PRACTICAS DE LABORATORIO BIOQUIMICA

UNIVERSIDAD MARIANA LABORATORIO DE CIENCIAS BASICAS

PRACTICAS DE LABORATORIO BIOQUIMICA

ELABORADO POR: QUIMICA DIANA ANGELICA LOPEZ ZARAMA

SAN JUAN DE PASTO 2008

PRACTICAS DE BIOQUIMICA TERCER SEMESTRE DE ING. AMBIENTAL

1. pH EN SOLUCIONES ACIDAS ACIDAS Y BASICAS BASICAS OBJETIVO: Medir el pH de diferentes sustancias de origen orgánico e inorgánico.

FUNDAMENTO TEORICO: Las disoluciones ácidas y básicas son frecuentes en la naturaleza; muchas de ellas son fluidos del organismo humano y otras son productos de uso diario. Los fluidos del organismo difieren tanto en su carácter ácido o básico como en su grado de acidez. El del estómago es el más ácido, manteniendo su pH en un intervalo bastante reducido !." # $."%. El plasma sangu&neo es ligeramente básico y su intervalo de pH es muy limitado. 'i el pH del plasma var&a sobrepasando este intervalo, la capacidad de la sangre para transportar o(&geno se reduce. )or ello es importante para la vida humana *ue las modificaciones en el pH de la sangr sangre e est+ est+n n siem siempre pre dent dentro ro de un inte interv rval alo o pe*u pe*ueo eo.. En cont contras raste te con el plas plasma ma sangu&neo, la orina presenta un amplio intervalo de pH, pudiendo ser ácida, básica o neutra. Esto es debido a *ue muchas sustancias ácidas, básicas son eliminadas por el organismo a trav+s de la orina para mantener el adecuado pH de la sangre. El m+todo más frecuentemente utilizado para medir el pH en el laboratorio es el uso de un e*uip e*uipo o deno denomi mina nado do pH-me pH-metr tro o o pote potenc nció ióme metr tro. o. El pH de una una soluc solució ión n se dete determ rmin ina a sumergiendo los electrodos del e*uipo en la misma, y se lee directamente en la pantalla digital del e*uipo. La acidez de una disolución se puede determinar tambi+n por medio de un ndicador; *ue es un compuesto orgánico *ue cambia de color dentro de un determinado intervalo de pH. /n e0emplo muy conocido es el tornasol, cuyo color es ro0o a valores de pH inferiores a 1, y azul a valores superiores a 2.1. 3e los dos m+todos posibles de medir el pH de una disolución, el pH-metro es la más precisa; los indicadores se utilizan fundamentalmente en valoraciones ácido # base. En bio*u&mica la mayor&a de sustancias ácidas y básicas son ácidos débiles o bases débiles, *ue solo se disocian parcialmente. En una solución acuosa de un ácido d+bil e(iste un e*uilibrio, *ue puede medirse, entre el ácido y su base con0ugada, *ue es la sustancia *ue puede aceptar un protón y formar de nuevo el ácido; como lo indica la siguiente ecuación4 H5 6 H78

H$86 6 5-

A"#$% $&'#(

B)*+ "%,-/)$)

Estas reacciones tambi+n se pueden escribir como4 H5

H6 6 5-

1!


1. pH EN SOLUCIONES ACIDAS ACIDAS Y BASICAS BASICAS OBJETIVO: Medir el pH de diferentes sustancias de origen orgánico e inorgánico.

FUNDAMENTO TEORICO: Las disoluciones ácidas y básicas son frecuentes en la naturaleza; muchas de ellas son fluidos del organismo humano y otras son productos de uso diario. Los fluidos del organismo difieren tanto en su carácter ácido o básico como en su grado de acidez. El del estómago es el más ácido, manteniendo su pH en un intervalo bastante reducido !." # $."%. El plasma sangu&neo es ligeramente básico y su intervalo de pH es muy limitado. 'i el pH del plasma var&a sobrepasando este intervalo, la capacidad de la sangre para transportar o(&geno se reduce. )or ello es importante para la vida humana *ue las modificaciones en el pH de la sangr sangre e est+ est+n n siem siempre pre dent dentro ro de un inte interv rval alo o pe*u pe*ueo eo.. En cont contras raste te con el plas plasma ma sangu&neo, la orina presenta un amplio intervalo de pH, pudiendo ser ácida, básica o neutra. Esto es debido a *ue muchas sustancias ácidas, básicas son eliminadas por el organismo a trav+s de la orina para mantener el adecuado pH de la sangre. El m+todo más frecuentemente utilizado para medir el pH en el laboratorio es el uso de un e*uip e*uipo o deno denomi mina nado do pH-me pH-metr tro o o pote potenc nció ióme metr tro. o. El pH de una una soluc solució ión n se dete determ rmin ina a sumergiendo los electrodos del e*uipo en la misma, y se lee directamente en la pantalla digital del e*uipo. La acidez de una disolución se puede determinar tambi+n por medio de un ndicador; *ue es un compuesto orgánico *ue cambia de color dentro de un determinado intervalo de pH. /n e0emplo muy conocido es el tornasol, cuyo color es ro0o a valores de pH inferiores a 1, y azul a valores superiores a 2.1. 3e los dos m+todos posibles de medir el pH de una disolución, el pH-metro es la más precisa; los indicadores se utilizan fundamentalmente en valoraciones ácido # base. En bio*u&mica la mayor&a de sustancias ácidas y básicas son ácidos débiles o bases débiles, *ue solo se disocian parcialmente. En una solución acuosa de un ácido d+bil e(iste un e*uilibrio, *ue puede medirse, entre el ácido y su base con0ugada, *ue es la sustancia *ue puede aceptar un protón y formar de nuevo el ácido; como lo indica la siguiente ecuación4 H5 6 H78

H$86 6 5-

A"#$% $&'#(

B)*+ "%,-/)$)

Estas reacciones tambi+n se pueden escribir como4 H5

H6 6 5-

1!


disociación, La constante de e*uilibrio de la disociación de un ácido d+bil o Constante de disociación, se define como4

)  H 34A54 HA4

2!

'i despe0amos 9H 6: obtenemos4

H34  ) HA4 6! A54 omando omando el logaritmo logar itmo de ambos t+rminos4

(%/ H34  (%/ ) 3 (%/ HA4 7! A54 Multiplicando cada lado por #!4

5 (%/ H34  5 (%/ ) 3 (%/ A 54 ! HA4 )or definición4 - log 9H 6: se llama llama pH, y - log
pH 

p) 3 (%/ A 54 ! HA4

ecuación de Henderson Henderson – Hasselblach Hasselblach,, *ue relaciona el pH de una disolución Esta es la ecuación con la proporción base con0ugada=ácido sin disociar. La utilidad de esta ecuación puede observarse observarse en su aplicación aplicación a las titulacion titulaciones4 es4 muestra muestra e(actamente e(actamente como cambia el pH cuando se aade la base una disolución ácida o viceversa.

MATERIALES Y REACTIVOS: M);+<#)(+*: ! >radilla 6 ubos de ensayo $ ?ea@er !"" ml 7 )ipetas !" ml pH-Metro Lancetas ! Limón. omate, omate, vinagre, sangre, orina, huevo 3eben traer los estudiantes%.

R+)";#=%*: 5cido Alorh&drico "."! M HAl% Hidró(ido de 'odio "."! M Ba8H%

5gua destilada


PROCEDIMIENTO: PARTE I: pH $+ *%("#%,+* %,#")* !. Mar*ue los tubos de ensayo del ! al C. 7. En los tubos del ! al D prepare una serie de diluciones de HAl4 ubo !, vierta !" ml de HAl "."! M, traslade al ubo 7 un mililitro de esta solución y diluya agregando C ml de agua destilada, mezcle. ierta ! ml del ubo 7 al ubo $ y adicione C ml de agua destilada; haga lo mismo para el ubo D. Mida el pH de cada solución. $. En los tubos del 1 al 2 prepare una serie de diluciones de Ba8H4 ubo 1 vierta !" ml de Ba8H "."! m y diluya para los siguientes tubos. Mida el pH de cada solución. D. En el ubo C mezcle ! ml de HAl del ubo 7 con ! ml de Ba8H del ubo 1. 3etermine el pH de esta solución. 1. 3etermine el pH del agua destilada.

PARTE II: pH DE SOLUCIONES ORGANICAS !. Haga un zumo de cada uno de los materiales4 limón, tomate, huevo. Mida el pH de estas soluciones. 7. ierta ! ml de cada una de estas sustancias en tubos de ensayo4 vinagre, leche, orina. Mida el pH de estas sustancias. $. ome una gota de sangre con una lanceta y mida su pH.

