BAB V PEMBAHASAN 5.1. 5.1. Simpl Simplis isia ia
Meto Metode de pemi pemisa saha han n meru merupak pakan an suat suatu u meto metode de yang ang dila dilaku kuka kan n untu untuk k memisah memisahkan kan suatu suatu senyaw senyawaa atau zat hasil hasil metabo metabolism lismee dari dari bahan bahan awalny awalnya, a, misalny misalnyaa tumbuh tumbuhan. an. Dalam Dalam tumbuh tumbuhan an terdap terdapat at dua hasil hasil metabo metabolism lisme, e, yaitu yaitu metabo metabolit lit primer primer dan metabo metabolit lit sekund sekunder er.. Metabo Metabolit lit primer primer merupa merupakan kan suatu suatu produk utama yang terdapat dalam tumbuhan, yang pada umumnya dimiliki oleh semua tumbuhan walaupun berbeda famili, genus, ataupun spesiesnya. Misalnya adala adalah h karb karboh ohid idra rat, t, prot protei ein, n, dan dan lema lemak. k. Seda Sedang ngka kan, n, meta metabo bolit lit seku sekund nder er merupakan merupakan produk kedua yang tidak dimiliki dimiliki oleh setiap tumbuhan, tumbuhan, umumnya umumnya berfungsi sebagai zat pertahanan dan zat penarik bagi lawan jenisnya misalnya saja glikosida, flavonoid, alkaloid, dan lain sebagainya. Untuk memperoleh hasil metabolit metabolit sekunder sekunder ini, biasanya biasanya dilakukan dilakukan isolasi lebih lanjut sebab senyawa senyawa metabolit sekunder diyakini dan telah diteliti dapat memberikan manfaat bagi kehidupan manusia, antara lain manfaatnya dalam bidang kesehatan, pangan dan pertanian. Isolasi suatu senyawa kimia dari bahan alam merupakan suatu proses yang menggunakan metode yang sangat bervariasi. al ini dikarenakan sifat!sifat dari senyawa aktif yang yang ada dalam tumbuhan tumbuhan tersebut berbeda!beda berbeda!beda sehingga sehingga untuk memperolehnya dalam bentuk tunggal juga diperlukan beberapa metode. Sebelum dilakukan metode pemisahan, tumbuhan, hewan atau bagiannya dibuat menjadi simplisia terlebih dahulu. Simplisia adalah bagian tanaman atau bahan alam yang belum mengalami mengalami proses pengolahan apapun, ke"uali dinyatakan lain, berupa telah dikeringkan. Simplisia terbagi # jenis, yaitu simplisia nabati, simplisia hewani, dan simplisia mineral. Simplisia nabati adalah simplisia yang berupa tanaman utuh, bagian dari tanaman atau isi sel dengan "ara tertentu dipisah dipisahkan kan dari dari tanama tanamanny nnyaa dan belum belum berupa berupa zat kimia kimia murni. murni. Sedang Sedangkan kan simplisia hewani adalah simplisia yang berupa hewan utuh, bagian hewan, atau zat!zat berguna yang dihasilkan oleh hewan dan belum berupa zat kimia murni. Simplisia mineral $pelikan% adalah simplisia yang berupa bahan!bahan pelikan atau mineral yang belum diolah atau telah diolah dengan "ara sederhana dan
belum berupa zat kimia murni. &embuatan simplisia dilakukan dalam ' tahap yaitu yaitu tahap tahap pengum pengumpul pulan an bahan bahan baku, baku, sortasi sortasi basah, basah, pen"u" pen"u"ian ian,, perajan perajangan gan,, pengeringan, sortasi kering, pengemasan dan pemeriksaan mutu. Simplisia yang digunakan pada praktikum ini adalah batang keladi $ Araceae $ Araceae caladium%, caladium%, kayu se"ang $Caes Caesal alpi pini nia a sapp sappan an (.%, (.%, buah buah dan dan daun daun mahk mahkot otaa dewa dewa $ Phaleria macrocarpa%, macrocarpa %, daun sisik naga $ Drymoglossum piloselloides (.% serta batang sirsak $ Annona Annona muricata%. muricata%. )anama anaman n keladi keladi merupa merupakan kan salah salah satu famili famili *ra"e *ra"eae ae dimana dimana "iri khas khas keladi sesuai dengan "iri semua anggota *ra"eae adalah bentuk bunganya. +unga keladi mempunyai tonjolan bulat memanjang dengan ujung tumpul yang disebut spadiks. Spadiks di bungkus oleh selundang yang disebut spata. Umumnya warna spadiks sesuai dengan spatanya. Saat masih muda spata membungkus spadiks dengan dengan rapat rapat kemudi kemudian an mekar mekar,, sehingg sehinggaa spadik spadikss akan akan terlih terlihat at dimana dimana spata spata memiliki memiliki warna yang yang beragam, beragam, tetapi satu spata umumnya umumnya hanya hanya terdiri terdiri dari satu atau dua warna. andungan kimia yang terdapat pada daun dan bunga keladi adalah saponin, pada rimpang keladi mengandung flavonoida, serta bunga dan rimpangnya mengandung polifenol. Se"ang $Caesalpinia $Caesalpinia sappan (.% merupakan tanaman perdu yang umumnya tumbuh tumbuh ditemp ditempat at terbuk terbukaa sampai sampai keting ketinggia gian n - - m diatas diatas permu permukaan kaan laut. laut. )ingginya /!- m, batangnya berkayu, bulat dan berwana hijau ke"oklatan. &ada batang dan per"abangannya terdapat duri!duri yang bentuknya bengkok dan letaknya letaknya tersebar. tersebar. ayu se"ang mengandung mengandung asam galat, tanin, resin, resin, resorsin, resorsin, brasilin,
brasilein,
d!alfa!phellandrene,
os"imene,
minyak
atsiri.
Daun
mengan mengandun dung g ,-01! ,-01!,2 ,21 1 minyak minyak atsiri atsiri yang yang berbau berbau enak enak dan hampir hampir tidak tidak berwarna. ayu se"ang mempunyai berbagai ma"am khasiat antara lain sebagai pewarna pada bahan anyaman, kue, minuman atau sebagai tinta. arena ayu se"ang se"ang apabil apabilaa direbu direbuss akan akan membe memberik rikan an warna warna merah merah gading gading muda. muda. Selain Selain khasiat tersebut di atas, kayu se"ang juga berkhasiat untuk obat berbagai ma"am penyakit. +eberapa penyakit yang dapat diobati adalah diare, disentri, )+3, luka dalam, sifilis, darah kotor, berak darah, memar berdarah, malaria, tetanus, tumor, radang selaput lendir mata.
