Manual de practicas de bioquimica metabolica

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA MANUAL DE PRÁCTICAS

BIOQUIMICA

1


Practica no. 1 SOLUBILIDAD DE CARBOHIDRATOS FUNDAMENTO: Loa carbohidratos son en general mas solubles en agua y solventes inorganicos y menos solubles o insolubles en solventes inorganicos. REACTIVOS: -Agua destilada -HCl 5% -NaOH 5% -Etanol -Cloroformo -Carbohidratos Glucosa Fructosa Xilosa TECNICA: Colocar aproximadamente 15 mg de cada uno de los carbohidratos en tubos etiquetados y examine su solubilidad en agua, alcali diluido, acido diluido, etanol y cloroformo añadiendo 2ml de solvente. RESULTADOS: OBSERVACIONES: CONCLUSIONES: IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS CARBOHIDRATOS 1.- PRUEA DE BIAL PARA PENTOSAS. FUNDAMENTO: Cuando se calienta pentosas con HCl concentrado se forma furfural que se condensa con orcinol (3,5-dihidroxitolueno), en presencia de iones ferricos para dar un complejo coloreado. GENERALIDADES: -Explique que es un monosacárido, oligosacarido y un polisacarido. -Clasificacion de los monosacáridos en base al numero de atomos de carbono que poseen _Escriba las formulas de una triosa, una terrosa, una pentosa y una hexosa. 2


REACTIVOS: 1.- Reactivo de Bial. Disolver 1.5 g de orcinol en 500 ml. De HCl concentrado. Agregar a esta solucion 20 gotas de FeCl 3. Guardar en frasco ambar. 2.- Solucion de carbohidratos: Glucosa: 1g/100ml Xilosa: 1g/100ml TECNICA: 1.- Rotular los tubos de ensaye de 15 x 150 con el nombre del carbohidrato a probar y el nombre de la la prueba (Bial). 2.- Pipetear 1ml de la muestra (sol. de carbohidrato) al tubo de ensaye correspondiente, y 2.5 ml de reactivo de Bial. 3.- Colocar en baño de agua agu a hirviente hasta la aparicion de color, co lor, y sacar inmediatamente. RESULTADOS: OBSERVACIONES: PRUEBA DE SELIWANOFF FUNMDAMENTO: Las cetosas se deshidratan mas rapidamente que las aldosas dando derivados de furfural que se condensan con resorcinol para formar un compuesto coloreado, por lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado que ocasionaria la deshidratación de las aldosas. GENERALIDADES: -Explique que es una aldosa y una cetosa -Escriba la formula de Fisher y de Haworth de una aldosa y una cetosa con nombres. REACTIVOS: 1.- Reactivop de Seliwanoff. Seliwanoff. Disolver 0.7 g de resorcinol en 100 ml de HCl concentrado. Agregar agitando 100 ml de agua destilada. Guardar e n frasco ambar. 2.- Solucion de fructosa y glucosa 1g/100ml cada uno. TECNICA: 1.- Rotular los tubos de endsaye con el nombre del carbohidrato y el nombre de la prueba (Seliwanoff). 2.- Pipetear 2 ml del reactivo de Seliwanoff a cada tubo y añadir 2 gotas del carbohidrato al tubo de ensaye correspondiente. Calentar en un baño de agua hirviente hasta la aparicion de color. 3


RESULTADOS: OBSERVACIONES: PRUEBA DE YODO FUNDAMENTO: El yodo forma complejos coloreados de absorción con los polisacaridos. GENERALIDADES: -Enlace glucosidico , como se forma, estructura quimica de uno. -Describa la estructura quimica de sacarosa, almidon, y glucogeno. REACTIVOS: 1.- Solucion de yodo (mezclar 2 g de KI y 1 g de yodo , disolver esta mezcla mezcla en agua destilada, completar a 100 ml). 2.- Solucion de almidon 1g/100ml sacarosa 1g/100ml glucosa 1g/100ml TECNICA: Colocar en una capsula de porcelana 3 gpotas de solucionn problema y 3 gotas de yodo, observe los colores.

RESULTADOS: OBSERVACIONES:

Practica no. 2. IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS CARBOHIDRATOS II. REACCIÓN DE TOLLENS. FUNDAMENTO: LA PRUEBA DE T0LLENS ES UNA REACCIÓN CARACTERÍSTICA PARA AZUCARES REDUCTORES DANDONOS COMPUESTOS COLOREADOS (NEGROS) CUANDOSE TRATE DE ELLOS. REACTIVOS:  GLUCOSA 2%  ARABÍNOSA 2% 4

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA   

MALT-OSA 2% SACAROSA 2% ALMIDON.

