INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CELAYA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
Manual de Prácticas de laboratorio de Bioquímica (COMPETENCIAS)
PRÁCTICA 1 OBTENCIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS OBJETIVO
Demostrar la presencia de ácidos nucleicos en la levadura.
INTRODUCCIÓN
Los ácidos nucleicos son polímeros de elevado peso molecular formados por nucleótidos. Los nucleótidos son esteres que se forman por acción del ácido fosfórico sobre un nucleósido, que a su vez, está constituido por la unión de una pentosa con una base aminada. Se consideran dos clases de ácidos nucléicos: los ADN y los ARN, los cuales tienen a su cargo la transmisión de la información genética y la síntesis de proteínas, respectivamente. Una de las diferencias entre los nucleótidos que forman uno y otro tipo de ácidos, radica en la pentosa que sirve de soporte a las bases y al ácido fosfórico. Los ADN tienen como azúcar a la D-2-desoxirribosa y los ARN a la Dribosa. Los ARN pueden ser hidrolizados por los álcalis y esta labilidad es útil para su detección en los procesos analíticos. La identificación de la presencia de una pentosa, confirma el diagnóstico. En esta práctica se efectuarán ambas experiencias.
MATERIALES
REACTIVOS
1 Agitador 1 Embudo 1 Embudo Buchner 2 Matraces Erlenmeyer de 125 ml 1 Matraz Kitazato 1 placa de calentamiento 1 Pipeta de 5 ml 1 Pipeta de 10 ml 4 Tubos Falcon 2 Vasos de precipitado de 250 ml 1 Tubo de ensaye
Algodón HCl conc. 4-5 ml Cloruro férrico al 10% 5 ml Etanol 10 ml NaOH al 30% 7 ml Papel filtro Reactivo de Bial Tierra de diatomeas Barra de levadura (alumno) Gasa
METODOLOGÍA 1. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS Pese 5g de levadura seca. Colóquela en un vaso de precipitado, agregue 7 ml de NaOH al 30% y agite con una varilla hasta obtener una mezcla homogénea. Agregue 5 ml de agua y homogenice la mezcla. Añada 5 ml de solución de cloruro férrico y mezcle. Filtre la mezcla empleando gasa como medio de filtración y reciba el líquido en un vaso de precipitado. Lave el residuo que queda retenido en la gasa con 15 ml de agua. El residuo se desecha. El líquido se seca por succión en un embudo Buchner previamente acondicionado con ayudante de filtración. Inmediatamente lave el residuo con 5 ml de agua.
NOTA: El ayudante de filtración es un material polvoriento que se esparce sobre el papel filtro que se aplica al embudo Buchner.
Añada al filtrado 10 ml de etanol y después agregue HCl concentrado gota a gota. Cada vez que agregue una gota de HCl, mezcle perfectamente con el agitador, tome una gota y colóquelo sobre un pedazo de papel indicador. Suspenda la adición de HCl cuando el pH sea ácido. La acidificación del líquido filtrado hace que se precipite el ácido nuicléico. Pese cuatro tubos de ensaye, limpios y secos. Anote el peso. Para concentrar el precipitado formado, distribuya el contenido del matraz en los 4 tubos Falcon y centrifugue por 5 minutos. Decante perfectamente el líquido sobrenadante y pese los tubos. Obtenga el rendimiento por diferencia de pesadas y repórtelo.
2. REACCIÓN DE BIAL (IDENTIFICACIÓN DE PENTOSAS) Ponga 15 gotas del reactivo de Bial a uno de los tubos y agregue 4 o 5 ml de HCl concentrado, mezcle por agitación pendular. Tape el tubo de ensaye con un algodón e introdúzcalo en agua hirviendo por 3 minutos. Una coloración verde azulada o verde olivo indica que la reacción es positiva. Reporte el resultado.
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4.
¿Cuáles son las partes que constituyen un nucleótido simple? ¿Qué diferencia hay entre nucleósido y nucleótido? Ejemplifique. Mencione las funciones más importantes del DNA y RNA. Todo tipo de organismo contiene ambos tipos de ácidos nucléicos. Explique su respuesta.