Mahkota dewa, atau yang dalam dunia biologi dikenal dengan nama Phaleria Macrocarpa ( ini, merupakan salah satu tanaman herbal yang populer sebagai tanaman obat. Se"ara fisik, mahkota dewa terlihat sama dengan yang lainnya. 4amun para ahli tanaman membagi klasifikasi mahkota dewa ke dalam -2 spesies yang disinyalir persebaran tumbuhnya tersebar ke 05 negara di dunia. Meski klasifikasi mahkota dewa oleh para ahli dibagi ke dalam -2 jenis, namun se"ara umum khasiat tanaman ini sama antara jenis yang satu dengan jenis lainnya. )anaman mahkota dewa memang telah lama dikenal sebagai tumbuhan obat yang ampuh melawan penyakit seperti eksim, tumor, kanker payudara, kanker rahim, diabetes melitus, hepatitis, kolesterol, lemah syahwat, disentri, leukemia dan masih banyak lagi lainnya. Mahkota dewa se"ara klinis tersusun dari berbagai kandungan senyawa aktif yang masing!masing memiliki efek yang baik untuk tubuh. Mahkota dewa juga memiliki sifat detoks sehingga baik untuk membantu mengeluarkan ra"un dari dalam tubuh. +agian dari tumbuhan yang dijadikan sebagai sampel untuk dianalisis senyawa aktifnya dalam praktikum ini adalah daun dan buah mahkota dewa. +uah mahkota dewa terdiri dari kulit, daging, "angkang, dan biji. +uah berbentuk bulat dengan diameter #!/ "m, permukaan li"in, beralur, ketika muda warnanya hijau dan merah setelah masak. Daging buah berwarna putih, berserat dan berair. andungan kimia yang terdapat pada buah mahkota dewa yaitu alkaloid, saponin, flavonoid, dan polifenol. Daun sisik naga $ Drymoglossum piloselloides (. 6olium% bertangkai pendek, berdaging tebal, berbentuk jorong atau jorong memanjang dan ujungnya tumpul serta membundar. 7arak antara daun yang satu dengan yang lainnya sangat dekat. +atang sirsak $ Annona muricata% berkayu keras dan ber"abang sedikit. *rah "abangnya tidak menentu atau berserakan sehingga sulit diatur. +atang sirsak umumnya ke"il, tetapi agak liat sehingga tidak mudah patah. ulit batang pohon sirsak mengandung senyawa tanin , fitosterol , "a!oksalat , murisine , dan alkaloid. ulit batang biasa dikonsumsi setelah direbus dengan air. *ir rebusannya digunakan untuk pengobatan penyakit asma, batuk, penenang dan hipertensi.
Masyarakat dari beberapa negara menggunakannya untuk menghangatkan tubuh, mengobati flu, dan sebagai antiparasit. )ahap pertama dalam pembuatan simplisia adalah pengumpulan bahan baku dimana dapat dilakukan dengan mengambil serta memilah bahan baku tumbuhan yang benar!benar baik untuk dapat dijadikan simplisia dimana kadar senyawa aktif dalam suatu simplisia berbeda!beda tergantung pada bagian tanaman yang digunakan, umur tanaman atau bagian tanaman pada saat panen, waktu panen, lingkungan tempat tumbuh dari simplisia. Selanjutnya tahapan sortasi basah dilakukan untuk membersihkan dan memisahkan kotoran!kotoran atau bahan! bahan asing lainnya dari bahan simplisia. Setelah itu bahan baku di"u"i untuk membersihkan zat pengotor yang masih tertinggal. +ahan baku yang telah di"u"i kemudian dirajang atau dipotong ke"il!ke"il dengan tujuan untuk memudahkan dalam proses pengeringan. Selanjutnya simplisia dikeringkan dimana bahan baku ini tidak kontak langsung dengan "ahaya matahari yang bertujuan untuk menjaga sel!sel yang ada dalam sampel sehingga tidak merusak kandungan senyawa aktif akibat paparan sinar U8 yang dapat mengakibatkan sedikitnya senyawa aktif yang akan didapatkan. )ujuan pengeringan yaitu agar didapatkan simplisia yang tidak mudah rusak dan dapat digunakan dalam jangka waktu yang lama. Dengan mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi enzimatik akan di"egah penurunan mutu atau perusakan simplisia. &roses pengeringan dapat dihentikan apabila berat sampel menjadi konstan setelah dilakukan tiga kali penimbangan. Dengan demikian maka dapat dinyatakan bahwa kandungan air yang ada dalam sampel sudah tidak ada kemudian dilakukan sortasi kering. Sortasi kering ini dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan benda!benda asing dan pengotor!pengotor lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering. Setelah itu, simplisia disimpan diwadah yang tertutup rapat. +ahan dan bentuk pengemasan harus sesuai, dapat melindungi dari kemungkinan kerusakan simplisia, dan dengan memperhatikan segi pemanfaatan ruang untuk keperluan pengangkutan maupun penyimpanannya. Sebelum digunakan biasanya dilakukan pemeriksaan mutu simplisia terlebih dahulu untuk mendapatkan simplisia yang benar!benar baik hasilnya. &emeriksaan mutu simplisia dilakukan pada waktu penerimaan atau
pembelian dari pengumpul atau pedagang simplisia. Simplisia yang diterima harus berupa simplisia murni dan memenuhi persyaratan umum. Sampel basah batang keladi yang digunakan adalah 2 kg dan berat simplisia kering yang diperoleh adalah sekita 5 gram. Simplisia kering kayu se"ang yang diperoleh sebesar # kg. Sampel basah daun mahkota dewa yang digunakan adalah # kg dan setelah dilakukan tahapan pembuatan simplisia, didapat berat simplisia kering adalah 2 kg. Sampel basah buah mahkota dewa adalah / kg sedangkan setelah diperoleh simplisia kering beratnya adalah 5 gram. Sampel basah daun sisik naga yang digunakan adalah # kg dan setelah dilakukan tahapan pembuatan simplisia, didapat berat simplisia kering adalah 2 kg. Sampel basah kulit batang sirsak yang digunakan adalah 2 kg dan sampel kering yang berhasil didapatkan adalah 2 g. 5.2. Ekstraksi