REACTIVO DE TOLLENS: MEZCLAR 10 mL DE HC1 CONCENTRADO CON 2 Ml DE FLOROGLUCÍNOL AL 2% Y LLEVAR CON AGUA DESTILADA HASTA 18 ml. TÉCNICA: 1.- COLOCAR EN EL TUBO DE ENSAYO CORRESPONDIENTE 0.5MLDE LAS SOLUCIONES A PROBAR (GLUCOSA, ( GLUCOSA, ARABINOSA, MALTOSA, MALTOSA, SACAROSA, ALMIDON 2.- AGREGAR AGREGAR 1 ML DE REACTIVO DE TQLLENS Y MEZCLAR. 3.- CALENTAR EN UN BAÑO DE AGUA HIRVIENTE POR 3 A 4MIN. 4.- UN COLOR OSCURO ES UNA PRUEBA POSITIVA. POSITIVA. RESULTADOS:

OBSERVACIONES: CONCLUSIONES: FUNDAMENTO: LA REACCIÓN DE FEHLING ESTA BASADA EN LA ACCIÓN REDUCTORA QUE TIENEN LOS AZUCARES AZUCARES SOBRE LOS IONES CÚPRICOS EN MEDIO ALCALINO REACTIVOS:  GLUCOSA 2%  ARABINOSA2%  MALTOSA 2%  SACAROSA 2%  FRUCTOSA 2°/o  ALMIDÓN 2%  AGUA DESTILADA. REACTIVO DE FEHLING: SOLUCIÓN A: PESAR 34.65 g DE SULFATO DE COBREY DISOLVER EN 300 ml DE AGUA DESTILADA, LLEVAR A 500 ml CON AGUA Y CONSERVAR EN FRASCO CON TAPÓN DE HULE.

5


SOLUCIÓN B.- PESAR 125 g DÉ KOH Y 173 g DE TARTRATO DE SODÍO Y POTASIO, Y LLEVAR CON AGUA DESTILADA A 500 ML, CONSERVAR EN FRASCO REVESTIDO DE PARAFINA Y CON TAPÓN DE HULE. TÉCNICA: PREPARACIÓN DEL TESTIGO: 1.- COLOCAR EN UN TUBO DE ENSAYE 2 ml DE AGUA DESTILADA 2.- AGREGAR 0.5 ml DE FEHLING A Y 0.5 ml DE FEHLING B Y MEZCLAR. 3.- CALENTAR EN BAÑO MARÍA A EBULLICIÓN DURANTE 5 MIN. 4.- NO DEBE PRODUCIRSE UN PRECIPITADO PRECIPITADO ROJO LADRILLO PREPARACIÓN PREPARACIÓN DE LOS PROBLEMAS: 1.- COLOCAR EN EL TUBO CORRESPONDIENTE 1ml DE LAS SOLUCIONES A PROBAR (GLUCOSA, ARABINOSA, MALTOSA, MALTOSA, SACAROSA, FRUCTOSA Y ALMIDÓN) 2.- AGREGAR 0.5 ml DE FEHLING A Y 0.5 ML DE FEHLING B Y MEZCLAR 3.- CALENTAR EN BAÑO MARÍA EN EBULLICIÓN DURANTE 5 MIN. 4.- UN PRECIPITADO ROJO LADRILLO SERA UNA PRUEBA POSITIVA. RESULTADO: OBSERVACIONES:

CONCLUSIONES: REACCION DE LA ANTRONA. FUNDAMENTO: LOS ACIDOS CONCENTRADOS ORIGINAN UNA DESIDRATACION DE LOS MONOSACARIDOS PARA RENDIR FURFURALES QUE SON DERIVADOS ALDEHIDICOS DEL FURANO, POR EJEMPLO: LA DGLUCOSA CON ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO (HCl) PRODUCE 5 HIDROXI METIL FURFURAL. ESTOS PRODUCTOS SE COMBINAN LUEGO CON ANTRONA PARA DAR UN COMPLEJO COLOREADO.

6


REACTIVOS: 1.- SOLUCION DE ANTRONA 2 GR/LT GR/LT EN HCl CONCENTRADO. 2.- SOLUCION DE GLUCOSA 1 GR/100 ML 3.- FRUCTOSA 1 GR/1OO ML. TECNICA: 1.- APROXIMADAMENTE A 2 ML DE ANTRONA AGREGUE 5 GOTAS DE LA SOLUCION PROBLEMA, MEZCLAR FUERTEMENTE Y OBSERVAR OBSERVAR EL CAMBIO DE COLOR. RESULTADO:

OBSERVACIONES: CONCLUSIONES: PRACTICA NO. 3.

