de corte, lo que da cavidad a la acción del oxígeno, en cambio la cortada es un corte más uniforme donde no ha tanta superficie de contacto con el oxígeno por lo que fue menor su pardeamiento. El pardeamiento visible tuvo lugar a los 8min despu+s del corte o trozado El *ugo de la ca*a 5etri fue más oxidado debido a su maor superficie, que la del tubo. Experimento B: “El efecto del calor en la reacción”
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En las imágenes se puede apreciar el momento en que se le dio a cada tubo el tratamiento t+rmico correspondiente especificado en el diagrama de flu*o del experimento
Tub o A B C D
Tratamiento dado.
Observaciones
C"len%@ " l" ll"!" #el !eche'o e hi'1i@ No ('e&en%" c"!bio& con%eni#o ,!in. Colo' cl"'o Pu&o en un b"2o #e "gu" " 3- 4C Colo' un (oco !á& cl"'o que el %ubo B Pu&o en un b"2o #e "gu" " ,-- 4C Mu* in%en&i6c"#o &u colo'/ cie'%o g'"#o M"n%u1o " %e!(e'"%u'" h"bi%"ci@n. #e o7i#"ci@n.
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"omo se puede observar en la tabla el grado de oxidación enzimática va de acuerdo a la temperatura, como en la temperatura de habitación es óptimo para que se lleven las reacciones enzimáticas, el tubo que se hirvió por #min no mostro cambios debido a que el calor desactivo la enzima. 5ara los trozos de manzana que se hirvieron partieron no hubo cambio a que la temperatura fue tanta, que la manzana se coció un poco la enzima no tuvo un sustrato viable en el cual traba*ar.
Experimento : “!nvesti"ación de las sustancias de la manzana causantes de la reacción de pardeamiento”
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En la imagen se pueden apreciar los grados de pardeamiento
La imagen es mu clara se puede observar que la solución de catecol fue un acelerador de la reacción de oxidación , seguida de la de piragallol que obtuvo el segundo puesto en coloración, siguiendo con el fenol que fue poco el cambio pero apreciable, terminamos con el agua obtuvo el último puesto. Experimento #: “$ara controlar las reacciones de pardeamiento enzim%tico& 'ratamiento por calor”
-ubos con *ugo de manzana "atecol despu+s del tratamiento t+rmico
En la imagen superior se aprecian la serie de tubos con "atecol post tratamiento t+rmico se observó más oxidación pero con el mismo principio de más duración del tratamiento igual a menor actividad enzimática.
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>anzanas antes del tratamiento
>anzanas despu+s del tratamiento
En las dos últimas imágenes de las manzanas cortadas se ve el antes el despu+s del tratamiento. nalizando el procedimiento observo que era necesario mas tiempo de tratamiento, a que los trozos de las manzanas estaban mu grandes el calor no llegaba totalmente al centro , por lo que el pardeamiento si pudo se presentarse. los G8seg. de tratamiento fue el tiempo suficiente para detener un poco la reacción, si no se agrega el "atecol a los C8 seg. de tratamiento es suficiente para que no se oxide, como se prueba en las imágenes. Hota/ 2ubo algunos problemas al momento de comparar los trozos que tenían "atecol los que no, es por eso que está un poco desordenada la última imagen. Experimento E: “El efecto del p(”
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5ara este apartado quedó más claro que cuando se acidifica el medio la enzima puede desnaturalizarse Do inhibirles, por lo que no se lleva a cabo su reacción de oxidación. 5ara un me*or entendimiento la eficiencia de las soluciones se evaluó en una escala #9#8. Tub o A B C D E.
Tratamiento
Efciencia anti oxidación 1-5
Áci#o c%'ico "l ,9. Áci#o c%'ico "l -.39. ?ugo #e li!@n $gu" C"'bon"%o áci#o #e &o#io "l ,9
5 A > < ,-
El carbonato acido de calcio de sodio resulto ser el me*or antioxidante de las soluciones propuestas.