9kstraksi adalah metode pemisahan berdasarkan kelarutan suatu zat yang tidak saling "ampur atau kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut "airnya. Salah satu tujuan umum dari ekstraksi adalah untuk mengetahui identitas suatu senyawa kimia yang terdapat didalam simplisia tersebut. *da beberapa ma"am metode ekstraksi, yaitu infudasi, maserasi, perkolasi, refluks, so:hlet, destilasi uap dan evaporator . Metode ekstraksi yang digunakan untuk sampel kayu se"ang $Caesalpinia sappan%, yaitu metode refluks. Metode refluks memiliki prinsip yakni sampel yang akan diekstraksi diletakkan didalam labu alas bulat bersama dengan "airan penyari yang akan digunakan. Uap penyari mengalami kondensasi oleh pendingin balik, embun yang terbentuk kemudian turun kembali ke dalam labu sambil melarutkan zat aktif. &elarut yang digunakan adalah etanol. al ini dikarenakan sifat etanol yang semi polar sehingga dapat melarutkan atau menarik senyawa dengan tingkat kepolaran yang tinggi dan senyawa dengan tingkat kepolaran yang rendah, memiliki titik didih yang rendah sehingga mudah untuk dipisahkan atau diuapkan antara ekstrak dengan "airan penyari. Dalam pemilihan pelaru harus dipertimbangkan sifat!sifat dari pelarut men"akup titik didih,
kemudahan untuk terbakar, kamampuan untuk menguap, harga, serta tingkat toksisitas pelarut. elebihan dari metode refluks adalah digunakan untuk mengekstraksi sampel!sampel yang mempunyai tekstur kasar dan tahan terhadap pemanasan langsung sedangkan, kerugiannya adalah membutuhkan volume total pelarut yang besar. Simplisa kering direfluks dengan pelarut etanol dalam labu alas bulat. )idak semua sampel digunakan sebab labu alas bulat yang digunakan hanya dapat menampung beberapa gram sampel. Dipasangkan labu alas bulat pada rangkaian alat refluks, tidak lupa menambahkan batu didih kedalam labu alas bulat untuk menghindari terjadinya bumping dalam labu. Dinyalakan alat refluks dan direfluks "airan selama kurang lebih 2 atau # jam. Selanjutnya ekstrak dipekatkan menggunakan rotary evaporator dengan tujuan untuk memisahkan antara ekstrak dengan sisa pelarut. &rinsip alat ini yaitu destilasi dalam kondisi vakum. Sampel dipanaskan dalam kondisi vakum sehingga titik didih untuk pelarut menjadi turun dan lebih "epat mengalami penguapan. &elarut yang menguap terkondensasi dan tertampung pada labu alas bulat lainnya. emudian ekstrak hasil rotary diuapkan lagi pada waterbath untuk menguapkan se"ara sempurna pelarut yang masih tertahan pada ekstrak. Sehingga diperoleh ekstrak dalam konsistensi lebih pekat dengan warna "oklat kemerahan seberat 2 gram. Metode ekstraksi yang digunakan pada sampel kulit batang sirsak $ Annona muricata (% ialah metode sokletasi. Metode sokletasi ini dipilih karena pelarut yang digunakan lebih sedikit dan larutan penyari yang dialirkan melalui sifon tetap tinggal dalam labu, ekstraksi. Sokletasi merupakan ekstraksi padat!"air. 9kstraksi padat "air digunakan untuk memisahkan analit yang terdapat pada padatan menggunakan pelarut organik. &adatan yang akan diekstrak yaitu kulit batang sirsak terlebih dahulu dihaluskan
dengan "ara diiris!iris. emudian
sampel yang telah halus ditimbang lalu dibungkus dengan kertas saring. Setelah itu dimasukkan ke dalam kelongsong. &elarut yang digunakan ialah etanol. 9tanol digunakan karena dapat melarutkan hampir semua senyawa organik, baik polar maupun non!polar, selain itu etanol dapat mudah menguap sehingga mudah dipisahkan dari ekstrak. Selanjutnya labu kosong diisi dengan batu didih.
+atu didih merupakan benda yang ke"il, bentuknya tidak rata dan berpori yang biasanya dimasukkan ke dalam "airan yang sedang dipanaskan, batu didih yang digunakan pada per"obaan ini adalah batu didih sederhana yang dibuat dari pe"ahan keramik karena tidak bisa larut dalam "airan yang dipanaskan serta tahan terhadap pemanasan. )ujuan dari penambahan batu didih adalah untuk meratakan panas dan menghindari terjadinya titik lewat didih. &elarut organiknya yaitu etanol dimasukan dalam labu alas bulat dan dimasukkan ke mantel pemanas listrik. elongsong yang sudah berisi sampel, kemudian dipasang pada seperangkat alat sokletasi. elongsong disambungkan dengan kondensor dan labu alas bulat yang ditempatkan pada mantel pemanas listrik. &rinsip dasar metode ini adalah "airan penyari dipanaskan, uap "airan penyari akan naik ke atas melalui pipa samping naik kekondensor, uap pengembun dan menetes ke dalam kelonsong berisi sampel yang diekstraksi. etika "airan penyari men"apai ketinggian ujung sifon, seluruh "airan dalam kelongsong akan mengalir melalui sifon dan kembali ke wadah labu alas bulat, proses ini disebut satu siklus. &roses ini akan terjadi se"ara berulang!ulang. Semakin banyak terjadinya siklus maka proses pemisahan akan maksimal dan proses ini dihentikan pada saat warna pelarut berubah menjadi bening. 3ara ini menguntungkan karena panas tidak melalui serbuk simplisia, tetapi melalui pipa samping. +erdasarkan per"obaan yang dilakukan diperoleh hasil ekstraksi dengan total # siklus dengan pangulangan ekstraksi sebanyak / kali. )ahap selanjutnya adalah memekatkan ekstrak yang didapat dengan menggunakan rotary evaporator dengan tujuan untuk memisahkan ekstrak dengan pelarut. Evaporator adalah sebuah alat yang berfungsi mengubah sebagian atau keseluruhan sebuah pelarut dari sebuah larutan dari bentuk "air menjadi uap. Evaporator mempunyai dua prinsip dasar, untuk menukar panas dan untuk memisahkan uap yang terbentuk dari "airan. Evaporator umumnya terdiri dari tiga bagian, yaitu penukar panas, bagian evaporasi $tempat dimana "airan mendidih lalu menguap% dan pemisah untuk memisahkan uap dari "airan lalu dimasukkan ke dalam kondensor $untuk diembunkan atau kondensasi%. asil dari evaporator biasanya dapat berupa padatan atau larutan berkonsentrasi. 9vaporasi
dilakukan pada suhu 5o untuk menghindari kerusakan senyawa metabolit sekunder karena beberapa senyawa metabolit sekunder mudah rusak pada suhu tinggi. Setelah dievaporator , diperoleh ekstrak kasar etanol berwana merah ke"oklatan dengan berat -- gram. Metode
ekstraksi
yang