REACCIÓN DE BENEDICT PARA AZUCARES AZUCARES REDUCTORES Fundamento: Esta prueba se basa en la reacción de reducción del cobre de Benedict. La glucosa y otras sustancias reductoras reducen los iones cúpricos a iones cuprosos y forman un oxido cuproso rojo. El color azul de Cu++ es negativo para sustancias reductoras. Generalidades: Escriba las fórmulas de la glucosa, la sacarosa y un segmento del almidón (en forma de alfa amilasa). Reacción de Fehling.

Consiste en: 1 ml de la solución problema (Hidrolizado) + 0.5 ml de Fehling A + 0.5 ml de Fehling B 7


Calentar 5 minutos en baño de agua hirviente Reactivos: 1. 2. 3. 4.

React Reactiv ivo o de de Ben Bened edic ictt solu soluci ción ón de de almi almidón dón 2% solu soluci ción ón de de sacar sacarosa osa 2% Solución Solución de glucosa glucosa a diferente diferentess concentracione concentracioness indentificad indentificadas as como: Glucosa 1, 2,3 y 4.

Técnica: Pipetee 0.5ml de la solución problema en un tubo de ensayo de 15 x 150 y agregue 1 ml de reactivo de Benedict, mezclar y colocar en un baño de agua hirviendo por 3 min. Auxíliese de la tabla siguiente para determinar la cantidad aproximada de glucosa presente en las soluciones de glucosa 1, 2,3 y 4. color Azul

Concentración aprox. de glucosa (g/100ml) 0 g/100ml (Negativa)

Azul verdoso

0.3 g/100ml

Verde oliva

1.0 g/100 ml

Azul café

1.5 g/100 ml

Rojo ladrillo

2.0 g/100 ml o más

Hidrólisis de la Sacarosa

5 ml de sacarosa 2% + 6 gotas de HCl concentrado Mezclar y calentar 5 minutos en agua hirviente Enfriar Agregar 15 gotas de NaOH 5% para neutralizar Efectuar una prueba de Fehling al hidrolizado Reacción de Fehling

1 ml de la solución problema (Hidrolizado) 8


+ 0.5 ml de Fehling A + 0.5 ml de Fehling B Calentar 5 minutos en baño de agua hirviente Resultados y Observaciones: Conclusiones:

PRACTICA NO. 4 FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA POR LEVADURAS (Sacharomyces cereviceae) FUNDAMENTO: La glucosa es un carbohidrato fermentable por las levaduras. REACTIVOS:  Solución de glucosa (1 g en 100 ml)  Reactivo de benedict.  Levadura de panadero seca activa. TÉCNICA: 1.- En un vaso de precipitado prec ipitado de 25 ml. Pipetee 10 ml de la solución de glucosa y añada 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura. Mezcle perfectamente hasta que la mezcla sea homogénea. Incube a 37 grados. Realice una prueba de Benedict a esa e sa mezcla a los 30 min., y a la hora y media de incubación. 2.- Para verificar que la solución de glucosa es un azúcar reductor, re ductor, realice una prueba de Benedict a la solución de glucosa. 3.- Para verificar que la levadura no contiene la presencia de ningún azúcar reductor realice un blanco de la siguiente manera: Mezcle 0.3 g (la punta de una espátula) de levadura con 10 ml. De agua destilada. Efectúe una prueba de Benedict tomando 0.5 mi de esta solución de levadura. Nota: La prueba de Benedict se efectúa de la sig. Manera: Pipetear 0.5 ml. de la solución problema en un tubo de 15 X 150 Añadir 1 ml. de Reactivo de Benedict. Calentar en baño de agua hirviente durante 3 min. INTERPRETACION:

9


1. Muestra Muestra no fermentada: fermentada: reacción reacción de Benedict Benedict positiva positiva (rojo (rojo ladrillo) ladrillo) 2. Muestra Muestra fermentad fermentada: a: reacción reacción de de Benedict Benedict negati negativa va (azul). (azul). RESULTADOS Y OBSERVACIONES: CONCLUSIONES:

PRACTICA NO. 5. DETERMINACIÒN DE GLUCOSA DEL SUERO POR EL METODO DE LA GLUCOSA OXIDASA. ANTECEDENTES: La determinación de la glucosa en fluidos biológicos asido bien documentadas. La prueb prueba a de gluc glucos osa a pude pude ser ser diag diagno nost stic ica a ment mente e sign signifific icat ativ iva a en diab diabet etes es e hipoglucemia. FUNDAMENTO: La glucosa glucosa es es oxidad oxidad por la la glucosa glucosa oxidasa oxidasa a ácido ácido gluconico gluconico hiperoxido hiperoxido de hidrogeno en presencia de peroxidasa reacciona con el hidroxibenzoato y 4aminoantipirina (PAP) (PAP) para para producir un cromógeno de Quinoneimina Quinoneimina rojo con un máximo de absorbancia a 505 nm. GLUCOSA OXIDASA

B-D-Glucosa + o 2 + H2O

Ácido D-gluconico +H2 O 2 Peroxidasa

H2O2 + Hidroxibenzoato + 4-Aminoantipirina Cromógeno Quinoneimina Rojo +H 2º La concentración concentración de glucosa es directament directamente e proporcionar proporcionar a la absorbancia del cromógeno de Quinoneimina a 505 nm. MATERIAL: 1 tubo de ensaye de 13/100 1pipeta de 20 microlitros 1 pipeta de 5ml. REACTIVOS: Reactivo de color: Una solución conteniendo después de reconstitución 0.5125 mml. / L de de 10


4-antipirina, 10mmol /L de p- hidrixibenzoato, > 20 000 U/L de glucosa oxidasa, >1000 U/L peroxidasa (Rábano Picante), buffer y preservativo. Estándar de glucosa Una solución acuosa conteniendo 90 ml/dL la glucosa y perceptivos PRECAUCIONES: No pipetee los reactivos con la boca y evite el contacto con la piel y ojos. RECOLECIÒN RECOLEC IÒN Y PREPARACIÒN DE LA MUESTRA: MUESTR A: La muestra de elección de be ser plasma preparado de la sangre colecta con anticoagulante fluorado. Otro plasmas y sueros pueden usarse si separados del paquete globular y ensayados ensayados rápidamente. El plasma fluorado para análisis de glucosa e estable a 2-8 º C por 5 días. PROCEDIMIENTOS: 1.-prepare el reactivo de trabajo de glucosa 2.-en tubos separados pipetee 20 microlitros del estándar o del suero a ensayar 3.-añada 2 ml. De reactivo y mezcla. 4.- incube por 10 minutos a 37ºC, y determine la absorbancia del estándar (A s) y de cada cero (A) a 505 nm. Contra blanco de reactivo.

CALCULOS Y RESULTADOS La glucosa se expresa en mg/dL o mmol/Litros Glucosa mg/Dl= A X concentración del estándar ºA s A= absorbancia del problema As = absorbancia del estándar ESTANDAR ESTANDAR = 90mg. /dL ( ) X (90 ) = (

)

VALORES ESPERADOS 70-105mg. / dL Estos valores son sugeridos. Se recomienda que cada laboratorio establezca el rango para el área en que esta localizado. 11


OBSERVACIONES: RESULTADOS: Absorbancia estándar de la glucosa: A= 0.310 B= 0.315 Abs. Problema Abs. Estándar .323 .312

X

90

= mg/dl

X 90 = 83 mg/dl

RESULTADOS: CONCLUCIÒN: PRACTICA NO. 6.

CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA. FUNDAMENTO: CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA. Son pruebas que miden la capacidad para metabolizar la glucosa. Las personas que padecen de diabetes mellitus tienen altos niveles de glucosa en la sangre y las las prue prueba bass de tole tolera ranc ncia ia a la gluc glucos osa a son son una una de las las herr herram amie ient ntas as para para diagnosticarla. Este examen también se realiza para diagnosticar diabetes mellitus en estudios investigativos que involucren a los diabéticos y en casos en los que se sospeche la presencia de esta enfermedad, a pesar de haber realizado un examen en ayuna ayunass de gluco glucosa sa en sangr sangre, e, con con resul resulta tado doss norm normal ales es,, así así como como para para el diagnóstico de hiperinsulinismo (elevación de los niveles de insulina). Los métodos más utilizados más comúnmente para evaluar la tolerancia a una sobrecarga de glucosa pueden ser: 1. Pruebas Pruebas de toleranci tolerancia a utilizando utilizando una dosis dosis única oral de glucosa glucosa.. 2. Pruebas Pruebas de toleranc tolerancia ia con una dosis dosis intraven intravenosa osa de glucosa. glucosa. 12