ANALISIS DE RESULTADOS: PARTE I: !. 3efina4 pH, ácido y base. 7. Fue compuesto empleado en esta parte del laboratorio es ácido, cuál base, cuál neutroG $. Elabore un cuadro con el nmero de los tubos, las concentraciones de HAl y Ba8H, y el valor de pH obtenido para cada solución. D. >rafi*ue los resultados obtenidos. 1. Aómo cambia el pH a medida *ue el ácido se diluyeG I. Aómo cambia el pH a medida *ue la base se diluyeG


J. Fu+ ocurre en el tubo C, por*u+G

PARTE II: !. Elabore un cuadro con el nombre de la sustancia y su pH. 7. Haga un listado de las sustancias ácidas y básicas segn su resultado. $. Auál es el ácido del limónG 5 *ue concentración del HAl se pareceG

BIBLIOGRAFIA •

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?8HB'<, Kobert A. ?io*u&mica. 5ddison esley beroamericana '.5. Fuinta Edición. M+(ico. !CC2. L/F/E, Ernesto . )rácticas de bio*u&mica. /niversidad de Bario. 3epartamento de Fu&mica. /niversidad de Bario. !CC". KEB3B5, >eorge. +cnicas de bio*u&mica aplicada. Bueva Editorial nteramericana '.5. M+(ico. !CJD. EKBEK, Kudolf. Nundamentos de ?io*u&mica Moderna. Editorial 5cribia '.5. Espaa. !C22.


2. TITULACI?N POTENCIOMETRICA DE AMINOACIDOS OBJETIVOS: Encontrar los valores de p< y el punto iso+lectrico de un determinado aminoácido por medio de una titulación potenciom+trica.

FUNDAMENTO TEORICO: Los aminoácidos, debido a *ue disponen en su mol+cula de un grupo amino y un grupo carbo(ilo, tienen un marcado carácter anfótero; es decir se comportan simultáneamente como ácidos y como bases, *ue comunican tambi+n a los polip+ptidos y prote&nas de los cuales forman parte. 'e puede es*uematizar de la siguiente manera el comportamiento de un aminoácido frente a una base y a un ácido4

BH7 BH7 K # A # A88H H

BH$ 6

8H -

K # A # A88 - 6 H78 F%<@) B>*#") H BH$ 6

K # A # A88 H #

H

K # A #A88H

F%<@) N% D#*%"#)$)

I%, D#p%()< Z#;+<#%,

F%<@) "#$) H

/n aminoácido tiene, entonces, por lo menos dos constantes de e*uilibrio4 < ! y <7; *ue representan respectivamente las constantes de disociación del grupo carbo(ilo y del grupo amino. 5 su logaritmo negativo, se le denomina p<4 p< ! O -log
pI  p1 3 p2! 2


MATERIALES Y REACTIVOS: R+)";#=%*: 'olución ","1 M de determinado aminoácido asignado por el profesor Pcido clorh&drico ",! B HAl% Hidró(ido de sodio ",! B Ba8H%

M);+<#)(+*: pH # metro ! 'oporte para bureta 7 ?uretas 1" ml

! )inza para bureta 7 )ipetas !" ml 7 ?ea@ers 71" ml

PROCEDIMIENTO: !. En un bea@er colo*ue 7" ml de la solución de aminoácido y determine su pH. Llene la bureta con HAl ".! B y adicione ".1 ml, agite y mida el pH. 5dicione otros ".1 ml del mismo ácido y vuelva a medir el pH. Aontine el mismo proceso hasta alcanzar un pH de !.1. 7. En otro bea@er colo*ue 7" ml de la solución de aminoácidos, llene la bureta con el Ba8H ".!B y adicione ".1 ml, agite y lea el pH. Aontine adicionando hidró(ido hasta *ue el pH alcance un valor de !!.

RESULTADOS: !. En una sola gráfica, en papel milimetrado, represente los resultados de la titulación del aminoácido. Aolo*ue los valores de pH en las ordenadas y los mili e*uivalentes de ácido clorh&drico y de hidró(ido de sodio en las abscisas. 7. Aon base en la gráfica halle los valores de p< del aminoácido utilizado y su punto isoel+ctrico. $. Aompare los valores obtenidos con lo *ue se encuentran en literatura. En caso de *ue los dos valores difieran en más de ".1 unidades e(pli*ue la causa de la diferencia.

NOTA: 5l final de la práctica entregue al profesor una tabla de datos donde figuren los ml de HAl y de Ba8H adicionados y el pH correspondiente en cada caso. BIBLIOGRAFIA •

?8HB'<, Kobert A. ?io*u&mica. 5ddison esley beroamericana '.5. Fuinta Edición. M+(ico. !CC2.

PRACTICAS DE BIOQUIMICA TERCER SEMESTRE DE ING. AMBIENTAL •

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L/F/E, Ernesto . )rácticas de bio*u&mica. /niversidad de Bario. 3epartamento de Fu&mica. /niversidad de Bario. !CC". KEB3B5, >eorge. +cnicas de bio*u&mica aplicada. Bueva Editorial nteramericana '.5. M+(ico. !CJD. EKBEK, Kudolf. Nundamentos de ?io*u&mica Moderna. Editorial 5cribia '.5. Espaa. !C22.


6. REACCIONES DE CARACTERIZACI?N DE AMINOCIDOS OBJETIVOS: Aomprobar la presencia de determinados aminoácidos, en forma libre o haciendo parte de las prote&nas, con base en las reacciones caracter&sticas de los grupos funcionales presentes.

FUNDAMENTO TEORICO: Las reacciones de los aminoácidos son las *ue en general, corresponden a compuestos *ue contienen grupos amino y carbo(ilo. 5demás, todo grupo adicional *ue pudiera estar presente dará su propio con0unto de reacciones. Las cadenas laterales de los aminoácidos poseen grupos funcionales *ue e(perimentan importantes reacciones. 5s&, el grupo iol -'H% de la ciste&na se o(ida fácilmente por acción del o(&geno del aire o de otros agentes o(idantes suaves dando cistina, en la *ue e(iste un enlace disulfuro ' # '% entre dos mol+culas de ciste&na4 A87 8(idación BH$ - A # H 'uave 6

AH7'H L- Aiste&na

A87 -

A87 -

6

BH$ # A # H BH $ #A -H AH7 # ' # ' # AH 7 Aistina

8tra reacción importante y caracter&stica del grupo tiol de la ciste&na es la *ue tiene lugar con ciertos cationes metálicos, como Mercurio Hg 6% y )lomo )b 67% para formar mercáptidas. La sal formada es insoluble en medio acuoso. En los seres vivos, esta reacción rompe el enlace disulfuro de las prote&nas y provoca su precipitación. )or otra parte, estos cationes metálicos tambi+n reaccionan con el grupo carbó(ilo dando sales insolubles. Estas reacciones son las responsables de la to(icidad de estos cationes metálicos par la mayor&a de los seres vivos. La Binhidrina es un agente o(idante fuerte *ue reacciona con todos los Q-aminoácidos a un pH entre D y 2, para dar un compuesto de color prpura. La reacción es muy sensible por lo cual se utiliza en cromatograf&a. Las sustancias *ue, como los aminoácidos tiene grupos amino libres, reaccionan con el ácido nitroso para producir nitrógeno en forma de pe*ueas burbu0as. Esta reacción permite distinguir a los aminoácidos libres de las prote&nas ya *ue estas sólo reaccionan parcialmente y en soluciones muy concentradas.


La reacción Rantoproteica es caracter&stica de los aminoácidos *ue poseen anillos benc+nicos los cuales, cuando se calientan con ácido n&trico concentrado forman nitroderivados de color amarillo. Los compuestos *ue poseen grupos fenólicos reaccionan con el reactivo de Millon formando compuestos ro0os; esta reacción sirve para identificar a la tirosina o sus derivados. El reactivo de Nolin-Aiocalteau se emplea mucho para la determinación de tirosina en prote&nas. Aomo la proporción de este aminoácido es bastante uniforme en distintas prote&na, el m+todo es til para mezclas comple0as. 'e basa en la reacción del ncleo hidro(ifenólico con un reactivo fosfotngstico # fosfomol&bdico en medio alcalino. La prueba de Hop@ins-Aole, se basa en la reacción del anillo indólico con el ácido glio(&lico en medio fuertemente ácido y deshidratante. ambi+n se puede utilizar ácido ac+tico glacial *ue se haya e(puesto a la luz, el cual contiene ácido glio(&lico como impureza, en cantidad suficiente para *ue la reacción se manifieste. La reacción de 5cree-Kosenheim se basa en la condensación en medio ácido del anillo indólico con formaldehido para dar un compuesto amarillo verdoso de intensa fluorescencia. Los derivados del triptófano se caracterizan por ser fluorescentes, propiedad *ue se utiliza para la identificación del triptófano libre o en las prote&nas. La prueba de
MATERIALES Y REACTIVOS: R+)";#=%*: Binhidrina al ".! S en acetona Keactivo de ?iuret Pcido clorh&drico concentrado Bitrito de sodio al 1S Pcido n&trico concentrado Hidró(ido de sodio al D" S Keactivo de Millón Keactivo alcalino de Nolin Aiocalteau Keactivo de Nolin Aiocalteau diluido !47 en 5gua

Normaldeh&do al D" S ?romo al 7.2 S en ácido ac+tico Aarbonato de amonio al !" S 5cetato de plomo al !" S Hidró(ido de 'odio 7"S Bitroprusiato de sodio 1S Hielo 5cido ac+tico glacial


