PRACTICA Nº9 PARDEAMIENTO ENZIMATICO
I.
II.
OBJETIVOS Observar la influencia de los tejidos vegetales en la producción de pardeamiento enzimático. Determinar el efecto de calor en la reacción de pardeamiento enzimático. Determinar el efecto de la adición de diferentes compuestos en el pardeamiento enzimático.
FUNADAMENTO El pardeamiento enzimático se debe a la presencia de derivados del o-dihidroxifenol, como el catecol, el ácido cafeico, el ácido clorogenico, que están difundidos en los vegetales. Estos compuestos se oxidan en presencia de enzimas (fenolasa, ( fenolasa, polifenolasa, tirosinasa, catecolasa) dando como resultado final pigmentos pardos o melaninas.
III.
MARCO TEORICO El pardeamiento enzimático es una reacción de oxidación en la que interviene el oxígeno molecular y como sustrato compuestos fenólicos, catalizada por un tipo de enzima que se puede encontrar en muchos seres vivos, microorganismos, plantas y animales incluyendo a los humanos. La enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de polifenoloxidasa, fenolasa, fenoloxidasa, catecolasa, cresolasa y tirosinasa. Estas enzimas están relacionadas por tener la misma arquitectura del centro activo con un núcleo de dos cobres. Tienen dos actividades enzimáticas, una hidroxilando monofenoles y o tra oxidando difenoles a quinonas. El pardeamiento enzimático es una transformación, de compuestos fenólicos en polímeros coloreados, frecuentemente pardos o negros. Las fases de su t ransformación son las siguientes:
La primera de ellas, cuando el sustrato presente es un monofenol, es la transformación en difenol. La segunda, consiste en la transformación del difenol en quinona. A partir de la formación de la quinona, la reacción progresa de forma espontánea. Las quinonas se pueden convertir en trifenoles por reacción con el agua, y posteriormente oxidarse a hidroxiquinonas. Todas estas sustancias son muy reactivas, dando lugar a polímeros y reaccionando con otras sustancias presentes en el alimento, especialmente proteínas. Los productos finales, llamados melaninas, son de color pardos muy oscuros, negros o azulados e insolubles en agua. En los animales es comúnmente llamada tirosinasa y una de sus funciones es la de catalizar la formación de pigmentos marrones que dan color a la piel, cabellos y ojos. En los alimentos de origen animal el pardeamiento enzimático no representa un problema. El papel de las fenoloxidasas en las plantas se cree que es la defensa frente a parásitos y patógenos. En el tejido vegetal la enzima y los sustratos fenólicos se hallan separados por estructuras celulares, la primera en cloroplastos y cromoplastos y la segunda en vacuolas o células especializadas por lo que en el tejido intacto no ocurre pardeamiento enzimático. Si éste se altera o daña por golpes, pelado, corte o triturado la enzima y su sustrato se pondrán en contacto permitiendo que ocurra el pardeamiento enzimático. Por lo que éste representa un problema de gran importancia durante el procesamiento y conservación de algunas frutas y hortalizas como preparación de jugos, congelación, deshidratación, etc. ya que genera coloraciones la mayoría de las veces indeseables. Esta reacción enzimática es un factor que afecta la calidad de los mismos, ya que no solo produce importantes cambios en su color sino también en su apariencia; en algunos casos, puede ser deseable, especialmente cuando se requiere una tonalidad oscura, como es el caso de la fermentación del té y maduración de los dátiles. La formación de los productos de esta reacción, pigmentos coloreados, requiere de tres factores: enzimas, sustrato y oxígeno.
3.2) Prevención del pardeamiento enzimático Existen numerosos medios para impedir el pardeamiento enzimático, pero por razones de costo, toxicidad, reglamentación o efectos secundarios desfavorables sobre la c alidad, en la práctica, sólo se utilizan algunos: 3.2.1. Inactivación de enzimas por el calor.
La temperatura óptima de las fenoloxidasas se encuentra en el rango de 30-50ºC pero la estabilidad es alta entre 55-80ºC durante varios minutos. La inactivación por calor es frecuentemente empleada en vegetales que se someterán a cocción antes del consumo. No representa un método apropiado para algunas frutas y hortalizas debido a que se pueden modificar caracteres organolépticos tales como la textura y el flavor. 3.2.2. Inactivación química de la enzima.