La prueba más común de tolerancia a la glucosa es la oral. Después de una noche de ayuno, el paciente ingiere una solución que contiene una cantidad conocida de glucosa. Se toma una muestra de sangre basal, antes de que el paciente ingiera la solución de glucosa y de nuevo cada 30 minutos después hasta por 2 ó 3 horas, según la solicitud del médico, para la determinación de glicemia. Además, el paciente no puede comer durante el examen y se recomienda informar al médico acerca del uso de medicamentos que pueden afectar los resultados del examen. Con Con frec frecuen uenci cia a se soli solici cita ta la medic medició ión n de los los nive nivele less de insu insulilina na (horm (hormon ona a producida por el páncreas que permite introducir la glucosa desde la sangre hasta la cada una de las células del cuerpo). Cuan Cuando do se sumi sumini nist stra ra la gluc glucos osa a por por boca boca,, la abso absorc rció ión n desd desde e el trac tracto to gastrointestinal hacia la sangre continúa durante un lapso variable, que depende de la cantidad de glucosa suministrada. La máxima absorción de glucosa se estima en 0,8 g/kg de peso por hora. La tolerancia a la glucosa suministrada por vía oral, mide el balance entre la velocidad de pasaje de la glucosa al fluido extracelular y su separación por la asimilación celular y la excreción urinaria, si la hubiere. Por tanto, la prueba puede influirse no sólo por aquellos factores vinculados con la utilización de la glucosa, sino sino también por los que influyen en su absorción. Las pruebas intravenosas de tolerancia a la glucosa son poco comunes. Para realizar este tipo de prueba, al paciente se le inyecta por vía venosa una cantidad conocida de glucosa durante tres minutos, previa la medición de los niveles de insulina en la sangre en el minuto uno y en el tres. INTERPRETACIÓN En condiciones normales la sangre en ayunas debe tener un nivel de glucosa inferior a 100 mg/dl. Los valores sanguíneos normales son: Ayunas: 60 a 100 mg/dl 1 hora: menos de 200 mg/dl 2 horas: menos de 140 mg/dl. Entre 140 y 199 se considera que existe intolerancia a la glucosa y es un grupo que tiene mayor riesgo de desarrollar diabetes. Los niveles por encima de 200 mg/dl indican un diagnóstico de diabetes.

13


Los criterios criterios utilizados utilizados para para definir definir la condición condición de anormalidad anormalidad de una una curva de tolerancia ,se basan en el nivel o pico elevado alcanzado por la concentración sanguínea y la falta de retorno al nivel normal, 2 horas después de la ingestión de glucosa, siendo este último el más importante. Un valor hipoglucémico hipoglucémico (bajo de glicemia) de 3 a 5 horas después de la ingestión ingestión de la glucosa se observó en ciertos pacientes cuya curva de tolerancia era de tipo diabético, interpretándose un hiperinsulinismo, típico del estado diabético.

DIBUJOS: CALCULOS Y RESULTADOS: CONCLUSIONES:

PRACTICA NO. 7. DETERMINACIÒN DE GLUCOSA GLUCOS A SERIADA. ANTECEDENTES: La determinación de la glucosa en fluidos biológicos asido bien documentadas. La prueb prueba a de gluc glucos osa a pude pude ser ser diag diagno nost stic ica a ment mente e sign signifific icat ativ iva a en diab diabet etes es e hipoglucemia. MATERIAL: 4 tubo de ensaye de 13/100 1pipeta de 20 microlitros 1 pipeta de 5ml. REACTIVOS: Reactivo de color: Una solución conteniendo después de reconstitución 0.5125 mml. / L de de 4-antipirina, 10mmol /L de p- hidrixibenzoato, > 20 000 U/L de glucosa oxidasa, >1000 U/L peroxidasa (Rábano Picante), buffer y preservativo. Estándar de glucosa Una solución acuosa conteniendo 90 ml/dL la glucosa y perceptivos PROCEDIMIENTOS: 1.-prepare el reactivo de trabajo de glucosa 2.-en tubos separados pipetee 20 microlitros del estándar o del suero a ensayar 3.-añada 2 ml. De reactivo y mezcla. 4.- incube por 10 minutos a 37ºC, y determine la absorbancia del estándar (A s) y de cada cero (A) a 505 nm. Contra blanco de reactivo. CALCULOS Y RESULTADOS 14


La glucosa se expresa en mg/dL o mmol/Litros Glucosa mg/Dl= A X concentración del estándar ºA s A= absorbancia del problema As = absorbancia del estándar ESTANDAR ESTANDAR = 90mg. /dL ( ) X (90 ) = (