digunakan pada
sampel daun
sisik
naga
$ Drymoglossum piloselloides (.% adalah metode maserasi. Maserasi dipilih karena pengerjaannya yang mudah dan hanya memerlukan peralatan yang sederhana. ekurangan dari maserasi adalah dibutuhkan volume pelarut ekstrak yang sangat banyak dan wadah pengujian yang besar. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam "airan penyari, tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam "airan penyari. +ahan yang diekstraksi dalam metode ini adalah bahan yang tidak tahan terhadap panas, dan simplisianya bertekstur lunak. &rinsipnya adalah simplisia akan direndam dengan pelarut yang sesuai, sehingga pelarut akan masuk kedalam sel yang ada dalam simplisia dan melarutkan zat yang ada dalam simplisia. Dalam pemilihan pelarut dapat berdasarkan pada prinsip like dissolves like karena pelarut akan menarik senyawa sesuai dengan tingkat kepolaran. &elarut yang digunakan pada tahap ini adalah pelarut etanol. Dalam pemilihan pelarut harus berdasarkan sifat! sifat pelarut termasuk titik didih, kemudahan pelarut terbakar, harga, kemampuan menguap serta tingkat toksisitas pelarut. Sampel kering dengan berat 5 gram, direndam dengan pelarut etanol 2 liter. Dimasukkan dalam toples yang tertutup rapat dan diaduk sesekali. asil akhir dari poses maserasi daun sisik naga menghasilkan laurutan ekstrak berwarna hijau muda. emudian larutan ekstrak dipekatkan menggunakan
rotary
evaporator . al ini bertujuan untuk memisahkan ekstrak dengan pelarut. emudian ekstrak yang telah dipekatkan, diuapkan kembali pada water bath untuk menguapkan se"ara sempurna pelarut yang masih tersisa pada ekstrak. asilnya diperoleh ekstrak yang lebih pekat dengan warna hijau muda. +erat ekstrak kental yang diperoleh adalah /#,- gram. Metode ekstraksi yang digunakan pada sampel batang keladi $ Araceae caladium% dan buah mahkota dewa $ Phaleria macrocarpa% adalah metode
maserasi juga. asil akhir dari poses maserasi batang keladi menghasilkan laurutan ekstrak yang berwarna hijau pekat yang menandakan bahwa pigmen warna pada batang keladi juga ikut larut dalam pelarut etanol. Setelah itu, larutan ekstrak dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator yang bertujuan untuk memisahkan ekstrak dengan pelarut yang digunakan. emudian ekstrak yang telah dipekatkan dengan menggunakan alat rotary evaporator , diuapkan kembali pada waterbath untuk menguapkan se"ara sempurna pelarut yang masih tersisa pada ekstrak. +erat ekstrak kental sampel batang keladi yang diperoleh adalah -00,0 gram. Sedangkan, berat ekstrak kental sampel buah mahkota dewa adalah #- gram dan ',; gram. Metode ekstraksi yang digunakan pada sampel daun mahkota dewa $ Phaleria macrocarpa% adalah metode perkolasi. &erkolasi merupakan "ara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan "airan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. &rinsipnya adalah serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. 3airan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk sampel, "airan penyari akan melarutkan zat aktif dalam sel!sel yang dilalui men"apai keadaan jenuh. Sampel kering dengan berat 5 gram, direndam dengan pelarut etanol 2 liter. Dimasukkan dalam toples yang tertutup rapat dan diaduk sesekali. asil akhir dari proses perkolasi daun mahkota dewa menghasilkan laurutan ekstrak berwarna hijau muda. emudian larutan ekstrak dipekatkan menggunakan
rotary
evaporator . al ini bertujuan untuk memisahkan ekstrak dengan pelarut. &rinsip dalam alat ini adalah sampel dipanaskan menjadi vakum sehingga titik didih pelarut menjadi turun dan lebih "epat mengalami penguapan. &elarut yang menguap akan terkondensasi dan tertampung pada labu alas bulat lainnya. emudian ekstrak yang telah dipekatkan, diuapkan kembali pada water bath untuk menguapkan se"ara sempurna pelarut yang masih tersisa pada ekstrak. asilnya diperoleh ekstrak yang lebih pekat dengan warna hijau muda. +erat ekstrak kental yang diperoleh adalah /#,- gram.
5.3. Fraksinasi
6raksinasi adalah metode pemisahan senyawa berdasarkan kelarutannya didalam pelarut tertentu. 6raksinasi terbagi dalam beberapa metode, pemilihan metode fraksinasi yang digunakan dalam situasi tertentu bergantung pada beberapa faktor yaitu sifat senyawa yang terdapat dalam ekstrak, nasib awal fraksi yang dipisahkan, keamanan, ketersediaan dan harga peralatan serta bahan yang akan digunakan. &enggunaan metode fraksinasi pada per"obaan ini adalah ekstraksi "air!"air, ekstraksi "air!padat langsung dan ekstraksi "air!padat tak langsung. &rinsip metode "air padat adalah sampel langsung dilarutkan dengan pelarut yang akan digunakan, dimulai dari pelarut yang non!polar terlebih dahulu lalu, ke pelarut polar. *lasan penggunaan metode ini, dikarenakan ekstrak yang diperoleh sudah kental dan jumlahnya banyak sehingga dapat langsung dilarutkan dengan pelarut yang akan digunakan. elebihan dari metode ini adalah fraksi yang diperoleh lebih banyak daripada metode lain sedangkan, kerugian dari metode ini adalah tidak ekonomis karena menggunakan banyak pelarut. 9kstraksi "air!"air merupakan pemisahan komponen kimia diantara dua pelarut yang tidak saling ber"ampur dimana sebagian komponen larut pada fase pertama dan sebagian larut pada fase kedua. &roses fraksinasi ini dilakukan dengan menggunakan "orong pisah. &rinsip "orong pisah adalah memisahkan zat atau senyawa tertentu yang teerdapat dalam sampel berdasarkan perbedaan berat jenis antara dua fase pelarut yang tak saling "ampur. 9kstraksi "air!padat tak langsung yaitu ekstraksi "air!padat silika dimana pemilihan metode fraksinasi yang digunakan bergantung pada beberapa faktor yaitu sifat senyawa yang terdapat pada dalam ekstrak, nasib awal fraksi yang dipisahkan, ketersediaan dan harga peralatan serta bahan yang akan digunakan serta keamanan. 6raksinasi pertama menggunakan ekstrak etanol kayu se"ang $Caesalpinia sappan%. Mula!mula ekstrak dilarutkan dengan pelarut n!heksan sampai larut, larutan yang diperoleh ditampung dalam botol ka"a. emudian ekstrak dilarutkan dengan pelarut etil asetat dan larutan ditampung dalam botol ka"a yang berbeda. emudian ekstrak dilarutkan dengan pelarut n!butanol dan larutan ditampung dalam botol ka"a yang berbeda. )erakhir dilarutkan dengan air dan ditampung