PRÁCTICA 2 PROTEÍNAS OBJETIVO Identificar mediante la realización de reacciones químicas, algunos componentes de la manera viva.
INTRODUCCIÓN La constitución química de los seres vivos es muy compleja, pero básicamente en su composición entran compuestos orgánicos pertenecientes a los hidratos de carbono, lípidos y proteínas. Los tres tipos de compuestos desempeñan funciones de energéticos, constitutivos de sustancias más complejas y son componentes de las diversas estructuras que conforman a las células. En la presente práctica, se harán pruebas de identificación como manera de corroborar la presencia de proteínas en los seres vivos y sus productos.
MATERIALES
REACTIVOS
1 Gradilla 1 Placa de calentamiento 1 Pinzas para tubo 3 Tubos de ensaye 1 Vaso de precipitado de 250 ml.
Hidróxido de sodio al 10% y 30% 1mlc/u Sulfato de cobre (II) al 1% Reactivo de Hopkins 1ml Ácido nítrico concentrado 0.5ml Ácido sulfúrico concentrado 3ml Solución problema
METODOLOGÍA 1. DETERMINACIÓN DE ENLACES PEPTÍDICOS a) En un tubo de ensaye mezcle 1ml de solución problema con 1 ml NaOH al 10%. Agite con movimiento pendular y añada gota a gota sulfato cúprico (máximo 20 gotas). La aparición de una coloración rosa violeta, indica que la prueba es positiva.
2. IDENTIFICACIÓN DE MATERIA PROTEICA (REACCIÓN XANOPROTEICA) a) A un ml de solución problema añádale lentamente 0.5 ml de ácido nítrico concentrado. b) Calienta y deja enfriar la solución. Una vez fría, añada gota a gota una solución de hidróxido de sodio al 30% (máximo 20 gotas). Las proteínas producen con el ácido nítrico un marcado color amarillo que pasa a anaranjado con el hidróxido de sodio, esta reacción acusa la presencia de los aminoácidos fenilalanina, tirosina y triptófano.
3. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EN GENERAL a) Ponga un ml de reactivo de Hopkins en un tubo de ensaye, añada 1 ml de solución problema y mezcle por movimiento pendular. Incline el tubo ligeramente y añada 3 ml de ácido sulfúrico concentrado, haciéndolo resbalar por las paredes lentamente. Vuelva a agitar para que las sustancias se mezclen y deje reposar por 1 minuto. La aparición de una coloración violeta (reacción de triptófano) indica que la reacción es positiva.
CUESTIONARIO 1. ¿Por qué es importante conocer la secuencia de los aminoácidos de una proteína? 2. ¿Qué es una proteína simple y una conjugada? 3. ¿De qué está formado un enlace peptídico?
PRÁCTICA 3 COFACTORES E INHIBIDORES OBJETIVO Preparación y actividad de deshidrogenasas, así como de cofactores y presencia de inhibidores, a partir de fuentes naturales.
INTRODUCCIÓN Todas las manifestaciones requieren energía la cual se obtiene por la oxidación gradual de los alimentos, ya que los diferentes procesos de oxidorreducción se dan en una transferencia de energía por diferencias en el potencial eléctrico. El sistema de un potencial elevado oxida al de más bajo potencial con la consiguiente liberación de energía para las necesidades vitales. En todas las reacciones de oxidorreducción hay transferencia de electrones. Por tanto la oxidación y reducción son fenómenos que se realizan en forma simultánea. En muchas reacciones de oxidoreducción de la célula también hay transferencia de hidrógenos. La oxidación biológica implica la transferencia de hidrógenos y de electrones a través de una serie de transportadores de electrones de la cadena respiratoria que actúan como intermediarios para llegar al aceptor final de electrones que es el oxígeno molecular. El proceso oxidativo se inicia por la acción de deshidrogenasas específicas que no reacciona directamente con el oxígeno, sino que requieren de intermediarios como NAO, flavoproteínas y familia de citocromos. En la presente práctica se realizará el estudio de las deshidrogenasas y de dos oxidasas que actúan como intermediarios en el transporte de electrones.