)

VALORES ESPERADOS 70-105mg. / dL RESULTADOS Y OBSERVACIONES: CONCLUCIÒN:

PRACTICA NO.8. Determinación de proteínas totales. Historia del Método La reacc reacció ión n de colo colorr de las las molé molécul culas as de prote proteín ínas as con ione ioness cúpri cúprico cos, s, es conocida como la reacción de color de Biuret, y es conocida desde 1878, desde las publicaciones de Riegler en 1914 se han hecho varios intentos para estabilizar los iones cúpricos en ractivos alcalino. Kingsley modificó el procedimiento en 1939 y en 1942 para incluir el uso de sodio como agente complejo. Este procedimiento procedimiento fue modificado más tarde por Weichselbaum y Gornall. El presente método está basado en estas modificaciones. Principio ++ Proteína + Cu

Álcali complejo de color

La proteína en suero forma un complejo coloreado violeta cuando reacciona con iones cúpricos en solución alcalina, la intensidad del color violeta es proporcional a la cantidad de proteína presente cuando se compara contra una solución de concentración conocida de proteína. Reactivo   

Hidróxido de sodio 600 mM; sulfato de cobre 12mM. Tartrato de sodio potasio 32 Mm; Yoduro Yoduro de potasio 30Mm; ingredientes no reactivos. El reactivo esta listo para su uso El reactivo se guarda a temperatura ambiente 15

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA 

El reactivo debe ser una solución azul pálido. La presencia de turbidez turbidez o de un precipitado negro indica deterioro del reactivo y no debe ser usado.

Material     

Reactivo de proteína total Pipetas automatizadas Cronómetro Tubos de ensaye Espectrofotómetro

Procedimiento (Manual)      

Etiquetar los tubos para blanco, estándar, paciente, etc. Pipetee 1.0 ml del reactivo de trabajo a cada tubo. Añadir 20 Ul de la muestra a los tubos respectivos, mezclar por inversión, Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Ajustar el espectrofotómetro a cero con el blanco a 540 nm. Leer y anotar las absorbancias de todos los tubos.

Calibración Use estándar acuoso de proteína (8g/dL) o suero calibrador. Se debe calibrar de acuerdo a las instrucciones de calibración del instrumento. Si el resultado de los controles se encuentra en el rango, la prueba debe ser recalibrada. Cálculos Abs = Absorbancia Abs (Paciente) ------------------------------- -------Abs (Estándar)

* concentración del estándar = concentración de proteína g/dl. g/dL

Valores esperados esper ados 6.2 – 8.5 g/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. RESULTADOS Y OBSERVACIONES: 16


CONCLUCIÒN:

PRACTICA NO. 9. PROTEINAS TOTALES Y ALBUMINA OBJETIVO Cuantificación de las proteínas totales y albúmina en el suero. FUNDAMENTO Proteina: La proteína presente en la muestra reacciona con los iones cobre (II) en medio alcalino, originando un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría. Albumina: La determinación colorimetrica de albumina humana en suero se realiza en un medi medio o amor amortitigu guad ado, o, lo cual cual perm permitite e su unio union n por por puen puente tess de hidr hidrog ogen eno o a colorantes o indicadores como el verde de bromocresol, tiene la propiedad de enlazarse específicamente con la albúmina produciendo un cambio de color de intensidad proporcional a su concentración. GENERALIDADES Las Las prot proteí eína nass séric séricas as están están sepa separad radas as apro aproxi xima mada dame ment nte e en albúminas y globulinas; en otras palabras, la proteína total = albúmina + globulina. La albúmina es la proteína de mayor concentración en el suero que sirve para trasportar much muchas as molé molécu cula lass pequ pequeña eñas, s, pero pero tamb tambié ién n juega juega un papel papel deci decisi sivo vo en el mantenimiento de la presión oncótica de la sangre, es decir, impedir que el líquido se filtre a los tejidos. Las globulinas se dividen a grandes rasgos en globulinas alfa-1, alfa-2, beta y gammaglobulinas, las cuales se pueden separar y cuantificar en el laboratorio mediante la electroforesis y la densitometría. La fracción alfa-1 incluye la alfa-1 antitripsina (ver AlphaAlpha-1 1 antit antitripsin ripsina a ) y la globulina fijadora de tiroxina (ver T3 T3,, T4 T4,, RT3U ). La fracción alfa-2 contiene la haptoglobina,, ceruloplasmina haptoglobina ceruloplasmina,, HDL y alfa-2 macroglobulina. En general, los niveles de proteínas alfa-1 y alfa-2 aumentan en presencia de infl inflam amaci ación ón.. La frac fracci ción ón beta beta incl incluye uye la tran transf sfer erri rina na (ver (ver hie hierro rro sér sérico ico ), el plasminógeno (ver análisis del factor VIII ) y las beta lipoproteínas (ver LDL). La fracción gamma incluye los diferentes tipos de anticuerpos (inmunoglobulinas M, G y A). 17