juga larutan dalam botol bensin yang berbeda. Setiap pelarut yang digunakan diulang hingga warna larutan pada pelarut tersebut menjadi bening, barulah dilanjutkan ke pelarut selanjutnya. )ujuan pengulangan ini adalah agar penarikan atau pemisahan senyawa berlangsung sempurna dengan tingkat kepolaran yang sesuai dengan masing!masing pelarut. &roses fraksinasi dimulai dari senyawa non polar terlebih dahulu, disebabkan karena apabila yang digunakan adalah pelarut polar, maka ditakutkan pelarut polar akan menarik semua senyawa yang terdapat dalam ekstrak dan tidak terjadi pemisahan karena pelarut polar "enderung dapat melarutkan senyawa polar maupun non polar. Sehingga digunakan pelarut non polar terlebih dahulu karena pelarut non polar hanya dapat melarutkan senyawa non polar, sehingga dapat terjadi pemisahan senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya.asil fraksinasi yang diperoleh diuapkan dalam wadah yang berbeda!beda di atas penangas air untuk mendapatkan fraksi kering. Setelah dilakukan penguapan, berat fraksi n!heksana yang diperoleh adalah -,- gram, fraksi etil asetat ' gram, fraksi n!butanol -,/ gram, dan fraksi air ,/ gram. 6raksinasi kedua menggunakan ekstrak etanol batang sirsak $ Annona muricata%. 9kstrak kasar etanol dien"erkan dengan air lalu diaduk hingga homogen, kemudian dimasukkan ke dalam "orong pisah. (alu difraksinasi berturut!turut dengan pelarut n!heksana, etil asetat, dan n!butanol. )erlebih dahulu dimasukkan n!heksan ke dalam "orong pisah yang berisi ekstrak lalu dilakukan pengo"okan hingga diperoleh fraksi n!heksana dan fraksi air dan ditampung fraksi n!heksana. al ini dilakukan terus hingga fraksi bewarna jernih. Setelah jernih dilakukan pergantian pelarut yaitu etil asetat dan dilakukan hal yang sama seperti pengerjaan n!heksan hingga diperoleh fraksi etil asetat dan fraksi air. Selanjutnya fraksi air difraksinasi dengan n!butanol hingga diperoleh fraksi n!butanol dan fraksi air. asil ekstraksi "air!"air terhadap ekstrak etanol kental diperoleh fraksi n!heksana sebanyak ,< g berwarna bening, fraksi etil asetat sebanyak - g berwarna "okelat muda, dan fraksi n!butanol sebanyak ,5 g berwarna "okelat tua. 6raksinasi ketiga menggunakan ekstrak etanol buah mahkota dewa $ Phaleria macrocarpa%. 9kstrak yang dilarutkan terlebih dahulu dengan sedikit etanol agar ekstrak dapat lebih mudah larut. emudian ditambahkan dengan
pelarut air, diaduk sampai homogen. (arutan ekstrak tersebut kemudian dimasukkan ke dalam "orong pisah dan ditambahkan pelarut yang lebih non polar terlebih dahulu, yaitu n!heksan. emudian "ampuran yang ada pada "orong pisah tersebut diko"ok dengan kuat agar kedua larutan tersebut ter"ampur, kemudian tutup "orong pisah sesekali dibuka untuk melepaskan tekanan uap yang berlebihan di dalam "orong pisah. 3orong pisah ini kemudian didiamkan agar pemisahan antara dua fase berlangsung. Setelah terbentuk dua lapisan, maka lapisan bawah diambil dan lapisan atas ditampung pada botol. 7ika larutan pada lapisan atas berwarna bening, maka pelarut n!heksana diganti dengan pelarut etil asetat. (apisan bawah yang berupa ekstrak dan pelarut air dimasukkan kembali ke dalam "orong pisah dan ditambahkan pelarut etil asetat, dan diulangi prosedur yang sama seperti
pelarut
n!heksana.
(alu
diulangi
prosedur
selanjutnya
dengan
menggunakan pelarut n!butanol dan air. Setelah dilakukan pemisahan pada "orong pisah dan pelarut!pelarut tersebut ditampung dalam wadah yang kemudian diuapkan kembali untuk mendapatkan hasil dari fraksi yang selanjutnya dilanjutkan dengan metode kromatografi lapis tipis. 6raksinasi keempat menggunakan ekstrak etanol sisik naga $ Drymoglossum piloselloides%. Sebelum dilakukan fraksinasi ditambahkan silika terlebih dulu sebelum dilakukan fraksinasi. al ini dikarenakan larutan ekstrak daun sisik naga yang tidak kering. &enambahan silika dengan perbandingan -=-. Setelah itu pada ekstrak yang telah ber"ampur dengan silika ditambahkan pelarut n!heksana, kemudian etil asetat, n!butanol dan yang terakhir air. asilnya didapat bahwa berat fraksi n!heksana yang diperoleh adalah ,/ gram, berat fraksi etil asetat yang diperoleh adalah ,/ gram, berat fraksi n!butanol yang diperoleh adalah -,- gram, dan berat fraksi air yang diperoleh adalah 22,'; gram. 6raksi yang dapat dilanjutkan pada proses romatografi (apis )ipis $()% adalah fraksi yang memiliki hasil lebih banyak yaitu fraksi n!heksana dan fraksi etil asetat. *lasan tidak digunakan fraksi n!butanol dan air adalah karena jumlah senyawa yang memiliki tingkat kepolaran serupa tidak dalam jumlah yang banyak. 6raksinasi kelima menggunakan ekstrak etanol daun mahkota dewa $ Phaleria macrocarpa%. Sebelum dilakukan fraksinasi ditambahkan silika terlebih