MATERIALES
REACTIVOS
1 mortero con mano Pipetas de 1, 5 y 10 ml 14 tubos de ensaye 12 tubos de centrífuga 3 vasos de precipitado de 300 ml 3 matraces Erlenmeyer de 250 ml 1 baño María 1 gradilla 1 agitador Cuchillo (alumno)
NaCl 0.9% Na2HPO3 0.06 M KCN 0.01% Lactato de sodio 1% Azul de metileno 0.002 M Ac. Succínico 0.1 M Ac. Malónico 0.01 M 2,6 diclorofenol indofenol 0.1% Nugol (aceite mineral) (alumno) Corazón de pollo (alumno) Pierna de pollo (alumno) Hielo (alumno)
ATENCIÓN: Cuando se trabaja con soluciones de KCN deberán hacerla con mucho cuidado de no pipetear y evitar el contacto con la piel.
PROCEDIMIENTO A. PREPARACIÓN DEL SISTEMA DESHIDROGENASA LÁCTICA-NAD Preparación de la coenzima. De la pierna de pollo obtener 10 g del músculo y cortarlo en fragmentos pequeños y colocarlos en un vaso con agua destilada, en una proporción de 8 ml de agua por gramo de músculo, dicho vaso estará en un baño María a ebullición durante 5 minutos. Después de este tiempo pasar la preparación a un mortero con arena y moler perfectamente hasta que las fibras hayan desaparecido. Esta preparación se pasará a tubos de centrífuga, la cual se centrifugará a 3000 rpm durante 15 minutos. Después de esto el sobrenadante de todos y cada uno de los tubos se pasará a un matraz etiquetado como COENZIMA.
Preparación de la enzima Pesar 10 g del músculo de la pierna de pollo y agregar 10 ml de NaCl al 0.9% por gramo de músculo. Colocar lo anterior en un mortero, el cual deberá estar en un baño de hielo. Con ayuda de arena esta preparación se molerá hasta obtener una muestra casi sin fibras. Después se dejará reposar 30 minutos en el mortero sobre el baño de hielo. Pasado este tiempo la preparación se pasará a tubos de centrífuga para ser centrifugados a 3000 rpm durante 15 minutos pasar el sobrenadante a un matraz marcado como DESHIDROGENASA LÁCTICA (LDH).
B. PREPARACIÓN CITOCROMOS
DE
LAS
DESHIDROGENASAS
SUCCINA
Y
Del corazón de pollo cortarlo en fragmentos pequeños, pesarlo(s) y colocarlo en un vaso que contenga Na 2HPO3 se usarán 8 ml por gramo de corazón. Dicha mezcla se molerá en mortero que contenga arena para que ayude a moler muy bien el corazón. El mortero deberá de estar en un baño de hielo, cuando se haya terminado el molido la mezcla se deja reposar 30 minutos en un baño de hielo, con agitación ocasional, pasado este tiempo la preparación TUBO (ml) KCN 0.01% Lactato de sodio 1% Azul de metileno 0.002 M Agua destilada
1 2 3 4 5 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 2 1 2 2 0 0 1 1 1 1 Sobrenadante “coenzima” Sobrenadante (LDH) 1 1 1 0 1 deberá ser centrifugada a 3000rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se colocará en un matraz etiquetado como DESHIDROGENASA SUCCÍNICA (SDH).
C. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDADES Mientras se obtienen los sistemas enzimáticos preparar los tubos según se indica en cada tabla, para así determinar las actividades enzimáticas. Mezclar bien todos los tubos por agitación y agregar a todos los tubos un ml de nugol (aceite de cocina). Incubar en baño María a 37ºC durante 1 hora haciendo observaciones cada 10 minutos. Anote todos los cambios observados por grados de decoloración.
DESHIDROGENASA SUCCÍNICA TUBO (ml) Ac. Succínico 0.1 M Azul de metileno 0.002 M Ac. Malónico 0.1 M Agua destilada Sobrenadante “SDH”
1 0.5 0.3
2 0.5 0.3
3 0.5 0.3
4 0.5 0.3
0 1.5 2
1 0.5 2
0 3.5 0
1 1.5 1
Mezclar bien los tubos y añadir a todos los tubos 1 ml de nugol. Incubar a 37ºC durante 1 hora, haciendo observaciones cada 10 minutos, anote todo cambio observado como grados de decoloración.