5cido sulfrico concentrado 'oluciones al ".! S de diferentes aminoácidos y prote&nas

M);+<#)(+*: 7 ?ea@ers 71" ml ! >radilla 6 ubos de Ensayo ! )inza para tubos de ensayo

)lancha de calentamiento ! ermómetro

PROCEDIMIENTO: 1. R+)""#, $+ () N#,#$<#,): Mezcle ! ml de la solución e(perimental case&na, aminoácidos4 glicina, lisina y metionina% con ! ml de Binhidrina y caliente a ebullición en bao mar&a, durante !" minutos. La solución debe ad*uirir un color prpura. 2. R+)""#, $+ B#<+;: 5 ! ml de la solución e(perimental case&na, glicina% se le aade 7 ml del Keactivo de ?iuret; se mezcla y se observa el cambio de color. La aparición de una coloración ro0iza violeta indica la presencia de enlaces pept&dicos. 6. P<+') $+( >"#$% ,#;<%*%: 5 ! ml de solución e(perimental lisina, arginina, case&na y gelatina% aada ".1 ml de ácido clorh&drico concentrado y luego, rápidamente ! ml de nitrito de sodio al 1S. La reacción es positiva, indicando la presencia de grupos amino libres, al desprenderse nitrógeno en forma de pe*ueas burbu0as. Esta reacción, tambi+n la dan parcialmente las soluciones de prote&na en *ue hay grupos amino libres, generalmente el grupo E -amino de a lisina, por lo cual puede observarse, por e0emplo, en una solución muy concentrada de gelatina. 7. R+)""#, ),;%p<%;+#"): a ! ml de solución e(perimental tirosina, triptófano, fenilalanina, ciste&na y case&na% adicione ! ml de ácido n&trico concentrado; mezcle bien y caliente los tubos 1 minutos en bao mar&a. La reacción es positiva, sealando la presencia de aminoácidos aromáticos, al observarse un color amarillo intenso *ue indica la nitración de los anillos aromáticos. 'i se aade gota a gota, refrigerando el tubo en un bao de agua, hidró(ido de sodio al D"S el color vira a naran0a fuerte, al disolverse los nitrobencenos en un medio fuertemente alcalino. . R+)""#, $+ M#((,: 5 ! ml de solución e(perimental tirosina, fenilalanina y gelatina% agregue 1 gotas del reactivo de Millón y caliente en un bao mar&a. 3e0e enfriar a temperatura ambiente y agregue 1 gotas de solución de nitrito de sodio al 1S; la aparición de un color ro0o ladrillo indica un resultado positivo. . P<+') $+ F%(#, 5 C#%")(;+): 5 ! ml de solución e(perimental tirosina, fenilalanina y gelatina% adicionar 7 ml del reactivo alcalino de Nolin - Aiocalteau, agitar los tubos y de0ar a temperatura ambiente durante 1 minutos, luego aadir ! ml del reactivo de Nolin - Aiocalteau diluido. 5 continuación se de0an los tubos durante 7" minutos a $1TA, en un bao de agua. La reacción es positiva para fenoles como la tirosina% al aparecer una coloración azul.


. P<+') $+ H%p#,* 5 C%(&: a ! ml de solución e(perimental triptófano, glicina, case&na% aada 7 ml de ácido ac+tico glacial y luego haga resbalar por las paredes del tubo ! ml de ácido sulfrico concentrado, de modo *ue se formen dos capas. La reacción es positiva, indicando la presencia de triptófano u otra sustancia con el anillo del indol, al formarse un anillo de color violeta en la interfase entre ambos l&*uidos, 5gitando suavemente, el color se difunde por todo el l&*uido. 8. P<+') $+ A"<+  R%*+,+#@: a ! ml de solución e(perimental triptófano, fenilalanina, gelatina% adicionar ".1 ml de formaldehido al D"S y ! ml de ácido clorh&drico concentrado; se agita bien y se de0a el tubo durante 1 minutos en bao mar&a. La reacción es positiva, indicando la presencia de sustancias con el anillo del indol, como el triptófano, al aparecer una coloración amarillo verdosa transparente. . R+)""#, $+ %%p: a ! ml de solución e(perimental histidina, arginina, case&na% se le aade gota a gota ".1 ml de bromo en ácido ac+tico, despu+s de !" minutos se adiciona ! ml de carbonato de amonio al !"S, se agita suavemente y se observa si se colorea; sino, se calienta por 1 minutos en bao mar&a. La reacción es positiva ndicando la presencia de histidina al aparecer un color azul violeta. 10. P<+') "%, )"+;);% $+ p(%@%: 5 ! ml de solución e(perimental case&na, gelatina, glicina, metionina, ciste&na y cistina% se aade ! ml de hidró(ido de sodio al D" S y se calienta en bao mar&a durante diez minutos. 'e enfr&an los tubos en un bao de hielo, se aaden ".1 ml de acetato de plomo al !"S, se agita bien y se observa el oscurecimiento progresivo de la solución. 11. P<+') "%, ,#;<%p<*#);%: 5 ! ml de solución e(perimental triptófano, metionina y ciste&na% aada ! ml de hidró(ido de sodio al 7"S, ".1 ml de glicina al ".!S y ".1 ml de nitroprusiato de sodio al 1S; caliente en bao mar&a durante 1 minutos. La aparición de un color ro0o intenso es prueba positiva para metionina. La histidina inhibe la reacción, pero esta inhibición es eliminada por la glicina. Kepita la prueba anterior con los mismos aminoácidos pero adicionando inicialmente ! ml de histidina a cada uno y omitiendo la adición de glicina. 5ntes de botar el residuo de los tubos de ensayo a la caer&a alcalinice cada uno con 7 o $ ml de hidró(ido de sodio al 7"S.

RESULTADOS4 !. 5note sus resultados en una tabla indicando cuales pruebas fueron positivas y cuales negativas. E(pli*ue las razones de estos resultados. 7. En los casos en los cuales el resultado de las pruebas fueron negativos, e(pli*ue la causa.


BIBLIOGRAFIA •

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7. DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE JELDAHL OBJETIVOS: 3eterminar el contenido de nitrógeno y el contenido de prote&na, en porcenta0e, en una muestra vegetal o animal, mediante el m+todo de <0eldahl.

FUNDAMENTO TEORICO: Las prote&nas constituyen un grupo de biomol+culas muy importantes, puesto *ue son las responsables de muchas funciones biológicas4 como la formación de te0idos y la actividad enzimática. Aonocer los contenidos de prote&nas presentes en los te0idos, ha sido ob0eto de varios estudios y en consecuencia se han desarrollado muchas t+cnicas de análisis. E(isten varios m+todos mediante los cuales se puede determinar el contenido de prote&na bruta, prote&na real y nitrógeno no proteico en muestras tanto de origen vegetal como de origen animal.

MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS Estos m+todos son particularmente tiles en la valoración del contenido de prote&na real, puesto *ue se basan en la formación de comple0os coloreados entre algunos aminoácidos proteicos ó el enlace pept&dico, con reactivos espec&ficos. 3entro de los m+todos clásicos está el *ue emplea el reactivo de ?iuret, el cual se fundamenta en la formación de un comple0o coordinado entre los iones cpricos del reactivo y el enlace pept&dico de la prote&na, reacción *ue transcurre en medio alcalino. ambi+n es de uso frecuente el m+todo *ue emplea la espectrofotometr&a con base en la reactivo de Nolin. En los dos casos anteriores, se elaboran curvas de calibración con una prote&na patrón, normalmente la albmina de huevo o la albmina bovina estabilizada estándar, y en las mismas condiciones de reacción se hace el desarrollo de la coloración para la muestra *ue se est+ analizando.

MTODOS VOLUMTRICOS 3entro de estos m+todos está el de <0eldahl, el cual se fundamenta en la conversión del nitrógeno total presente en la muestra a sales de amonio *ue son posteriormente valoradas por volumetr&a ácido base. El m+todo de <0eldahl consta de tres etapas *ue en su orden son4 digestión de la muestra, destilación con arrastre de vapor del amoniaco producido y valoración ácido base de este amoniaco. En la primera etapa, el hidrógeno y el o(&geno proteico, son o(idados hasta dió(ido de carbono y agua, mientras *ue el nitrógeno es convertido en sulfato de amonio, por la acción de un agente o(idante en medio ácido y con la ayuda de un catalizador. 'e han desarrollado diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador ó el agente o(idante, pero en todos los casos, el ob0etivo final de la etapa de digestión es el de convertir el nitrógeno proteico en sulfato de amonio.