dulu sebelum dilakukan fraksinasi. al ini dikarenakan larutan ekstrak daun mahkota dewa yang tidak kering. &enambahan silika dengan perbandingan 2=-. Setelah itu pada ekstrak yang telah ber"ampur dengan silika ditambahkan pelarut n!heksana, kemudian etil asetat, n!butanol dan yang terakhir air. asilnya didapat bahwa berat fraksi n!heksana yang diperoleh adalah ,/ gram, berat fraksi etil asetat yang diperoleh adalah ,/ gram, berat fraksi n!butanol yang diperoleh adalah -,- gram, dan berat fraksi air yang diperoleh adalah 22,'; gram. 6raksi yang dapat dilanjutkan pada proses () adalah fraksi yang memiliki hasil lebih banyak yaitu fraksi n!heksana dan fraksi etil asetat. *lasan tidak digunakan fraksi n!butanol dan air adalah karena jumlah senyawa yang memiliki tingkat kepolaran serupa tidak dalam jumlah yang banyak. 6raksinasi keenam menggunakan ekstrak etanol batang keladi $ Arecacea caladium%. 6raksinasi pengendapan ini diawali dengan penimbangan ekstrak dimana ekstak yang digunakan ini tidak kental tetapi masih dalam keadaan "air sehingga membutuhkan silika gel yang halus untuk menarik senyawa dari senyawa non polar hingga senyawa polar. omposisi silika yang ditambahkan dengan ekstrak adalah sebanding dimana ekstrak yang berada dalam wadah ditambahkan dengan silika sambil diaduk dengan "epat hingga semua ekstak dapat meresap ke dalam silika kemudian ditambahkan dengan pelarut n!heksana lalu diaduk agar memper"epat proses penarikan senyawa non polar yang terdapat pada sampel kemudian yang larut pelarut n!heksana dipisahkan dengan endapan dari silika gel dan pelarut n!heksana ditampung di dalam botol. Selanjutnya residu yang tidak larut dengan n!heksana ditambahkan kembali dengan pelarut etil asetat kemudian diaduk untuk memper"epat proses penarikan senyawa oleh pelarut lalu yang larut pada pelarut etil asetat dipisahkan dengan endapan atau supernatannya kemudian untuk pelarut n!butanol dapat dilakukan dengan menambahkan pelarut n!butanol pada residu yang tidak larut pada pelarut etil asetat lalu diaduk dan pelarut n!butanol ditampung. Setelah pelarut n!butanol lalu pelarut air dimana residu yang tidak larut pada pelarut n!butanol ditambahkan kembali dengan pelarut air lalu diaduk dan ditampung pelarut air pada botol. Setelah itu masing! masing pelarut diuapkan dengan menggunakan water bath untuk dapat
mengguapkan pelarut yang digunakan sehingga diperoleh fraksi ekstrak yang diinginkan. &ada fraksi air yang telah diwater bath, fraksi ini mengalami kegagalan karena terdapat jamur sehingga fraksi ini tidak digunakan untuk pengujian selanjutnya. *ir merupakan suatu media tumbuh yang baik untuk bakteri, kapang dan khamir sehingga perlu penanganan yang lebih untuk mendapatkan fraksi air. 5.4. KLT
() $romatografi (apis )ipis% merupakan metode tahap awal yang digunakan untuk mengetahui senyawa yang ada dengan eluen yang tepat untuk melakukan pemisahan sehingga diperoleh kumpulan senyawa berupa noda yang memisah. romatografi lapis tipis adalah teknik pemisahan suatu senyawa berdasarkan tingkat kepolaran suatu senyawa dengan eluennya. 9luen merupakan "ampuran dua atau lebih pelarut. &rinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. )eknik ini biasanya menggunakan fase diam dari plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. euntungan dari penggunaan kromatografi lapis tipis adalah lebih mudah penggunaannya dan lebih murah. ekurangan dari teknik ini adalah prosedur pembuatan lempeng yang memerlukan tambahan waktu. Sebelum digunakan, plat silika gel diaktifkan terlebih dahulu sehingga pada saat digunakan plat silika gel dapat menjerap eluen dan berikatan dengan senyawa dalam sampel. &lat silika gel diaktifkan dengan "ara di oven pada suhu -- 3 selama # menit. &engaktifan plat () berfungsi untuk menghilangkan uap air dan udara sehingga eluen dapat bergerak ke batas atas. 9luen yang digunakan pada per"obaan ini ada # yaitu, metanol, etil asetat dan n!heksan dengan perbandingan yang berbeda!beda. &erbandingan pelarut yang digunakan ini dilakukan dengan tujuan untuk menurunkan polaritas pelarut, sehingga dapat menarik senyawa yang diinginkan. 9luen adalah "ampuran dua atau lebih pelarut
yang digunakan sebagai fase gerak. Sampel yang akan dianalisis dengan menggunakan () yaitu fraksi!fraksi tiap sampel yang telah ditentukan. 6raksi n!heksan, etil asetat dan atau fraksi n!butanol dari tiap sampel dilarutkan terlebih dahulu dengan pelarut metanol = kloroform $- = -% se"ukupnya, kemudian ditotolkan pada plat () dengan menggunakan pipa kapiler. &enotolan pada plat () menggunakan pipa kapiler dilakukan bertujuan agar mempermudah tempat penotolan pada plat () di tempat yang sama. Selain itu, ukuran pipa kapiler yang ke"il juga memungkinkan tidak menggunakan ekstrak yang banyak dan menghasilkan noda yang sesuai. &ada plat () digunakan batas atas dan batas bawah, batas atas berukuran ,/ "m dan batas bawah berukuran - "m. +atas atas berfungsi untuk mengetahui batas akhir eluen bergerak pada plat () dan batas bawah merupakan tempat untuk penotolan ekstrak. 9luen yang telah dibuat sesuai dengan perbandingan yang telah ditentukan dijenuhkan terlebih dahulu dengan "ara dimasukkan kertas saring ke dalam chamber yang telah besisi eluen, namun kertas saring tidak boleh sampai mengenai eluen langsung. al ini dikarenakan apabila kertas saring mengenai eluen maka eluen dapat terserap oleh kertas saring dan dikhawatirkan konsentrasi eluen dapat berubah sehingga proses elusi dapat terganggu. Selama proses penjenuhan, chamber harus dalam keaadaan tertutup rapat untuk menghindari terjadinya kontak eluen dengan udara. &enjenuhan eluen bertujuan untuk menjadikan eluen memenuhi chamber dalam bentuk gas sehingga kromatografi berjalan dengan baik. 7ika eluen tidak memenuhi chamber , maka distribusi daripada fase diam tidak akan dapat berjalan sehingga kromatografi gagal dan hasil yang diperoleh tidak teliti. &adahal dalam kromatografi bertujuan untuk menentukan senyawa apa yang terdapat dalam sampel dengan ditandai adanya ber"ak>noda yang menunjukkan suatu senyawa. )iap senyawa memiliki distribusi yang berbeda!beda dalam suatu fase gerak. Digunakan kertas saring agar diketahui apakah eluen sudah jenuh atau belum yang ditandai dengan basahnya kertas saring sebagai tanda bahwa eluen telah jenuh. Setelah eluen jenuh, kertas saring dikeluarkan kemudian dimasukkan plat yang telah ditotol dengan larutan fraksi ke dalam chamber dengan posisi plat berdiri dengan kemiringan /? dari