CITOCROMOS Y CITOCROMO OXIDASA TUBO (ml) KCN 0.01% 2,6 diclorofenol indofenol 1% Alfa naftol 0.15% Agua destilada Sobrenadante “SDH”
1 0 1
2 1 1
3 0 1
4 0 1
5 1 1
0 1.1 1
0 0.1 1
0 2.1 0
0.1 1 1
0.1 1 0
Incubar a 37ºC los tubos con agitación ocasional durante 30 minutos, anotar cualquier cambio en coloración en los tubos.
REPORTE 1. Escriba las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los tubos indicando por qué si o por qué no se realiza la reacción. 2. Para reportar el cambio de coloración en cada uno de los experimentos haga un cuadro donde indique con O la falta de decoloración y con X el grado de coloración, según sea el tiempo que se observó cada tubo.
CUESTIONARIO 1. Investigue qué tipo de reacción realiza cada una de las enzimas que se utiliza en este experimento. 2. ¿Por qué se utiliza azul de metileno en estos experimentos? 3. ¿Por qué los experimentos en ésta práctica se realizan a 37ºC? 4. Investigue por qué la COENZIMA, el LDH y la SDH se obtienen del músculo de la pierna de pollo, así como del corazón de pollo.
PRÁCTICA 4 CATALASA OBJETIVO Conocimiento de la actividad de la catalasa sobre el peróxido de hidrógeno.
INTODUCCIÓN Las catalasas son enzimas que catalizan la descomposición del peróxido de hidrógeno por acción de las oxigenasas. Las peroxidasas catalizan la reacción en la cual el hidrógeno del peróxido es el aceptor de electrones. De ese modo la peroxidasa transfiere el hidrógeno como se muestra en la reacción. AH2 + H2O
A + 2H2O
Posee una alta especificidad por su sustrato, ya que, actúa solamente sobre el peróxido de hidrógeno. Dicha enzima se encuentra ampliamente distribuida en casi todas las células vivas, es muy abundante en la sangre y en el hígado.
MATERIALES
REACTIVOS
2 vasos de precipitado de 250 ml 1 bureta 1 baño María 1 pinzas para bureta 1 agitador 1 lanceta estéril 6 matraces Erlenmeyer de 125 ml Pipetas de 0.5, 1 y 5 ml 1 placa de calentamiento
Amortiguadores de fosfatos de 0.02 M y pH 7 H2O2 al 0.05 M en amortiguador de fosfatos KCN 0.005 M KMnO4 6 N Hielo (alumno)
PROCEDIMIENTO Se utiliza como fuente de enzima una dilución de sangre fresca de 1:1000. Se colocan 10 ml de agua destilada fría en un matraz Erlenmeyer rodeado de hielo picado. Se toma una muestra de sangre fresca a través de la punción que se hace en la yema del debo mediante una lanceta estéril. Se dejan caer unas 3 o 4 gotas de sangre sobre el agua fría en el matraz. Se aspira el agua con la pipeta varias veces para asegurarse que toda el agua tenga la misma concentración de sangre. Nuevamente se agita el matraz para obtener una mezcla homogénea. Dicho matraz con la sangre ya diluida se mantiene en el baño de hielo a baja temperatura, mientras se preparan los 5 matraces según se indica en la tabla, pero antes de ser preparados deberá leer las siguientes indicaciones. El matraz 1 representa la cantidad de H 2O2 que se añade a cada matraz, es por eso que en este matraz se añadirá primero con 2 ml de H 2O2 al 0.05 M. En los matraces 2 al 5 la reacción se detendrá 5 minutos, es decir, ya preparados los matraces como se indica en la tabla incluyendo la enzima, se esperan 5 minutos, y luego se adicionará los 2 ml de ácido sulfúrico 6 N. Enseguida se determinará la titulación del H 2O2 con el permanganato de potasio 0.005 M. La primera gota de permanganato en exceso vuelven rosa a la solución que se tiene en el matraz, ésta será la que se tome como referencia cuando ya permanezca constante el color. El H2O2 que no fue descompuesto por la catalasa permanece estable en la solución ácida sólo media hora aprox., por lo tanto en ese periodo se deberán titular todos y cada uno de los matraces. Ya preparados éstos no se deberán pasar el tiempo indicado. Después de que se termina la titulación se tira el contenido de estos.