En la etapa siguiente, mediante la acción de una base fuerte, generalmente hidró(ido de sodio al D"S, se libera el amon&aco de la sal de amonio. Auando la valoración se va a efectuar por retroceso, el amoniaco liberado se arrastra con vapor y se recoge sobre un volumen e(actamente medido de un ácido estándar. /na variante utilizada comnmente, consiste en recibir el amoniaco hidró(ido de amonio% sobre ácido bórico apro(imadamente al DS de tal manera *ue se forma borato de amonio, el cual se titula directamente. En la etapa final, se hace la valoración de acuerdo con el proceso empleado para la recolección. 5s& por e0emplo, si el hidró(ido de amonio, se recibió sobre un volumen e(actamente medido de un ácido estándar, la titulación se hace con una base valorada y en presencia de un indicador adecuado, de tal manera *ue se determina el ácido *ue no reaccionó con el hidró(ido de amonio destilado y por diferencia, se calcula el hidró(ido de amonio producido. En la variante de 'teyemar@, el hidró(ido de amonio se recoge sobre ácido bórico no valorado y luego se titula directamente el borato de amonio *ue se forma, con un ácido estándar.

R+)""#%,+* @&;%$% -+($)(  V)<#),;+ S;+K+@)< Digestión: )rote&nas% 6 H 7'8Dc% 6 Aatalizadors%

A87g% 6 H78g%6 BHDH'8Dac% U

Liberación de NH 34 BHDH'8Dac% 6 7Ba8Hac% Arrastre con vapor 4 BH$g% 6 H78g%

BH$g% 6 Ba7'8Dac% 6 H78g%

BHD8Hac%

Recolección: BHD8Hac% 6 H$?8Dac%

BHDH7?8D 6 H78

Titulación: BHDH7?8Dac% 6 HAac%

BHDAac% 6 H$?8Dac%

El cálculo del porcenta0e de prote&na en una muestra no es totalmente e(acto pero si bastante apro(imado. 'e basa en el hecho de *ue en una muestra animal o vegetal casi todo el nitrógeno presente se encuentra formando parte de las prote&nas y dentro de estas el B 7 constituye apro(imadamente el !IS en peso.

P<%;+,)N#;</+,%  1001  .2 8 sea *ue multiplicando la cantidad de nitrógeno obtenida por I.71 se tiene la cantidad apro(imada de prote&na presente en una muestra dada.


MATERIALES Y REACTIVOS: R+)";#=%*: Mezcla catalizadora ndicador de ashiro Pcido sulfrico concentrado HAl ".! B Keactivo de Hidró(ido de sodio # iosulfato de sodio ndicador de Pcido ?órico Material ?iológico harina de fr&0ol, ma&z, soya, leche, clara de huevo o cual*uier otro material biológico%

M);+<#)(+*: ! ?alón para <0eldahl ! )ipeta !" ml ! )era ! ?ea@er 1" ml ! Erlenmeyer !71 ml

! ?ureta 1" ml ! )inza para bureta ! 'oporte ?alanza 5nal&tica E*uipo de digestión y destilación <0eldahl

PROCEDIMIENTO: D#/+*;#,: En un balón <0eldahl, limpio y seco, agregue ".1 g e(actamente pesados de material biológico sólido o ! ml si el material es li*uido; adicione !" ml de reactivo de digestión. )rocure *ue el reactivo llegue al fondo del balón y no *uede adherido a las paredes. 3e no ser as& aydelo a ba0ar con una pe*uea cantidad de agua destilada. Aolo*ue el balón en el digestor y caliente en resistencia media durante 7" minutos; despu+s de transcurrido este tiempo aumente la calefacción al má(imo durante $" minutos hasta *ue el contenido ad*uiera un tono verde amarillento. 5l cabo de este tiempo apague el digestor y de0e enfriar el balón.


Balón con muestra, mezcla catalizadora

D+*;#()"#,: Encienda el microdestilador con el fin de *ue el agua *ue va a generar el calentamiento se encuentre en ebullición en el momento de adicionar la muestra. Lave el balón *ue contiene la muestra con !" ml de agua destilada con el fin de solubilizarla y llene con esta solución la parte superior del e*uipo de destilación, asegurándose *ue la llave de paso se encuentre abierta. uelva a en0uagar el balón con 7 porciones de !" ml de agua destilada y llene la muestra en el e*uipo. 5 continuación agregue !" ml de reactivo de Hidró(ido de sodio # iosulfato de sodio; note *ue la muestra se oscurece. En el otro e(tremo del destilador colo*ue un bea@er pe*ueo con !" ml de indicador de Pcido ?órico, la punta del refrigerante debe *uedar sumergida en la solución indicadora. 'obre esta solución se recogen de $" a D" ml de destilado hasta *ue la solución cambie de violeta a azul o verde esmeralda. 3espu+s de la destilación de la muestra se debe hacer un lavado del e*uipo con agua destilada.


Deposito de

Balón con a ua

Beaker con Indicador de Ácido

T#;()"#,: ransfiera el destilado a un erlenmeyer y titule con el 5cido Alorh&drico ".! B hasta obtener una coloración similar a la del ácido bórico original.

B(),"%: 'imultáneamente con las muestras se debe realizar todo el proceso anterior con un blanco, en el cual la muestra biológica se reemplaza por una cantidad e*uivalente de agua destilada.

RESULTADOS: 3etermine el porcenta0e de Bitrógeno y el porcenta0e de )rote&na en la muestra biológica utilizada. Aompare estos resultados con los *ue se encuentran en la literatura. El S de Bitrógeno presente en la muestra se puede determinar utilizando la siguiente fórmula4  N  1700 V@  V'! N P@


3onde4 m O olumen de HAl en ml gastado en la titulación de la muestra b O olumen de HAl en ml gastado en la titulación del blanco B O Bormalidad del HAl )m O )eso de la muestra en mg El S de )rote&na se lo puede determinar mediante la siguiente relación4

 P<%;+,)  N#;</+,%  .2 BIBLIOGRAFIA •

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. INFLUENCIA DE DIVERSOS FACTORES EN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA OBJETIVOS: 8bservar el efecto de las variaciones de temperatura, pH, concentración de iones metálicos y enzima sobre una reacción enzimática.

FUNDAMENTO TEORICO: Las enzimas son prote&nas producidas por el organismo, *ue catalizan reacciones biológicas espec&ficas. Estos compuestos controlan las distintas reacciones *ue se producen en la c+lula, y tambi+n controlan *u+ reacciones tienen lugar y a *u+ velocidad transcurren. Las enzimas son sensibles a las variaciones de pH del medio; la desnaturalización o rotura de la estructura tridimensional de una prote&na, supone para las enzimas la p+rdida de su actividad catal&tica. odas las enzimas poseen su má(ima actividad en un pe*ueo intervalo de pH cuyo valor medio se denomina pH óptimo. La actividad de las enzimas puede ser controlada tambi+n limitando la cantidad de compuesto en la c+lula *ue forma el comple0o enzima # sustrato. 5s&, aumentando o disminuyendo tanto la cantidad de sustrato como la de la enzima puede controlarse la velocidad de las reacciones *u&micas *ue tienen lugar en la c+lula. La presencia de iones de metales pesados tambi+n afecta la actividad de las enzimas; por e0emplo los iones de )lomo )b 67% y Mercurio Hg67% reaccionan con los grupos iol y Aarbo(ilato de las prote&nas y enzimas destruyendo su capacidad para mantener su estructura; estos iones se conocen entonces como Inhibidores de la actividad enzimática. La acción de un inhibidor implica la fi0ación de +ste a alguna forma de la enzima, lo *ue da como resultado una p+rdida total o parcial de la actividad de la enzima para transformar sustratos en productos. En esta práctica se va a ensayar la acción de algunos de estos factores sobre la alfa-amilasa, una enzima *ue en el hombre se encuentra presente en la saliva y en el páncreas.

MATERIALES Y REACTIVOS: R+)";#=%*: 5lmidón al !S en BaAl ".""1M Aloruro mercrico al !S 'olución amortiguadora de pH $ 'olución amortiguadora de pH 1 'olución amortiguadora de pH I 'olución amortiguadora de pH J 'olución amortiguadora de pH C

)epsina ".! S Keactivo de lugol Bitrato de plomo al !S Hielo


M);+<#)(+*: ! ?ea@er !"" ml 7 ?ea@ers 71" ml ! Embudo de vidrio ! 5ro metálico ! 'oporte ! >radilla 6 ubos 6 )inza

! ermómetro ! )ipeta 1 ml ! arilla de vidrio ! >radilla inmunológica 5lgodón )lancha de calentamiento