dinding chamber . 9luen yang merupakan fase gerak akan melarutkan komponen zat "ampuran yang ditotolkan pada plat (). omponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal, sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih "epat. Suatu pelarut yang bersifat polar akan tertahan pada silika gel yang bersifat polar sedangkan komponen yang bersifat non polar akan tertarik oleh eluen. Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak. al ini berdasarkan prinsip like dissolves like. Setelah eluen men"apai batas atas plat diambil dan diamati di bawah sinar U8 2/< nm dan #00 nm. Setelah diamati dengan sinar U8, kemudian disemprotkan menggunakan 2S@< -1 dan diamati kembali pada "ahaya tampak dan dibawah sinar U8 . )ujuan penyemprotan dengan 2S@< -1 adalah untuk menampakan noda ekstrak pada plat (). Mekanisme penampakkan noda pada sinar U8 yaitu suatu molekul yang mengabsorbsi "ahaya ultraviolet akan men"apai keadaan tereksitasi dan kemudian meman"arkan "ahaya tampak pada saat kembali ke tingkat dasar $emisi%, emisi inilah yang digambarkan sebagai fluoresensi $"ahaya berwarna%. &ada U8 2/< nm, plat akan berfluoresensi sedangkan noda akan tampak berwarna gelap, karena adanya daya interaksi antara sinar U8 dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada plat. 6luoresensi "ahaya yang tampak merupakan emisi "ahaya yang dipan"arkan oleh komponen tersebut ketika elektron tereksitasi dari tingkat energi rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kekeadaan semula sambil melepaskan energi. &ada U8 #00 nm, noda akan berfluoresensi dan plat berwarna gelap. &enampakan noda pada U8 #00 nm adalah karena adanya interaksi antara sinar U8 dengan gugus kromofor yang terikat oleh ausokrom yang ada pada noda tersebut. 6luoresensi "ahaya yang tampak merupakan emisi "ahaya yang dipan"arkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada U8 #00 nm terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluoresensi pada U8 #00 nm. )ujuan penyemprotan dengan 2S@< adalah untuk menampakan noda ekstrak pada plat (). &ada "ahaya tampak, terlihat noda naik pada plat. al ini karena
2S@< merusak gugus kromofor dan menyebabkan terjadinya pergeseran batokromik yang sebelumnya hanya bisa terlihat di U8, tetapi setelah disemprot 2S@< dapat dilihat langsung. &ergeseran batokromik adalah pergeseran pun"ak absorbsi ke arah panjang gelombang yang lebih besar $disebut juga red shift atau batocrhromic shift %. al ini terjadi karena pengaruh pelarut atau efek subsitusi. &ergeseran hipsokromik $hipsocromic shift atau blue shift % adalah pergeseran ke arah panjang gelombang yang lebih ke"il>pendek. &er"obaan pertama menggunakan fraksi 4!butanol, 4!heksana, dan etil asetat dari batang keladi. 9luen yang digunakan untuk fraksi n!heksana yaitu n! heksana = etil asetat <=-.. 9luen yang digunakan untuk fraksi etil asetat yaitu n! heksana dan etil asetat dengan perbandingan <=- dan #=-. 9luen yang digunakan untuk fraksi n!butanol yakni metanol dan etil asetat dengan perbandingan -=2 dan -=-. 4ilai Af () menggunakan eluen metanol dan etil asetat -=2 dan -= berturut!turut dari penampakan noda di U8 2/< nm dan #00 nm yakni ,;#, sinar tampak dan setelah disemprot 2S@yakni ,#/. &ada per"obaan plat () dengan fraksi n!heksana, digunakan eluen yaitu n! heksana dan etil asetat dengan perbandingan <=-. asilnya ialah diperoleh noda tampak namun masih berekor.4ilai Af dari penampakan noda #00 nm yakni ,<<, sinar tampak dan setelah disemprot 2S@< yakni ,05 Selanjutnya fraksi etil asetat digunakan dengan eluen n!heksan dan etil asetat dengan perbandingan <=- dan #=-. asil yang diperoleh yakni pada perbandingan <=- noda telah tampak pada lampu U8 2/< nm namun masih terdapat ekor. Sehingga dilakukan lagi dengan perbandingan yang berbeda yakni #=-, namun hasil noda yang diperoleh juga kurang baik karena noda pada plat () masih berekor. 4ilai Af dari klt yang dielusi dengan n!heksan dan etil asetat $<=- dan #=-% berturut!turut
dari
penampakan noda di U8 2/< nm dan #00 nm yakni ,##, .'; dan ,05, ,';, sinar tampak dan setelah disemprot 2S@yakni ,## dan ,<<. *dapun tujuan mengganti perbandingan dengan meningkatkan kepolaran ialah agar noda yang dihasilkan tidak terlalu naik hingga mengenai batas atas. Sedangkan tujuan menurunkan kepolaran ialah agar noda tidak berada terlalu bawah. arena diharapkan noda berada tepat di tengah plat (). asil pen"arian
eluen yang baik dalam memisahkan noda atau senyawa pada plat () ini kemudian dapat digunakan dalam pemisahan dengan metode kromatografi kolom. &er"obaan kedua menggunakan hasil dari fraksi n!heksana dan etil asetat kayu se"ang karena paling banyak larut pada pelarut ini, sehingga kemungkinan besar fraksi ini mengandung senyawa metabolit sekunder yang banyak. 9luen yang digunakan pada fraksi n!heksana adalah n!heksana=etil asetat dengan perbandingan <=-. *wal elusidasi menggunakan eluen n!heksana = etil asetat dengan perbandingan <=-, noda yang tampak sudah memisah karena tidak berekor dan tidak bertumpuk. )etapi nodanya terlalu di atas, sehingga dilanjutkan dengan peningkatan kepolaran dari eluen menjadi <=#. &eningkatan kepolaran dengan maksud agar diharapkan noda akan turun dan lebih terpisah lagi dengan senyawa lainnya. 4oda diturunkan agar terpisah dengan noda yang lainnya. asil elusidasi dengan eluen <=# adalah noda yang tampak memisah dengan baik dan letaknya tidak terlalu di atas seperti sebelumnya.4ilai Af pada penampakan noda sinar U8 2/< nm noda tidak tampak sedangkan pada U8 #00 sebesar ,'2 dan setelah disemprot 2S@