Valores Normales Nor males • •

Proteína total: 6,4 a 8,3 g/dl Albumina: 3-5 gr / 100ml

METODOLOGIA: BIURET VERDE DE BROMOCRESOL REACTIVOS       

Verde de bromocresol (BCG) 0.15 g/L. Buffer pH 4.56- 4.76; Surfactante, ingredientes no reactivos y estabilizadores. Reactivo de proteinas (biuret) Patron para proteinas totales. Patron para albumina. El reactivo esta listo para usarse El reactivo es estable a la fecha de caducidad, guardado a temperatura ambiente. El react reactiv ivo o debe debe ser ser una una solu soluci ción ón verde verde-am -amar arililla la,, clar clara. a. Si pres present entan an turbidez o precipitado el reactivo es insatisfactorio y debe ser descartado.

PRECAUCIONES: Los reactivos causan irritacion. Evite el contacto con piel, ojos y ropa. En caso de contacto, lavese con abundante agua. CONSERVACIÓN Almacenados a temperatura ambiente, los reactivos son estables hasta su fecha de caducidad. INSTRUMENTOS Use un espectrofotometro o fotocolorimetro calibrado a 540 y 630nm y un baño capaz de mantener la temperatura a 37ºC. MUESTRA Suero unicamente MATERIAL    

Pipetas automatizadas Tubos de ensayo Cronometró Espectrofotómetro para leer a 630 nm

PROCEDIMIENTO 18


Proteínas: 1.- Pipetear en tubos de ensaye: Reactivo proteinas

BLANCO de 2.5ml

ESTANDAR 2.5ml

Suero

MUESTRA 2.5ml

0.05ml

patron

0.05ml

2.- Agitar bien y dejar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. 3.- Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la muestras frente al Blanco a 540 nm. El color es estable durante al menos 2 horas. Albúmina Etiquete los tubos para blanco, control, estándar, paciente, etc.  Pipetee 1.0 mL del reactivo de trabajo en cada tubo.  Añada 10µL de la muestra a los tubos respectivos y mezclar.  Incube por un minuto.  Ajuste el espectrofotómetro a cero con el blanco a 630 nm.  Lea y anote las absorbancia de todos los tubos. BLANCO ESTANDAR MUESTRA Reactivo de 2.5ml 2.5ml 2.5ml albumina 

Suero patron

0.01ml

Suero problema

0.01ml

OBSERVACIONES Y RESULTADOS: CONCLUCIÒN: Cuestionario. 1.- ¿Cuál es la proteína plasmática más abundante? abund ante? 2.- ¿donde es sintetizada la albúmina? 3.- ¿Cuántas cadenas polipetida y cuantos cuan tos aminoacidos constituyen la albúmina? 19


4.- ¿funciones de la la albúmina? 5.- ¿Qué se produce cuando la concentración de albúmina disminuye en sangre de manera manera importa importante nte dismin disminuyend uyendo o la presión presión osmóti osmótica ca con la consecu consecuent ente e extravasación del H2O? 6.- ¿Qué entiende por hipoalbuminemia? 7.- ¿diga 2 patologías que produzcan hipoalbuminemia? 8.- ¿Qué entiende por hiperalbuminemia? 9.- ¿diga un estado patológico en el que se presenta hiperalbuminemia?

PRACTICA NO. 10. TRIGLICERIDOS GPO (LIQUIDO) PRINCIPIO: Trigliceridos Glicerol + ATP