Preparación de los matraces según la tabla:
CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA La actividad de la catalasa puede expresarse como los moles de H 2O2 descompuestos por efecto de la enzima en 5 minutos a 0 º C por ml de sangre. Por lo tanto: a) Si dos moles de KMnO4 se descomponen en 5 moles de H 2O2. En los moles de KMnO4 utilizados, (gastados) cuántos se descompondrán. b) Si un mol de KMnO4 se encuentran en 5 moles de H 2O2, cuantos moles de H2O2 se estarán descomponiendo. Para conocer estas cifras es necesario usar el resultado del enciso a. a) Y b) Se calculan por regla de 3 c) Por último como se trabajó con una dilución de sangre 1:1000 se le restarán el resultado de b) se multiplicará por 2000 para obtener la actividad específica de la catalasa en cada matraz.
INFORME En un cuadro entregar los siguientes resultados: ml de KMnO4 gastados en cada matraz H2O2 restante en cada matraz KMnO4 descompuesto igual para cada uno Actividad específica de cada matraz
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Investigue si existe alguna diferencia entre la catalasa animal y vegetal. ¿Qué función desempeña el regulador de fosfatos? ¿Qué se entiende por actividad específica de la enzima? Explique que sucede en el matraz Nº3. ¿Existirá actividad de la catalasa? Explique otros métodos que se pueden emplear para desnaturalizar ésta enzima y explica su efecto. ¿Cuál es la fórmula para calcular la concentración de los componentes de cualquier solución reguladora? ¿Qué tipo de inhibición presenta el cianuro en la actividad de la catalasa? ¿Por qué se realiza el experimento a cero grados centígrados? Añade los cálculos y los resultados obtenidos en la práctica.
PRACTICA 5 AISLAMIENTO DE LIPIDOS COMPLEJOS OBJETIVO Conocer las técnicas de aislamiento para cada tipo de lípidos.
INTRODUCCIÓN Este experimento consta de la reacción y purificación de los lípidos del tejido cerebral, así como también de otros tejidos haciéndose resaltar que los productos finales, con excepción del colesterol representan substancias purificadas no puras. Dicha extracción está basada sobre las siguientes propiedades particulares: 1. Los esteres son solubles en cetona. 2. Algunos glicerofosfolípidos como la lecitina fosfatidil serina, fosfatidil etanoamina en éter e insoluble en cetona.
3. Los fosfátidos y glucósidos de esfingosma se disuelven en alcohol caliente y son insolubles en acetona y éter.
REACTIVOS
MATERIALES 1 Licuadora 2 vasos de precipitados de 250 ml 1 probeta de 100 ml 1 embudo Buchner 1 matraz kitazato 1 pipeta de 5 ml 1 pipeta de 10 ml 2 matraces Erlenmeyer de 125 ml 1 embudo
MATERIAL BIOLÓGICO equipo) Sesos de res y hielo (alumno)
(por
Acetona 145 ml Éter 80 ml Cloroformo Metanol Etanol 60 ml
PROCEDIMIENTO COLESTEROL FRACCION 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
Colocar 40 g de muestra en la licuadora. Adicionar lentamente y poco a poco 100 ml de acetona y licuar. Transferir lo licuado a un vaso de precipitados. Lavar el vaso de la licuadora con 15 ml de acetona y transferir el lavado al vaso de precipitados. Reposar de 5 a 10 minutos. Filtrar a vacío. Recoger el filtrado o sobrenadante que constituye la fracción 1 (colesterol) y transferirlo a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, evaporar el solvente del filtrado obtenido en una parrilla de calentamiento, este residuo constituye la fracción 1 COLESTEROL. El precipitado que queda en el papel filtro se transfiere a un vaso de precipitado para proceder con la extracción de la fracción II.