PROCEDIMIENTO: 1. P<+p)<)"#, $+ () )@#()*) *)(#=)(: 'e en0uaga la boca 7 o $ veces con agua para eliminar los restos de alimentos. 'e miden en una probeta 1" ml de agua destilada y con ella se en0uaga la boca, en varios buches, por espacio de unos 7 o $ minutos, cada buche. El l&*uido recogido se filtra a trav+s de un algodón y !" ml de este filtrado se diluyen con agua destilada hasta completar !"" ml. Esta solución, *ue en adelante se denominara A@#()*) S)(#=)(, será la *ue se utilice en la realización de las distintas partes de la práctica. 2. I,(+,"#) $+ () ;+@p+<);<) *%'<+ () )";#=#$)$ $+ () )@#()*) *)(#=)(: 'e rotulan cuatro tubos de ensayo ", 7", D" y C". En cada uno se vierten 7 ml de suspensión de almidón al ! S. El tubo " se coloca, durante diez minutos en bao de hielo; el tubo 7" se de0a a temperatura ambiente, el tubo D" y el tubo C" se colocan respectivamente, en un bao de agua a esas temperaturas durante diez minutos. 5 cada tubo, sin retirarlo del bao, se le agregan ".1 ml de amilasa salival; se agitan bien los tubos y se de0an durante un minuto a las condiciones de temperatura anteriormente sealadas. 5l cabo de este tiempo se colocan 1 gotas del contenido del tubo " en una concavidad de una gradilla inmunológica a la *ue previamente se le hab&an adicionado 7 gotas del reactivo de lugol, y se observa el color producido. El mismo procedimiento se repite con el contenido de los tubos 7", D" y C". 'i el color en la concavidad es amarillo oscuro se da por terminada la prueba. 'i el color es azul se esperan otros cinco minutos y se repite la prueba con el lugol. La temperatura óptima será a*uella en la cual se observe más rápidamente el color amarillo ocre. 6. I,(+,"#) $+( pH +, () )";#=#$)$ +,#@>;#"): Kotule cinco tubos de ensayo $, 1, I, J y C; depos&telos en un bao de agua a la temperatura óptima obtenida en la parte anterior% y agregue, en su orden, sin retirarlos del bao, las sustancias *ue se indican a continuación4 T'% 5lmidón ".1S 5mortiguador pH $ 5mortiguador pH 1 5mortiguador pH I 5mortiguador pH J 5mortiguador pH 2 5milasa salival

6 7ml Dml ".1ml

 7ml Dml ".1ml

 7ml Dml ".1ml

 7ml Dml ".1ml

 7ml Dml ".1ml

3espu+s de $ minutos deposite cinco gotas del tubo $ en una concavidad de la gradilla inmunológica en la *ue previamente hab&a depositado 7 gotas del reactivo de lugol y observe


el color producido. Kepita el mismo procedimiento con los demás tubos. El pH óptimo para la alfa-amilasa corresponde a a*uel tubo donde se obtenga más rápidamente el color amarillo ocre. En caso de *ue no se observe este color en ninguno de los ensayos se repite el procedimiento cada $" segundos hasta *ue el cambio se d+.

7. I,(+,"#) $+ () "%,"+,;<)"#, $+ +,#@) +, () )";#=#$)$ +,#@>;#"): Kotule cuatro tubos de ensayo !, 7, $ y D. 3epos&telos en un bao de agua a la temperatura óptima y, sin sacarlos de all&, agregue, en su orden4 T'% 5lmidón ".1 S 5mortiguador de pH óptimo 5milasa salival

1 D ml 1.C ml ".! ml

2 D ml 1.J ml ".$ ml

6 D ml 1.! ml ".C ml

7 D ml $.$ ml 7.J ml

Kealice los mismos ensayos *ue para determinar la temperatura y el pH óptimos. Encuentre la concentración óptima de enzima.

. E*p+"##"#$)$ $+ () +,#@): Kotule 7 tubos de ensayo amilasa, pepsina y depos&telos en un bao de agua a la temperatura óptima. 'in sacarlos de all& agregue, en su orden4 T'%

A@#()*)

P+p*#,)

5lmidón ".1 S 5mortiguador de pH óptimo 5milasa salival )epsina ".!S

7 ml D ml ! ml -

7 ml D ml ! ml

'iga el mismo procedimiento *ue en los casos anteriores.

. E+";% $+ (%* #%,+* @+;>(#"%* p+*)$%* *%'<+ () )""#, $+ () )@#()*): Kotule tres tubos de ensayo amilasa, Hg y )b depos&telos en un bao de agua a la temperatura óptima y agregue, en su orden4 T'%

A@#()*)

H/32

P'32

5lmidón ".1 S 5mortiguador pH óptimo HgAl7 !S )bB8$%7

7 ml ! ml -

D ml ! ml -

D ml ! ml

Kepita el procedimiento de los casos anteriores y determine el efecto de los iones metálicos pesados sobre la amilasa.

. E+";% $+ () "%,"+,;<)"#, $+ **;<);%: Kotule cinco tubos de ensayo ".1, !.", 7.". $." y D.", depos&telos en un bao de agua a la temperatura óptima y, agregue en su orden4


T'% 'olución 5lmidón !S 5mortiguador pH óptimo 5milasa salival

0.

1.0

2.0

6.0

7.0

".1 ml C." ml ".1 ml

!." ml 2.1 ml ".1 ml

7." ml J.1 ml ".1 ml

D." ml 1.1 ml ".1 ml

2." ml !.1 ml ".1 ml

Aada minuto e(traiga $ gotas de cada tubo y ensaye la presencia de almidón con ! gota del reactivo de lugol. 5note el tiempo re*uerido para la aparición del color ro0o pardo.

RESULTADOS: !. 3etermine los parámetros óptimos de la enzima utilizada en la práctica. 7. nvestigue sobre los efectos de las otras enzimas utilizadas en el laboratorio y de la influencia de los metales pesados.

BIBLIOGRAFIA •

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. IDENTIFICACI?N DE CARBOHIDRATOS OBJETIVOS: dentificar y reconocer algunos carbohidratos mediante reacciones caracter&sticas.

FUNDAMENTO TEORICO: Los carbohidratos son polihidro(ialdeh&dos, polihidro(icetonas o compuestos *ue, por hidrólisis, se convierten en a*u+llos. /n carbohidrato *ue no es hidrolizable a compuestos más simples se denomina M%,%*)"><#$%. /n carbohidrato *ue por hidrólisis da dos mol+culas de monosacárido se conoce como P%(#*)"><#$%. 3e acuerdo a su función *u&mica los carbohidratos se pueden clasificar como aldosas y cetosas, segn posean la función aldeh&do -AH8% o cetona -A88%; además en su estructura poseen grupos hidró(ilo -8H%. 3e acuerdo con lo anterior los carbohidratos e(perimentan las reacciones caracter&sticas de los grupos funcionales hidró(ilo y carbonilo. )or e0emplo, todos los monosacáridos y algunos disacáridos reaccionan con los reactivos de ollens y de Nehling4 el agente o(idante del reactivo de ollens es el ion 5g 6 y el del reactivo de Nehling el ion Au 67. Los monosacáridos reducen los iones Au67 a ó(ido cuproso Au 78% y los iones 5g 6 a plata metálica. 3ebido a este comportamiento, los monosacáridos reciben el nombre de A")<+* R+$";%<+*. Estas reacciones no permiten diferenciar entre aldosas y cetosas. Aomo aldeh&dos *ue son, las aldosas reaccionan con fenilhidracina para generar fenilhidrazonas. 'i se emplea un e(ceso de fenilhidracina, la reacción contina hasta dar productos conocidos como O*)%,)* *ue contienen dos residuos de fenilhidracina por mol+cula. /na de las dificultades *ue presenta el traba0o con carbohidratos lo manifiesta su tendencia a formar 0arabes; el tratamiento con fenilhidracina convierte carbohidratos en osazonas sólidas, *ue se pueden aislar y purificar con facilidad, y *ue tambi+n pueden identificarse por sus formas cristalinas caracter&sticas. La prueba de Molisch, es una reacción general para los carbohidratos; estos se deshidratan en presencia de ácido concentrado, dando un derivado de tipo furfural. 'e condensa el furfural con Q-Baftol y se obtiene un color ro0o a violeta. /na reacción negativa en una sustancia dada puede aceptarse como prueba de ausencia de carbohidratos. El ácido n&trico o(ida tanto al grupo aldeh&do como al grupo alcohol primario terminal de los monosacáridos, produciendo ácidos mono y dicarbo(&licos *ue reciben el nombre general de ácidos sacáricos. El ácido msico es el menos soluble en agua, de todos los ácidos sacáricos. Esta caracter&stica facilita la identificación de la galactosa o de los azcares *ue la contienen. La prueba de ?ial es til en la identificación de pentosas, esta se utiliza frecuentemente para reconocer la presencia de ácidos nucleicos, debido a la reacción *ue produce con la ribosa contenida en los nucleótidos.