>omento en que los antioxidantes actúan sobre las manzanas
Experimento ): “Efecto del %cido ascór*ico”
En la imagen anterior se aprecia el momento en que el ácido ascórbico actúa sobre la manzana
Be puede apreciar en la imagen superior, que como lo dice el manual de prácticas, el ácido ascórbico es un antioxidante natural, pero llega un momento en que el mismo llega a oxidarse de esta manera se inutiliza su reacción. Esto último lo podemos apreciar en los trozos de manzana que se les aplico dicho acido, a que aunque si inhibieron la enzima
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evitando la oxidación, esto fue solo por un tiempo. En todos los tratamientos la enzima fue inhibida menos en el agua que muestra un característico cambio de coloración, a que la acción del ácido inhibe la enzima aun sea al #@. 5or razones obvias no se puede usar un antioxidante como al ácido clorhídrico al =>. por ser tan agresivo aunque sea excelente. Los resultados se muestran en la siguiente tabla/ Tubo A B C D E.
Tratamiento
Resultado
Acido ascórbico al 7@. Acido ascórbico al =.7@. Acido ascórbico al #@ gua Acido "lorhídrico =>.
Experimento +: “Efecto del sulfito acido de sodio”
La imagen muestra los resultados obtenidos
En la siguiente tabla se muestran los resultados del experimento/ Tub o A
Sustancia Agregada
,!l #e Sul6%o áci#o #e &o#io <
Cooración
$!"'illo !u* cl"'o
+
B C D
9 ,!l #e Sul6%o áci#o #e &o#io 59 ,!l #e Sul6%o áci#o #e &o#io >9 ,!l #e c"'bon"%o áci#o #e &o#io "l ,>9
Beige Sin c"!bio C"=
Los sulfitos son los más utilizados en la industria como antioxidantes enzimáticos, al utilizar se observó que a tan ba*as concentraciones como lo fueron al =@ inhibía estas reacciones indeseables. Experimento (: “Efecto de las sustancias naturales existentes en diferentes variedades de manzana”
Lote con variedades de manzanas
3espu+s de realizar tonos los experimentos anteriormente analizado, conocimos las a fondo las características, las propiedades el comportamiento de la manzana al momento de que
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la enzima polifenol oxidasa actúa sobre ella. "ada procedimiento nos mostró las diferentes maneras de inhibir o acelerar los efectos de dicha enzima, como e*emplo de inhibición podemos mencionar que los tratamientos t+rmicos retrasaban la oxidación. l momento de comparar todas estos resultados con los de nuestros compaeros, podemos definir que la oxidación se presenta en menor medida en nuestra manzana &4ala), a que al exponer al ambiente los trozos de las diferentes variedades, la red delicious fue la que se oxido más rápido.
Conclusión La enzima polifenol oxidasa está presente en la maoría de las frutas, para la industria alimentaria el pardeamiento u oxidación enzimática es mu grave aún, a que pierde valor nutricional visual. Es por esto que se utilizan diferentes antioxidantes como lo son los sulfitos, ácidos, o tratamientos t+rmicos para desnaturalizar esta enzima, existen niveles de pardeamiento que van de un beige a un negro lo que es nada a atractivo al ser humano. -ambi+n al agregar ácidos no se puede incrementar mucho su concentración a que degradará proteínas presentes por ser agresivos. El ácido ascórbico es un agente oxidante pero no es mu bueno a que no es mu estable conforme el tiempo pasa por lo que se usa este agente en acción con otros, a que los antioxidantes tambi+n cumplen con el sinergismo. Esta práctica fue larga pero mu interesante, se realizaron muchos experimentos para observar qu+ pasa en diferentes situaciones soluciones.
!ibliogra"ía Balvador 0adui 3ergal $ta edición. "apitulo $.6.7 http/DDmilIsci.unizar.esDbioquimicaDtemasDenzimasDtirosinasa.html "uadernillo de 5rácticas de Laboratorio ciencia de los alimentos.
Cuestionario
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1.- Que es la PFO?
Es la enzima que cataliza la reacción 5olifenol oxidasa. 2.- Cuales son los sustratos del obscurecimiento enim!tico?
>onofenoles ".- Escriba los com#uestos intermediarios $ #roductos %inales
3el monofenol forma difenol despu+s quinonas. &.- E'#li(ue el e%ecto de los !cidos en la in)ibici*n de la PFO
El ácido ascórbico es un antioxidante natural por lo que nos e pardea, pero al pasar el tiempo este se oxida comienza a pardearse. +.- Como act,an los sul%itos?
ctúan como buenos inhibidores enzimáticos.