CEFALINA Y LECITINA FRACCIÓN II 9. Al precipitado anterior agregarle 40 ml de éter y disolvente. 10. Reposar 5 minutos, tapando el vaso. 11. Filtrar rápidamente a vacío. 12. El precipitado que queda en el papel guardado para repetir los pasos del 9 al 12 una vez más. 13. El precipitado que queda en el papel después de la segunda filtración se guarda para la obtención de la fracción III. 14. Concentrar el filtrado del paso 12 hasta un volumen aproximado de 10 ml utilizando baño maría eléctrico. 15. Añadir a este filtrado 10 ml de acetona y agitar 16. Filtra a vacío. 17. El filtrado obtenido puede juntarse con el extracto obtenido en el paso 7 o bien desecharse. 18. Pesar un papel filtro. 19. El precipitado que queda ene l papel filtro constituye la fracción II se seca a temperatura ambiente y se pasa obtener rendimiento.
FOSFÁTIDOS Y GLUCÓSIDOS DE ESFINGOSINA FRACCIÓN III 20. El precipitado obtenido en el paso N°13 se coloca en un vaso de precipitados y se le agregan 30 ml de etanol hirviendo y se disuelve. 21. Filtrar la suspensión aún caliente. Repetir desde el paso 20 nuevamente.
22. Desechar el precipitado. 23. Enfriar el filtrado obtenido por 10 minutos, para favorecer la formación de cristales. 24. Pesar un papel filtro. 25. Filtrar. 26. El precipitado obtenido constituye la fracción III.
CUESTIONARIO 1.- Escribe las reacciones que se presentan en la hidrolisis de los lípidos tanto acidas como alcalinas. 2.-Investiga que otros métodos hidrolíticos existen y que ventajas o desventajas tendrían con los empleados en este método. 3.- Explica detalladamente a qué se debe la diferencia en solubilidad de los lípidos separados.
PRÁCTICA 6 PRODUCCION DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACION DE GLUCOSA POR LEVADURA OBJETIVO. Demostrar la formación de intermediarios glucolÍticos. INTRODUCCION. La primera etapa del metabolismo de glucosa en levadura es la producción de PIRUVATO, este proceso se efectúa mediante una serie de reacciones enzimáticas que involucran un número considerable de intermediarios y se conoce como GLUCÓLISIS. La reacción total podrá considerarse como la transferencia de dos pares de átomos de hidrogeno de la glucosa al NAO. Puesto que la coenzima se encuentra solo en cantidades catalíticas, es necesario preoxidarla para que el proceso no se suspenda y así el NAOH+H formado es reconvertido a NAO por oxigeno molecular a través de la cadena respiratoria. Esto no es posible en condiciones anaerobias y en este caso la reoxidacion se efectúa cuando el PIRUVATO se convierte en acetaldehído y luego en alcohol. OXIDACIÓN AEROB IA Y ANA EROBIA DE GLUCOSA EN LEVADURA Agua Molecular
½ de Oxigeno Cadena Respiratoria Aerobio
Glucólisis 2NAD + C6H12O6 2 (PIRUVATO)
2NADH + H Piruvato decarboxilasa TPP MG
Alcohol deshidrogenasa Anaerobio 2(ETANOL)
2 (ACETALDEHÍDO + 2CO 2
Los metabolitos de piruvato y acetaldehído se encuentran presentes normalmente en muy bajas concentraciones, por tanto, para demostrar su existencia como intermediario en el camino metabólico es necesario impedir que sean transformados en otros compuestos. Este procedimiento se usa mucho cuando se investigan caminos metabólicos y se hace bloqueando la enzima que cataliza la conversión del compuesto, mediante inhibidores. También se pueden cambiar las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad máxima o se pueda usar un agente que atrape al intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse, estos dos últimos procedimiento se demuestran en el siguiente experimento. La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción de nitroprusiato de sodio o 2,4-dinitrofenilhidrazina.