MATERIALES Y REACTIVOS: R+)";#=%*: Pcido ac+tico 71S Keactivo de Molisch Aarbón activado Pcido sulfrico concentrado >lucosa 7S Pcido n&trico concentrado Nructosa 7S Nenilhidracina 'acarosa 7S Keactivo de Nehling 5 Maltosa 7S Keactivo de Nehling ? >alactosa 7S Keactivo de ?enedict Lactosa 7 S Keactivo de ?arfoed 5rabinosa 7S Keactivo de 'eliVanoff Rilosa 7S Keactivo de ?ial 5lmidón ".1S Keactivo de Lugol 3e(trina ".1 S Hielo Leche, miel de abe0as, gaseosa o 0ugos sin color, clara de huevo Aada grupo debe traer estos materiales%

M);+<#)(+*: ! >radilla 6 ubos 6 )inza 7 ?ea@er 71" ml ! arilla de idrio $ )ipetas 1 ml D ubos tapa rosca ! >otero

! 5ro metálico ! )robeta 1" ml ! Embudo de vidrio ! )apel filtro Aentrifuga pH-metro

PROCEDIMIENTO: 1. P<+p)<)"#, $+ ()* @+*;<)* '#%(/#")*: M#+( $+ )'+-)*: 3isuelva !" gramos de miel de abe0as en agua destilada hasta completar !"" ml. 'i es necesario, caliente suavemente, con agitación constante, dentro de un bao mar&a. L+"+: 3eposite !"" ml de leche en un bea@er de precipitados de 71" ml. 5dicione ácido ac+tico al 71 S, gota a gota y agitando despu+s de cada adición hasta *ue se produzca un floculo o un precipitado. En ese momento el pH debe estar cercano a D.2. Aentrifugue a $""" rpm durante 1 minutos. 3eseche el precipitado y utilice el sobrenadante para determinar los azcares presentes en la leche. C()<) $+ +=%: 3entro de una probeta mida el volumen de una clara de huevo. 5gregue cinco veces su volumen en agua y agite bien. Aon esta solución se harán las pruebas para determinar los azcares presentes.


J/%* K '+'#$)*: 'e pueden utilizar directamente si son transparentes. 'i no lo son, a !"" ml de 0ugo o bebida se le adiciona una cucharada pe*uea de carbón activado, se agita bien, se de0a en reposo !1 minutos y se filtra a trav+s de papel filtro. El filtrado debe resultar transparente e incoloro. 3e no ser as&, se puede agregar al filtrado otra pe*uea cantidad de carbón activado, agitar y volver a filtrar a trav+s de un nuevo papel de filtro. En el caso de las bebidas gaseosas es conveniente eliminar previamente el gas carbónico por trasvase sucesivo de un recipiente a otro. OJO: En todas las pruebas va a utilizar 7 ml de su muestra biológica, además de los carbohidratos *ue se mencionan en cada caso. NOTA: 3ebido a *ue la prueba del ácido mcico es la más demorada se recomienda comenzar la práctica con esta prueba. 2. P<+') $+ M%(#*" p)<) <+"%,%"#@#+,;% $+ ")<'%#$<);%* 4 Aarbohidratos4 muestras biológicas, glucosa, fructosa, sacarosa y almidón%. 5 7 ml de cada una de las soluciones de carbohidrato agregue 1 gotas del reactivo de Molisch y agite. Luego, se de0an resbalar por las paredes del tubo de ensayo 7 ml de ácido sulfrico concentrado. 'i hay carbohidratos presentes, en la interfase entre los dos l&*uidos debe aparecer un anillo color violeta. 6. P<+') $+( >"#$% @*#"% p)<) <+"%,%"#@#+,;% $+ /)()";%*)4 Aarbohidratos4 muestras biológicas, glucosa. galactosa y lactosa%. 5 7 ml de solución de carbohidrato en tubos de ensayo diferentes, adicione 7 ml de ácido n&trico concentrado y caliente en bao mar&a hasta *ue el volumen dentro del tubo de ensayo sea la mitad del original y la solución ad*uiera un color amarillento ! hora apro(imadamente%. 'a*ue los tubos del agua hirviente, d+0elos enfriar y luego depos&telos en un bao de hielo. /n fino precipitado blanco indica la presencia de ácido mclco y consecuentemente de galactosa. 'i no se produce la cristalización espontánea se puede inducir rascando las paredes internas de los tubos de ensayo, sin sacarlos del bao de hielo, con una varilla de vidrio limpia o de0ando los tubos dentro de la nevera durante la noche. 7. P<+') $+ %*)%,)* p)<) <+"%,%"#@#+,;% $+ )")<+*: Aarbohidratos4 muestras biológicas, glucosa, fructosa, galactosa y sacarosa%. 5 ! ml de solución de fenilhidrazina agregue 7 ml de la solución de carbohidrato. 5gite y caliente en un bao de agua hirviendo durante !" minutos. 8bserve la formación de cristales. Aompare los cristales de las muestras biológicas con los de los otros tubos. . E,*)K%* p)<) )")<+* <+$";%<+*: R+)""#, $+ F+(#,/: Aarbohidratos4 muestras biológicas, glucosa, fructosa, sacarosa y almidón%. En un tubo de ensayo mezcle 7 ml de la solución de Nehling 5 con 7 ml de la solución de Nehling ? y de inmediato agregue ! ml de la solución de carbohidrato. 5gite e introduzca los tubos en un bao de agua hirviente, durante !1 minutos. La aparición de una coloración verde, amarilla, anaran0ada, ro0iza o de un precipitado ro0o segn la concentración del material reductor% indica la presencia de un azcar reductor.


R+)""#, $+ B+,+$#";: 5gregue ! ml de la solución de carbohidrato a 7 ml del reactivo de ?enedict. 5gite y caliente en un bao de agua hirviente durante 1 minutos. La formación de un precipitado ro0o amarillento indica la presencia de un carbohidrato reductor. . P<+') $+ B)<%+$ p)<) $#*;#,/#< +,;<+ @%,%*)"><#$%* K $#*)"><#$%*4 Aarbohidratos4 muestras biológicas, glucosa, fructosa, maltosa y lactosa%. 5 7 ml del reactivo de ?arfoed agregue ! ml de la solución de carbohidrato y agite. Aaliente el tubo en un bao de agua hirviente durante 1 minutos. La aparición de un precipitado ro0o-amarillento indica la presencia de un monosacárido; los disacáridos reductores se demoran más en producir el mismo precipitado. . P<+') p)<) <+"%,%"#@#+,;% $+ "+;%,)*: Aarbohidratos4 muestras biológicas, glucosa, fructosa, sacarosa%4 5 7 ml del reactivo de 'eliVanoff agregue ! ml de la solución de carbohidrato y caliente en un bao de agua hirviendo. El desarrollo de un color ro0o intenso en pocos minutos es prueba positiva para cetohe(osas. Las aldosas dan pruebas más d+biles y despu+s de un tiempo mayor. 8. P<+') $+ B#)( p)<) <+"%,%"+< p+,;%*)*: Aarbohidratos4 muestras biológicas, (ilosa, arabinosa, glucosa%. 5 ! ml de la solución de carbohidrato agregue $ ml del reactivo de ?ial. 5gite y caliente en un bao de agua hirviendo. La aparición de una coloración azul verdosa en unos pocos minutos, es una prueba positiva para pentosas. . R+"%,%"#@#+,;% $+ p%(#*)"><#$%* "%, +( <+)";#=% $+ L/%(: Aarbohidratos4 muestras biológicas, glucosa, de(trina, almidón%. 5 ! ml de la solución de carbohidrato agregue 7 gotas del reactivo de Lugol y agite. En el caso del almidón se debe obtener un color azul oscuro mientras *ue con de(trina la coloración es pardo ro0iza. RESULTADOS: !. Aolo*ue en una tabla en forma horizontal los carbohidratos ensayados y en forma vertical las pruebas realizadas. ndi*ue con 6, - o G si los resultados fueron positivos, negativos o dudosos. 7. Aompare los resultados obtenidos entre las muestras biológicas y los diferentes carbohidratos preparados en el laboratorio. Aon base en esto deduzca *u+ carbohidratos se encuentran presentes en las muestras biológicas con las cuales traba0ó.

BIBLIOGRAFIA •

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. DILISIS DE CARBOHIDRATOS OBJETIVOS: Aonocer el proceso de diálisis utilizando soluciones concentradas de carbohidratos.

FUNDAMENTO TEORICO: /na membrana *ue permite el paso de mol+culas e iones pe*ueos, pero *ue retiene las mol+culas grandes y las part&culas coloidales, se denomina M+@'<),) D#)(#),;+; El paso selectivo de pe*ueas mol+culas o iones en cual*uier sentido a trav+s de una membrana dializante se denomina D#>(#*#*. El proceso de diálisis consiste en una bolsa formada por una membrana dializante, tal como una ve0iga animal o papel celofán; la bolsa contiene una mezcla de coloides, mol+culas e iones disueltos *ue se coloca en un recipiente por el *ue circula agua pura. El agua arrastra los iones y mol+culas *ue pasan a trav+s de la membrana, mientras *ue los colides permanecen. La importancia de las membranas dializantes al permitir el paso de sólo ciertas sustancias se pone de manifiesto en los riones, *ue aprovechan el fenómeno de diálisis para mantener el e*uilibrio de soluto y electrólito en la sangre. La principal misión de los riones es limpiar la sangre eliminando los productos de desecho del metabolismo, as& como controlar la concentración de electrólitos. Esta t+cnica se aplica en la purificación de prote&nas y polisacáridos.