lipasa GK

GliceroL-1-fosfato + O2

glicerol + acidos grasos gliceroL-1-fosfato + ADP GPO

DAP + H2O2

H2O2 + 4-AA + 4-clorofenol POD quinoneimina + HCl HCl + 2 H2O H2O Los trigliceridos en suero son hidrolizados a glicerol y ácidos grasos libres por acción de la lipasa. En presencia de ATP y glicerol cinasa (GK) el glicerol se convier convierte te a glicero glicerol-1 l-1-fo -fosfa sfato. to. El glicero glicerol-1 l-1-fo -fosfa sfato to es despues despues oxidado oxidado por la enzima glicerol-fosfato oxidasa (GPO) para obtener peroxido de hidrogeno. La condensacion del peroxido con 4-clorofenol y 4-aminofenazona en presencia de peroxidasa (POD) produce una quinineimina de color rojo seco el cual se absorbe a o cerc cerca a de 500 500 nm. nm. La inte intens nsid idad ad del del comp comple lejo jo colo colore read ado o form formad ado o es directamente proporcional a la cantidad de trigliceridos en la muestra. REACTIVOS: Buffer de Good (pH 7.3-7.5) 50 mM, 4-clorofenol, ATP ATP 0.5 mM, sal de magnesio 12 mM, 4-aminofenazona 0.3 mM, glicerol cinasa (microbial) > 250 U/L, glicerolfosf fosfat ato o oxida oxidasa sa (mic (micro robi bial al)) > 200,0 200,000 00 U/L, U/L, surf surfact actant antes es,, esta estabi bililiza zador dores es y preservativos, incluido azida de sodio (0.1 %). MATERIAL: 20


• • • • • • •

Reactivo de trigliceridos GPO Pipetas automatizadas Tubos de ensayo Cronometro Bloque termico Espectrofotometro capaz de leer a 500 nm Estandar o calibrador de trigliceridos

PROCEDIMIENTO MANUAL: 1. Identificar los tubos: blanco, estandar control, etc. 2. Pipetear 1 mL de reactivo en cada tubo. 3. Agregar 10 uL de suero a sus respectivos tubos. Mezclar sua vemente. 4. Incubar todos los tubos por 5 minutos. 5. Ajustar el espectrofotometro a 0 con el blanco (500-520 nm) 6. Leer y anotar absorbancias. El color final es estable por 60 minutos. VALORES ESPERADOS: 44-148 mg/dL. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. CALCULOS: NOTA.- Los trigliceridos se expresan en mg/dL o mmol/L mg/dL= mg/dL= Abs. (desco (desconoci nocido) do)// Abs. Abs. (estand (estandar) ar) x concen concentra tracion cion std trigli trigliceri ceridos dos mg/dL. Para convertir el valor a mmol/L, se debe multiplicar el resultado por 0.0113. OBSERVACIONES Y RESULTADOS: CONCLUCIÒN:

PRACTICA NO. 11. COLESTEROL PRINCIPIO. col. esterasa Ésteres de colesterol.

colesterol + ac. Grasos Col. oxidasa

Colesterol + H2O

colesterol 3-one + H2O2

21


H2O2 + 4-AAP + fenol

POD

quinoneimina + 4H2O

La intensidad de color rojo es directamente proporcional al colesterol colesterol total en la muestra cuando se lee a 500 nm. REACTIVOS 4-AAP. 4-AAP. 3 mM: mM: colesterol estearasa - 150 u/l ; colesterol oxidasa 150U/l: fenol 15 mM; buffer fosfato pH 6.8; estabilizadores no reactivos y preser vativos. El reactivo esta listo para usarse. No se debe utilizarse si esta turbio. INTERFERENCIA Algunas drogas y sustancia pueden afectar la determinación de colesterol. Material Reactivo de colesterol Pipetas automatizadas Tubo de ensayo Cronometro Bloque térmico Espectrofotómetro capaz de leer a 500 nm. • • • • • •

PROCEDIMIENTO (MANUAL) 1. identifica identificarr los tubos: tubos: blanco, blanco, estánd estándar ar.. Control, Control, etc. etc. 2. pipetear pipetear 1 ml de reactivo reactivo en en cada tubo. tubo. Precalentar Precalentar a 37°C 37°C por lo menos menos por 5 min. 3. agrega agregarr 10 UL de suero suero a sus sus respect respectivo ivoss tubos. tubos. 4. incu incubar bar los los tubo tuboss por por 5 min. min. 5. ajusta ajustarr el espec espectrof trofotó otómet metro ro a 500 500 nm. 6. leer leer y anotar anotar la absorba absorbanci ncia. a. VALORES OBSERVADOS Colesterol deseable 200 mg/dl Colesterol alto 240mg/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. CALCULOS ABS= ABSORVANCIA Mg / dl =

abs. (Desconocido)

* Concentración de colesterol mg/ dl

Abs. (Estándar) 22


OBSERVACIONES Y RESULTADOS: CONCLUCIÒN:

23

Manual de practicas de bioquimica metabolica

Recommend Documents