MATERIALES
REACTIVOS
8 Tubos de ensaye 2 Pipetas de 5ml 2 Pipetas de 10ml 4 Tubos de centrífuga 1 Gradilla 2 Matraces Erlenmeyer de 125ml 2 Vasos de precipitados de 250ml 1 Baño María
Fosfato de sodio dibásico 0.5M Fosfato de potasio monobásico 0.5M Suspensión en levadura (10g/100ml en Na2HPO4) Suspensión en levadura (10g/100ml en KH2PO4) Glucosa 100g/L Nitroprusiato de sodio 2.5g/50ml (prepárese al momento de usar) Hidróxido de amonio Sulfato de amonio Hidróxido de sodio 100g/L Hidrocloruro de 2,4-dinitrofenilhidrazina (solución saturada en HCl 2M) Ácido tricloroacetico 100g/L
PROCEDIMIENTO. Formación de piruvato a partir de glucosa. En dos tubos de ensaye coloque 5ml de solución de glucosa (A y B); al tubo A agregue 5ml de suspensión de levadura en solución ligeramente alcalina de Na 2HPO4. Al tubo B añada 5ml de suspensión de levadura en solución acida de KH 2PO44. Coloque los tubos en un baño María de temperatura controlada a 37°C durante una hora.
Después del tiempo indicado añada a cada tubo 2 ml de la solución de ácido tricloroacetico, mezcle vigorosamente y centrifugue durante 10 minutos a 2500 rpm. Separe el sobrenadante y úselo para la determinación de piruvato etiquetando para cada uno de ellos la muestra A y B.
DETERMINACIÓN DEL PIRUVATO MEDIANTE NITROPRUSIATO DE SODIO En un tubo de ensaye coloque un gramo de sulfato de amonio sólido y luego agregue 2ml de sobrenadante hervido previamente y agregue 2 gotas de nitroprusiato de sodio preparado recientemente y mezcle vigorosamente. Deje deslizar cuidadosamente por las paredes del tubo amoniaco concentrado verde o azul en la interface de los dos líquidos. Esta prueba se realiza para cada muestra (A y B). La formación de un anillo rosado transitorio en la interface indica la presencia de grupos tioles y con frecuencia se observa antes de la coloración azul o verdosa, característica de la reacción de piruvato.
DETERMINACIÓN DE PIRUVATO CON 2,4-DINITROFENILHIDRAZINA A 2 ml de sobrenadante agregue 1 ml de solución saturada de 2,4dinitrofenilhidrazina, mezcle fuertemente y luego coloque de 5 a 8 gotas de esta mezcla a un tubo de ensaye y agréguele un mililitro de NaOH y diluya con agua destilada hasta 5 ml en donde la formación de un color rojo indicara la presencia de piruvato, esta prueba se realiza para cada muestra de sobrenadante A y B.
CUESTIONARIO 1. Explique que es el metabolismo. 2. A que se le conoce como proceso de fermentación, explique. 3. ¿Por qué la fermentación alcohólica solo sucede en levaduras? 4. ¿Qué es un proceso aerobio y anaerobio? 5. Menciona 5 diferentes materias primas que puedan ser utilizadas en la fermentación alcohólica.
PRÁCTICA 7 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LÍPIDOS. LA ACCION DE LA LIPASA. OBJETIVO. En este experimento se usara un extracto pancreático el cual tiene una lipasa muy potente.
INTRODUCCIÓN La lipasa cataliza la hidrolisis de los enlaces de tipo éster de los triglicéridos, que se encuentran en los animales y las plantas. Las lipasas y estereasas son especialmente importantes en el tracto gastrointestinal porque intervienen en la digestión y absorción de grasas. Debido a que las grasas son insolubles en agua, las enzimas actúan en la interface agua – lípido. Consecuentemente, agentes emulsificantes tales como los ácidos biliares, estimulan la hidrolisis enzimática del lípido debido a que aumentan la interface agua – lípido. En la leche homogenizada los glóbulos de grasa están finamente divididos, por lo cual sirve bien como sustrato para la lipasa. La acción de la lipasa sobre grasas neutras produce un desdoblamiento en ácidos grasos y glicerol, lo cual puede poner de manifiesto por el aumento en la acidez titulable después de que se ha realizado la acción de la lipasa. Cuando la grasa no está emulsificada, la superficie que presenta es muy poca, por lo que la acción de la lipasa es muy baja, pero al emulsionarse, aumenta la superficie y por lo tanto la acción de la lipasa. El acontecimiento inicial en la utilización de la grasa como una fuente de energía es la hidrolisis del triacilglicerol por las lipasas.