MATERIALES Y REACTIVOS4 R+)";#=%*: 5lmidón al ! S >lucosa al !"S 5gua destilada

Keactivo de ?enedict Keactivo de Lugol

M);+<#)(+*: 7 )ipetas 1 ml >radilla 6 D tubos de ensayo ! 'oporte ?ao Mar&a ! )inza con nuez ! ?ea@er 71" ml )apel celofán Aada grupo debe traer este material%


PROCEDIMIENTO: 3eposite $ ml de almidón al ! S y 1 ml de glucosa al !" S dentro de una bolsa de celofán si no dispone de una hágala usted mismo uniendo los e(tremos de un trozo de papel de celofán%. Aierre la bolsa con un hilo, cu+lguela de un soporte e introduzca el con0unto dentro de un bea@er con agua destilada, de tal manera *ue los dos l&*uidos # el agua y la solución a dializar # *ueden más o menos al mismo nivel; se debe procurar *ue la bolsa no to*ue las paredes ni el fondo del bea@er. Aon un alfiler abra un pe*ueo hueco en un punto situado arriba del nivel del l&*uido; este orificio sirve para la salida del aire y el posible escape del l&*uido interior sin *ue e(plote la bolsa. 3e0e el con0unto en esta posición durante C" minutos, agitando de vez en cuando y en forma suave, el bea@er. ranscurrido este tiempo, rotule cuatro tubos de ensayo !, 7, $ y D. En los tubos ! y 7 deposite 7 ml de la solución a dializar. En los tubos $ y D deposite 7 ml del l&*uido del bea@er. 5 los tubos ! y $ agr+gueles 7 ml del reactivo de ?enedict y coló*uelos en un bao de agua hirviendo, durante diez minutos, 8bserve si aparece un color ro0o o anaran0ado. 5 los tubos 7 y D agr+gueles 7 gotas del reactivo de Lugol y observe si aparece un color azul oscuro indicativo de la presencia de almidón.

RESULTADOS: ndi*ue en *u+ casos% el resultado fue positivo 6% o negativo -%. En base a sus resultados deduzca si hubo diálisis o no.

BIBLIOGRAFIA •

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8. DETERMINACI?N DE NDICES EN GRASAS Y ACEITES OBJETIVOS: 3eterminar los &ndices de saponificación, acidez, peró(idos y yodo de una grasa o aceite.

FUNDAMENTO TEORICO: /n análisis *u&mico completo de las grasas o aceites encontrados en la naturaleza es un procedimiento bastante dispendioso. Hay varias formas de caracterizar las grasas o aceites o sus ácidos grasos componentes. /na de las t+cnicas más utilizadas es la cromatograf&a de gases *ue permite una separación y una cuantificación bastante precisa de los ácidos grasos. 'in embargo, cuando no se dispone de este e*uipo hay otras mediciones como4 &ndice de saponificación, &ndice de acidez, &ndice de peró(idos, &ndice de yodo; *ue dan una información til acerca de la composición y pureza de una grasa o aceite determinados. Índice De Peróxidos: El 87 atmosf+rico acta sobre la grasa produciendo la o(idación de los ácidos grasos al fi0arse átomos de 8 7 a su cadena, inicialmente en los dobles enlaces, dando lugar a peró(idos. Este fenómeno se acelera por la acción de la luz y el calor. 'u determinación se basa en la capacidad de los peró(idos generados en la o(idación de las grasas% de liberar yodo del yoduro potásico en presencia de ácido ac+tico y la posterior valoración de a*uel. Este &ndice es un indicativo del grado de rancidez de una grasa o aceite. Índice De Acidez: La acidez es consecuencia del contenido en ácidos grasos libres en una grasa o aceite, provenientes de la hidrólisis de los glic+ridos. 'e e(presa normalmente como >rado de 5cidez o 5cidez libre *ue representa el porcenta0e de dichos ácidos e(presados en ácido oleico. ambi+n puede e(presarse como &ndice de acidez, *ue es el nmero de miligramos de <8H necesarios para neutralizar ! g de grasa. Índice De Saponificación4 Es una medida apro(imada del peso molecular promedio de los ácidos grasos. 'e define como el nmero de mg de <8H *ue se necesitan para neutralizar los ácidos grasos contenidos en ! g de grasa. Este &ndice da una idea de la longitud de la cadena de ácidos grasos presentes en el l&pido ya *ue entre más corta la cadena de ácido graso mayor será el nmero de radicales de #A88H por gramo. 5 mayor &ndice de saponificación menor longitud de la cadena de ácido graso.


Índice De Yodo 'on los gramos de yodo absorbidos por !"" gramos de grasa. Medida de las insaturaciones presentes en los ácidos grasos *ue conforman un K>LAEK38. Este &ndice es una propiedad *u&mica relacionada con la insaturación, con el Wndice de Kefracción y con la densidad4 a mayor Wndice de yodo, mayor Wndice de refracción y mayor densidad. Los aceites comestibles contienen buena cantidad de ácidos grasos insaturados, dando ndice de yodo relativamente altos. E(iste relación entre el grado de insaturación y el grado de enranciamiento, puesto *ue los glic+ridos de ácidos grasos con 7 o $ dobles enlaces son más sensibles a la o(idación.

MATERIALES Y REACTIVOS: R+)";#=%*: <8H ".1 B en Etanol Xoduro de potasio al !"S Pcido clorh&drico ".1 B iosulfato de sodio ".! B Nenolftale&na al ".1 S en Etanol 5lmidón al !S Xodo ".7 M en ácido ac+tico glacial Etanol al C1S Aloroformo Pcido ac+tico glacial4 cloroformo $47% Hidró(ido de potasio ".! B 5gua destilada >rasa o de aceite vegetal fresco Aada grupo debe traer este material%

M);+<#)(+*: 7 ?alones fondo plano 71" ml 7 Aondensadores 7 ?ea@ers D"" ml Mangueras 7 ?uretas 1" ml D Aorchos D Erlenmeyer 71" ml

7 ?ea@ers 71" ml 7 Mecheros 7 ripodes 7 )lacas de cerámica 7 )inzas con nuez ! )inza para bureta

PROCEDIMIENTO: 1. ,$#"+ $+ *)p%,##")"#,: En un erlenmeyer colo*ue !.1 g e(actamente pesados% de grasa o de aceite. 5gregue !1 ml de hidró(ido potásico alcohólico y conecte a un condensador de reflu0o refrigerado por agua. Aaliente en un bao de agua hirviendo durante $" minutos. 3e0e enfriar a temperatura ambiente y titule con ácido clorh&drico ".1 B, utilizando fenolftale&na como indicador. Kepita el mismo procedimiento anterior pero utilizando !.1 ml de agua en lugar del aceite. Este es el blanco. En ambos casos anote los valores obtenidos en la titulación.


2. ,$#"+ $+ K%$%: )ese !." g de aceite o grasa% y disu+lvalo en !" ml de cloroformo. 5gregue, e(actamente. !" ml de yodo ".7 M en ácido ac+tico glacial. ape, agite y de0e en reposo en la oscuridad, durante $" minutos. Haga un blanco con los mismos reactivos pero sin aceite y de0e en reposo, en la oscuridad, durante $" minutos ranscurrido este tiempo agregue, en cada recipiente, !" ml de yoduro potásico al !" S y 1" ml de agua destilada. itule inmediatamente con solución de tiosulfato de sodio ".! B hasta un color amarillento. 5gregue ! ml de almidón ! S y contine la titulación hasta *ue desaparezca el color azul. 3urante la titulación se debe agitar fuertemente el erlenmeyer para asegurarse *ue todo el yodo se ha removido de la capa de cloroformo. 5note el volumen total de tiosulfato gastado en la titulación del blanco y de la muestra.

6. ,$#"+ $+ )"#$+: )ese 7.1 g de aceite o grasa% y disu+lvalos en !7.1 ml de etanol al C1 S. 'i no disuelve bien caliente en bao Mar&a hasta unos I"TA. 5gregue cinco gotas de solución de fenolftale&na y titule con hidró(ido de potasio ".! B hasta obtener un color rosa pálido *ue persista por más de $" segundos. Kepita la titulación utilizando sólo etanol al C1 S blanco%. 7. ,$#"+ $+ p+<#$%*: )ese 1 g de aceite o grasa% y adicione !1 ml de una mezcla de ácido ac+tico glacial4 cloroformo $47%. 5gregue ! ml de solución de yoduro potásico al !" S. 5gite durante un minuto y de0e en reposo otro minuto. 5dicione 1" ml de agua destilada y agite. El yodo *ue se libera se titula con tiosulfato sódico ".! B hasta *ue el color sea amarillento. 'e aade entonces ! ml de almidón al ! S y se sigue titulando con tiosulfato hasta la desaparición del color azul. RESULTADOS: I,$#"+ $+ *)p%,##")"#, S!: El nmero de mg de <8H gastados en la neutralización de !g de grasa los podemos determinar a partir del nmero de milie*uivalentes me*% de <8H gastados en la misma titulación4 @+ OH ,+"+*)<#%* p)<) ,+;<)(#)< 1/ $+ /<)*)  me* <8H adicionados # me* <8H residuales  me* <8H blanco # me* <8H residuales en la muestra )ero4 @+ OH  @+ HC( /)*;)$% +, () ;#;()"#, )or consiguiente4