El descenso del pH retarda el pardeamiento enzimático. El pH óptimo de las fenoloxidasas de las frutas y de los vegetales está en el rango de 4-7. Por lo general se emplean baños en ácido cítrico. La enzima se inhibe completamente a pH menores de 3,0; aunque en la
mayoría de los casos resulta poco práctico, puesto que esta acción trae consigo un deterioro de las propiedades sensoriales y de la estabilidad del alimento. También son eficaces contra el pardeamiento enzimático y no enzimático, el anhídrido sulfuroso y los bisulfitos; además poseen una acción antiséptica, aunque no en las dosis empleadas contra el pardeamiento. En el caso del pardeamiento enzimático su modo de acción no está totalmente aclarado: el anhídrido sulfuroso, del que una parte se fija sobre los enlaces carbonilo de los azúcares presentes, reacciona con las quinonas, que así quedan bloqueadas, pero se piensa que también actúan directamente sobre la polifenol oxidasa. Se observó que el ácido ascórbico y la tiamina permiten reducir las dosis de bisulfito. El cobre es un importante cofactor para la enzima, por lo tanto la remoción o quelación inhibirá a la enzima. 3.2.3. Adición de agentes reductores.
Transforman las quinonas en fenoles retardando o impidiendo el pardeamiento enzimático. El compuesto frecuentemente utilizado es el ácido ascórbico; se emplea para jugos de frutas y para frutas cortadas en trozos ya que en las frutas enteras, penetra lentamente. Para evitar el pardeamiento se necesitan cantidades elevadas de ácido ascórbico (0,5 a 1 % del peso del producto). 3.2.4. Exclusión del oxígeno.
Se puede evitar el contacto con el oxígeno envasando los vegetales después del pelado y corte, al vacío o colocándolos en recipientes bien herméticos. También se puede impedir mediante la inmersión en agua ligeramente salada o en una solución de sacarosa o glucosa. Esto limita la entrada y absorción de oxígeno por el tejido vegetal, debido al aumento de la presión osmótica. 3.2.5. Alteración enzimática de los sustratos fenólicos:
La enzima catecol o-metiltransferasa convierte a los sustratos fenólicos en formas químicas que no pueden ser oxidados enzimáticamente. 3.2.6. Selección de variedades pobres en sustratos fenólicos:
En algunas frutas y hortalizas es posible seleccionar variedades pobres en sustratos fenólicos. 3.2.7. Evitar el contacto de enzimas y sustratos:
Impidiendo contusiones que dañen los tejidos.
IV.
PARTE EXPERIMENTAL
4.1) MATERIALES
Placas Petri Tubos de ensayo
Termometro Mechero Rejilla Papa y manzana Ácido cítrico 0.1, 0.5 y 1% Bisulfito de sodio al 0.1, 0.5 y 1% Zumo de limón
4.2) MÉTODO EXPERIMENTAL
EFECTO DE PARDEAMIENTO EN LOS TEJIDOS VEGETALES a) Utilizar la cuarta parte de la manzana y papa luego cortarla en trozos. b) Desmenuzar uno de los trozos y colocarlo en una placa Petri junto al trozo entero. c) Comparar el pardeamiento que se produce en las dos muestras.
d) La otra parte dividirla en dos: una, dividirla mediante rotura y la otra, cortarla usando un cuchillo y colocarlas sobre la placa Petri. Observar el color desarrollado y cual pardea más rápido e) Utilizando zumo de manzana previamente tamizado y filtrado, colocamos 10 ml en una placa Petri y 10ml en un tubo de ensayo. f) Observar en cuál de las dos muestras hay mayor pardeamiento.
EFECTO DE LA TEMPERATURA Colocar 1ml de zumo de manzana en cada uno de los tubos de ensayo: A, B, C y D: Tubo A: Calentamos a la llama del mechero y dejar que su contenido hierva durante un minuto.
Tubo B: Baño maría de 50ºC. Tubo C: Baño maría de 100ºC. Tubo D: Mantenerlo a temperatura ambiente. -Comparar el grado de pardeamiento en los 4 tubos.
EFECTO BISULFITO DE SODIO Colocar 4 trozos de manzana y 4 trozos de papa sobre la placa Petri y empaparlos con las siguientes soluciones: a. b. c. d.
Bisulfito de sodio al 1% Bisulfito de sodio al 0.5% Bisulfito de sodio al 0.1% Agua
-Dejamos durante 1 hora y media y comparamos el pardeamiento.
4.3) RESUTADOS
a) Cuadro comparativo Pardeamiento en los tejidos vegetales
Por efecto de la temperatura
Por efecto del bisulfito de sodio
FISICO En las manzanas pequeñas picadas sufrieron mayor pardeamiento a diferencia de la otra mitad entera Las manzanas en trozos sufrieron con más notoriedad el pardeamiento porque la superficie de estas es más pequeña y tiene contacto más rápido con el oxígeno.