EXPERIMENTO A----- PRIMERA PARTE
MATERIALES
REACTIVOS
2 Matraces Erlenmeyer de 125ml 1 Vaso de precipitado de 250ml 1 Bureta 1 Pinzas para bureta 1 Agitador 1 Pipeta de 1ml 1 Soporte universal 1 Baño maría
Extracto pancreático o solución de pancreatina Bicarbonato de sodio 5% KOH 0.1N Polvo de Tornasol Mayonesa (alumno)
PROCEDIMIENTO En dos matraces Erlenmeyer que serán etiquetados como matraz No.1 y No. 2, colocar una muestra de 2.5 g de mayonesa y agregarle a cada uno una pequeñísima cantidad de polvo de tornasol y enseguida homogenizar las muestras. A ambos matraces se les agrega 1 ml de pancreatina, solo que al matraz 2 se le añade hervida dicha pancreatina para inactivarla, en este mismo matraz se le ajusta el pH a 8.0 adicionándole bicarbonato de sodio al 5%. Estos dos matraces se incuban a 37°C durante 30 minutos en un baño María de temperatura controlada. Al terminar el tiempo de incubación se debe observar que el matraz que contiene la pancreatina inactiva (No. 2) permanece del mismo color azul en tanto que el que contiene la pancreatina activa (No. 1) presenta una coloración ligeramente rojiza. Esta coloración es producida por la liberación de ácidos grasos, ya que el indicador se pone rojo en presencia de los ácidos grasos. Para hacer cuantitativa esta práctica se deberán neutralizar los ácidos grasos libres con KOH 0.1 N; por lo tanto el matraz No. 1 que contiene la pancreatina activa se titula con KOH. El punto final de la titulación se manifiesta al tomar el matraz el color azul del otro matraz (No. 2).
CUESTIONARIO 1. Investigue la importancia del glicerol en la formación de los ácidos grasos. 2. Cuál es la importancia de la presencia de los lípidos en animales y vegetales. 3. Que desventajas existirían si existiera un exceso de grasa en un organismo. 4. Que diferencia se tiene entre la saponificación de la grasa animal y la hidrolisis enzimática de los triacilgliceroles. 5. Cuál es la fuente principal de ácidos grasos a nivel celular.
EXPERIMENTO B ----- SEGUNDA PARTE
MATERIAL
REACTIVOS
1 Vaso de 250ml 1 Pipeta de 5ml 1 Soporte universal 1 Pipeta de 10ml 7 Matraces Erlenmeyer de 250ml 1 Bureta 1 Pinzas para bureta 1 Baño María
Extracto neutro pancreático (1% en agua) Etanol KOH 0.05N Fenolftaleína Leche homogeneizada (alumno)
PROCEDIMIENTO Se etiquetan siete matraces y se les agrega a cada uno 5 ml de leche homogeneizada dejando al séptimo matraz como testigo. A cada matraz se le añade 1.5 ml de extracto pancreático, solo que el extracto pancreático agregado al séptimo matraz deberá hervirse para inactivar la enzima. Se colocan todos los matraces en un baño de agua controlada a 37° C y pasados 15 minutos se deberá sacar el primer matraz y añadirle 12.5 ml de etanol y titular con KOH 0.05 N utilizando fenolftaleína como indicador (agitar fuertemente la solución durante la titulación). Ir sacando del baño cada matraz a intervalos de 15 minutos y efectuar cada titulación. Esto partir del primer matraz que ha sido titulado.
1. REPORTAR. Adiciones Testigo Leche Homogeneizada Pancreatina 1% Resultados Tiempo de
1
Número de matraz 2 3 4
5
6
titulación Ml de titulación Ml titulación-ml del testigo 2. Graficar los resultados, mi de KOH vs Tiempo. 3. Escribir una reacción, mostrando la acción de la lipasa.
CUESTIONARIO. 1. ¿Qué diferencia existe entre grasa y aceite?, ¿cual es el origen de cada uno? 2. Investiga que tipo de grasa contiene la leche. 3. Investiga tres ejemplos de grasa animal y su fuente, así como grasa vegetal y también su fuente. 4. A que se le conoce como colesterol “bueno” y colesterol “malo”.
5. Porqué es importante la presencia de colesterol en el organismo.