@+ OH /)*;)$%*  me* HAl blanco # me* HAl residuales en la muestra  b # m% B


3onde4 b O volumen de HAl gastado en la titulación del <8H presente en el blanco m O volumen de HAl gastado en titular el <8H residual de la muestra B O normalidad del HAl utilizado

)ara cumplir con la definición debemos determinar cuántos me* se re*uieren por !g de grasa o aceite4 Entonces, por F gramos de muestra se gastaron b # m% me*; por !g b #m% B F ! me* de <8H e*uivale a 1Img de <8H4 b #m% B me* e*uivalen a4 F   V' V@!  N @/ $+ OH  S  I,$#"+ $+ S)p%,##")"#, Q

)or otro lado, ! me* de <8H es igual a ! me* de ácido graso saponificado4 un triglic+rido, al hidrolizarse, libera $ mol+culas de ácido graso, por lo cual $ me* de <8H son apro(imadamente iguales a ! me* de grasa o sea a M=!""", donde M es el peso molecular promedio de la grasa. 8 sea *ue para saponificar un nmero de gramos igual a M se necesitan $ ( 1I ( !""" mg de <8H. 3e manera *ue el &ndice de saponificación es tambi+n igual a4 S  6    1000 M

3e donde4

M  1800 S

Aon base en las fórmulas anteriores determine el &ndice de saponificación de la grasa o aceite con la cual traba0o y su peso molecular promedio.

I,$#"+ $+ Y%$% Y!: El Xodo absorbido por el aceite será igual al yodo presente en el blanco menos el yodo residual en la muestra. Los me* de yodo presente en ambos casos blanco y muestra% son iguales a los me* de iosulfato; o sea4 @+ $+ Y%$% )'*%<'#$%*  V'  V@! N 3onde4 b O volumen de iosulfato en ml gastados en la titulación del blanco. m O volumen de iosulfato en ml gastados en la titulación del yodo residual de la muestra B O normalidad del iosulfato Ba7'78$.1H78%

! me* de yodo es igual a ".!7J mg de yodo4 b #m% B m*e son iguales a ".!7J b #m% B gramos; esto en F gramos de aceite; en !"" g para cumplir con la definición del &ndice de yodo% será4


Y  100 V'  V@! N 0.12! /<)@%* Q

En base a la fórmula anterior determine el &ndice de yodo y e(prese su opinión acerca del grado de insaturación de su aceite o grasa.

,$#"+ $+ A"#$+ A!: Los me* de <8H gastados en la titulación son iguales a los me* de ácidos grasos libres presentes en la grasa. Los me* de <8H gastados son iguales a  ( B; donde  es el volumen en ml de <8H gastados en la titulación O m # b. )or consideraciones similares a las hechas para el &ndice de saponificación4 A    V  N Q

YAuál es el &ndice de acidez del aceite utilizado en la prácticaG YFu+ indicación le da sobre la frescura del aceiteG

I,$#"+ $+ P+<#$%* P!: Los me* de iosulfato utilizados indican los me* de Xodo liberados por la reacción con los peró(idos *ue es igual al nmero de me* de peró(idos presentes en la muestra4 @+ p+<#$%  @+ K%$%  @+ T#%*();%  V  N 3onde4  O volumen de iosulfato gastado en la titulación B O normalidad del iosulfato

 ( B son entonces los me* de peró(ido en F gramos de grasa; en !
3etermine el &ndice de peró(idos y relaciónelo con el grado de rancidez de su aceite o grasa.

BIBLIOGRAFIA •

•

?8HB'<, Kobert A. ?io*u&mica. 5ddison esley beroamericana '.5. Fuinta Edición. M+(ico. !CC2. L/F/E, Ernesto . )rácticas de bio*u&mica. /niversidad de Bario. 3epartamento de Fu&mica. /niversidad de Bario. !CC".


KEB3B5, >eorge. +cnicas de bio*u&mica aplicada. Bueva Editorial nteramericana '.5. M+(ico. !CJD. . ETRACCI?N E IDENTIFICACI?N DE ARN DE LEVADURA

OBJETIVOS: • •

5islar el 5KB de levadura Aonocer el funcionamiento de e*uipos de laboratorio como la centrifuga

FUNDAMENTO TEORICO: Es til descomponer los ácidos nucleicos en los nucleótidos, nucleósidos, bases, azcares y fosfatos *ue los integran, con fines de análisis e identificación. Las principales etapas del aislamiento de los ácidos nucleicos son4 destrucción de la c+lula por cho*ue osmótico; homogenización, digestión enzimática o ata*ue mecánico leve, seguidos a veces por aislamiento de ncleos, mitocondrias, virus u otras formaciones subcelulares. )uesto *ue los ácidos nucleicos se unen muy fuertemente a los cationes y las prote&nas catiónicas como histonas y protaminas, es necesario separarlos de estas sustancias con lesiones m&nimas de la cadena polinucleot&dica. )ara este fin se han utilizado con +(ito las soluciones acuosas de fenol adicionadas de detergentes y agentes *uelantes. Esta mezcla disolvente, aadida a los fragmentos de te0ido, produce un sistema de dos fases; los ácidos nucleicos *uedan en la capa acuosa y las prote&nas desnaturalizadas se disuelven en el fenol o precipitan en la interfase. La separación de los ácidos nucleicos y las prote&nas, se facilita por la adición de detergentes aniónicos y de sales concentradas. ambi+n se aaden agentes *uelantes para eliminar metales polivalentes *ue podr&an formar sales con los grupos fosfatos de los ácidos nucleicos. Ninalmente, se traba0a con pH ligeramente alcalino para reducir las interacciones electrostáticas de ácidos nucleicos con otros iones. 3ebido a su carácter macromolecular, los ácidos nucleicos resultan bastante dif&ciles de separar de las prote&nas y polisacáridos por m+todos suaves y los tratamientos drásticos alteran profundamente su estructura y caracter&sticas, por lo cual a menudo se encuentra un alto grado de impurezas en las preparaciones no anal&ticas. El 5KB de levadura se obtiene e(trayendo un homogenizado de c+lulas con fenol. La solución concentrada de fenol rompe los enlaces de hidrógeno en las macromol+culas, causando desnaturalización de la prote&na. La suspensión turbia se centrifuga y aparecen dos fases4 la fase inferior de fenol contiene 53B y la fase superior acuosa contiene carbohidratos y 5KB. La prote&na desnaturalizada se halla presente en ambas fases y se puede remover por centrifugación. El 5KB se precipita luego con etanol. El producto obtenido no contiene 53B pero generalmente está contaminado con polisacárido.


MATERIALES Y REACTIVOS: R+)";#=%*: Nenol al C"S Eter et&lico 5cetato de potasio al 7"S Etanol absoluto Keactivo de ?ial

Molibdato de amonio al 1S Aloruro estaoso al 7 S Etanol45gua $4! 5gua destilada Levadura Aada grupo debe traer este material%

M);+<#)(+*: ! Mortero con pistilo ! Erlenmeyer 71" ml ! Erlenmeyer 1"" ml ! ermómetro ! )robeta 1" ml ! arilla de vidrio ! Embudo de decantación Aentrifuga Bevera

1 ubos tapa rosca ! Embudo de vidrio ! 5ro metálico ! >radilla 7 ubos de ensayo 7 ?ea@ers !"" ml ! )apel filtro ! >otero ?alanza

PROCEDIMIENTO: 'uspenda !" g de levadura seca en D" ml de agua a $J ZA. 3e0e durante !1 minutos a esta temperatura y agregue un volumen igual de fenol al C" S mida con probeta la solución de fenol%. 5gite el con0unto durante !" minutos a temperatura ambiente y de0e en la nevera otros !" minutos; luego centrifugue en fr&o a D""" rpm durante !1 minutos. Aon una pipeta pasteur gotero% remueva cuidadosamente la capa superior acuosa y centrifugue en fr&o a !"""" rpm durante 1 minutos. 3eseche el residuo y pase el sobrenadante a un embudo de decantación. 5gregue un volumen igual de +ter et&lico fr&o mantenido en nevera% -mida el +ter con probeta, no con pipeta-. 5gite suavemente y luego e(traiga la fase acuosa inferior en la fase et+rea *uedan las trazas de fenol%. 5 la fase acuosa aádale ! ml de acetato de potasio al 7" S y precipite el 5KB mediante la adición de dos volmenes de etanol absoluto frió mientras agita lentamente con una varilla. 3e esta solución retire D ml y depos&telos en dos tubos de ensayo 7 ml en cada tubo%. El resto d+0elo guardado en nevera. 5 uno de los tubos agregue $ ml del reactivo de ?ial. Aaliente en un bao de agua hirviendo durante 7" minutos y luego enfr&e. La aparición de un color verde indica la presencia de una pentosa. 5l otro tubo de ensayo agregue D ml de molibdato de amonio y 7 ml de cloruro estaoso. La aparición de un color azul indica la presencia del grupo fosfato.

PRACTICAS DE LABORATORIO BIOQUIMICA

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