FISICO Dependiendo de la intensidad con que fue tratada la muestra, podemos decir que a mayor temperatura el pardeamiento se reduce. La muestra que se puso a medio ambiente sufrió con más notoriedad el pardeamiento a diferencias de las que fueron tratadas a diferentes temperaturas.
QUIMICO Dependiendo de la concentración de bisulfito de sodio, podemos decir que a mayor concentración el pardeamiento se reduce. La muestra que tuvo de sustancia a el agua se pardeo más rápido que las que fueron sometidas a concentraciones de bisulfito de sodio
Imagen
Medio Intensidad del Pardeamiento
Diferencias
b) Diferencias de la papa y manzana puestas a temperatura de ebullición a tiempos de 30, 60,90 y 120 segundos.
30
60
90
120
V.
VI.
VII.
CONCLUSIONES Se observó las influencias de los tejidos vegetales en la producción de pardeamiento enzimático. Se determinó el efecto del calor en la reacción de pardeamiento enzimático. Se determinó el efecto al adicionar diferentes compuestos en el pardeamiento enzimático. DISCUSIONES J.B.S Braverman nos dice en su libro BIOQUIMICA DE ALIMENTOS: Las enzimas pueden ser fácilmente inactivadas mediante el incremento de la temperatura, la mayoría de las enzimas son termolábiles y generalmente basta con aplicar una temperatura de 70 a 80ºC durante 2 a 5 min. En la práctica hecha en clase se cumple con lo establecido por Braverman, tanto en la manzana como la papa se retrasó el pardeamiento enzimático por un periodo de 10 a 15 min con respecto al que sufriría a condiciones normales.
BIBLIOGRAFIA
Dr. Hermann Schmidt Hebbel. Prof. Irma Pennacchiotti Monti/ Las enzimas en los alimentos . Su importancia en la química y la tecnología de los alimentos./ Edición Digital reproducida con autorización de los autores Año 2001 / Universidad de chile
VIII.
CUESTIONARIO 1. Explicar la influencia de la temperatura y pH en el pardeamiento enzimático.
La temperatura de escaldado entre 70 y 85ºC como el pH acido de una muestra va inactivar las enzimas encargadas de producir pardeamiento enzimático.
Inactivación de la enzima mediante calor. Tiene la ventaja de que no se aplica aditivo alguno,
pero presenta el inconveniente de que la aplicación de calor en frutas frescas produce cambios en la textura, dando sabor y aspecto a cocido. Para evitar estos inconvenientes se regula el tiempo de calentamiento, acortándolo justo al mínimo capaz de inactivar la enzima por un escaldado inmediato. Se puede controlar la inhibición enzimática por la prueba del catecol. La inhibición es lenta a 75°C, pero se hace rápida a 85°C. pH acido. Bajo un pH 2,5 cesa la actividad enzimática, que es óptima entre 5 y 7. Aunque
luego se vuelva al pH original de la fruta, la enzima no se recupera, impidiéndose así el pardeamiento. Entre los ácidos más usados está el málico, que se agrega al prensar la fruta: caso de la manzana, de la cual es uno de sus componentes naturales (30); también se usa, pero en menor proporción, el ácido cítrico.
2. ¿Cómo actúa el bisulfito? El bisulfito de sodio que es un agente reductor, adicionado con el fin de evitar o controlar el pardeamiento, pero con el avance de la reacción éste no es capaz de cumplir dicha función, entonces se acentúa el color pardo rojizo a pardo oscuro, y aparece el olor a tostado y se forman las melanoidinas, que son coloides insolubles. El camino del pardeamiento no enzimático como consecuencia de la reacción de Maillard, comienza con una reacción de condensación que es reversible. Cuando las aldosas reaccionan con un compuesto aminado, pronto se encuentra que la mezcla de reacción contiene acetosa y viceversa. Después gran cantidad de los compuestos intermediarios de descomposición se forman cada vez más insaturados y reactivos para continuar con una descarboxilación de los aminoácidos en presencia de los compuestos dicarbonílicos. Las etapas finales de la reacción de pardeamiento aparentemente serían polimerización al azar de los intermediarios formados, Los productos finales de la reacción, las melanoidinas pardas, son pigmentos complejos de alto peso molecular, de estructura desconocida. La velocidad de pardeamiento aumenta con la temperatura. El pH, no sólo afecta la velocidad de pardeamiento sino que también determina el mecanismo predominante en el proceso. 3. ¿Qué compuestos participan en el pardeamiento enzimático?