maksud agar diharapkan noda akan turun dan lebih terpisah lagi dengan senyawa lainnya. 4oda diturunkan agar terpisah dengan noda yang lainnya. asil elusidasi dengan eluen <=# adalah noda yang tampak memisah dengan baik dan letaknya tidak terlalu di atas seperti sebelumnya. Selanjutnya fraksi etil asetat digunakan dengan eluen n!heksan dan etil asetat dengan perbandingan <=- dan -=<, eluen metanol dan n!heksana -=<. asil yang diperoleh yakni pada perbandingan <=- noda telah tampak pada lampu U8 2/< nm namun masih berekor dan nodanya terlalu tinggi. Sehingga dilakukan lagi dengan perbandingan yang berbeda yakni -=<, namun hasil noda yang diperoleh juga kurang baik karena noda pada plat () masih berekor. emudian eluennya diganti dengan metanol dan n!heksana dengan perbandingan -=< noda yang tampak memisah dengan baik dan nodanya tidak terlau tinggi. 4ilai Af pada penampakan noda sinar U8 2/< nm dan #00 yakni ,;/, ,5/, ,22. &ada sampel daun sisik naga digunakan fraksi n!heksana dan etil asetat. 9luen yang digunakan yaitu eluen n!heksana dan etil asetat. Dimulai dari fraksi n! heksana dengan menggunakan eluen n!heksana = etil asetat <=-. asil noda yang didapatkan terdapat enam noda yang memisah dengan baik. emudian dilanjutkan dengan fraksi etil asetat dengan perbandingan eluen n!heksana = etil asetat <=-. asil noda yang didapatkan adalah terdapat penumpukkan noda dan selain itu noda juga berekor. al ini dapat disebabkan karena masih banyaknya senyawa yang belum dapat terbawa sesuai dengan kepolaran eluen yang telah ditentukan. Sehingga, dilanjutkan dengan menurunkan kepolaran eluen menjadi 2=-. &enurunan eluen diharapkan agar noda!noda yang menumpuk dapat terpisah dengan baik. asilnya adalah noda yang telah memisah dan tidak menumpuk. &ada fraksi n!heksana dengan eluen n!heksana = etil asetat $<=-% nilai Af pada sinar tampak adalah ,25B pada sinar U8 2/< nm adalah ,## dan pada U8 #00 nm adalah ,##. &ada fraksi etil asetat dengan eluen n!heksana = etil asetat $<=-% nilai Af pada "ahaya tampak adalah ,-
tidak mau mengikuti pergerakan eluen non polar dan "enderung tertahan pada plat silika yang bersifat polar dilihat dari nilai Af nya yang rendah. &ada sampel kulit batang sirsak, fraksi yang pertama diuji adalah fraksi n! heksan. &ada fraksi n!heksan digunakan eluen n!heksan = etil asetat dengan perbandingan $< = -%, eluen ini merupakan eluen yang sifatnya kurang polar. asil yang didapatkan dari hasil () fraksi n!heksan yaitu terlihat satu noda pada pengamatan dengan sinar U8 2/< nm, namun tidak terlihat adanya noda pada pengamatan dengan sinar U8 #00 maupun setelah disemprot dengan 2S@< -1. Selanjutnya dilakukan pengujian () lagi pada fraksi etil asetat batang sirsak menggunakan eluen n!heksan = etil asetat $< = -%. Sifat dari eluen ini adalah non polar. asil yang didapatkan adalah tidak ada noda yang tampak baik pada pengamatan dengan sinar U8 2/< nm, #00 nm maupun setelah disemprot dengan 2S@< -1. )idak adanya noda yang naik ini dapat disebabkan karena kemungkinan senyawa yang ada tidak bersifat bersifat non polar, sehingga nodanya tidak naik. Setelah itu, eluen diganti menjadi n!heksan = etil asetat $- = <% dimana sifat dari eluen ini adalah polar. asil yang didapatkan adalah tidak ada noda yang tampak baik pada pengamatan dengan sinar U8 2/< nm, #00 nm maupun setelah disemprot dengan 2S@< -1. al ini dapat disebabkan karena senyawa yang ada sifatnya semi polar, sehingga nodanya tidak naik meskipun telah digunakan eluen yang non polar maupun eluen yang polar. Selanjutnya eluen diganti dengan metanol = etil asetat $# = -%. asil yang didapatkan adalah tidak ada noda yang tampak baik pada pengamatan dengan sinar U8 2/< nm, #00 nm maupun setelah disemprot dengan 2S@< -1. 9luen keempat yang digunakan adalah metanol = etil asetat $2=-% dimana sifat dari eluen ini adalah semi polar. asil yang didapat dari pengujian ini adalah noda terlihat naik saat diamati dengan sinar U8 2/< nm, U8 #00 nm maupun saat disemprot dengan 2S@< -1, namun noda yang terlihat seperti garis lurus, hal ini dapat disebabkan karena eluen yang digunakan belum tepat sehingga senyawa yang ada belum terpisah dengan baik. Selanjutnya eluen yang digunakan adalah metanol = etil asetat $- = -%. asil yang didapat dari pengujian ini adalah noda terlihat naik saat diamati dengan sinar U8 2/< nm, U8 #00 nm maupun saat disemprot dengan 2S@< -1. &ada
pengamatan di sinar U8 2/<, terlihat < titik noda, sedangkan pada sinar tampak maupun U8 #00, noda terliihat seperti garis lurus yang tebal. Selanjutnya dilakukan pengujian () lagi pada fraksi n!butanol batang sirsak menggunakan eluen metanol = etil asetat $- = -%. asil yang didapatkan yaitu noda terlihat naik baik pada pengamatan di sinar U8 2/<, U8 #00 maupun setelah disemprot 2S@< -1. &ada pengujian ini terlihat 2 noda yang ada pada plat (). 9luen yang selanjutnya digunakan adalah metanol = etil asetat $2 = -%. asil yang didapatkan yaitu noda terlihat naik, baik pada pengamatan di sinar U8 2/<, U8 #00 maupun setelah disemprot 2S@< -1. &ada pengujian ini terlihat noda yang berbentuk seperti garis lurus, dan pada sinar U8 2/< juga terlihat noda yang berbentuk bulat yang ada pada plat () &ada fraksi etil asetat dengan eluen etil asetat = metanol $#=-% nilai Af pada sinar tampak adalah ,#B pada sinar U8 2/< nm adalah ,#2 dan pada U8 #00 nm adalah ,#2. &ada eluen etil asetat = metanol $2=-% nilai Af pada "ahaya tampak adalah ,-5B pada U8 2/< nm adalah ,-; dan pada U8 #00 adalah ,-;. arakter senyawa pada fraksi etil asetat berdasarkan nilai Af tersebut yaitu bersifat polar. al ini dikarenakan ke"enderungan dari noda yang tidak mau mengikuti pergerakan eluen semi!polar dan "enderung tertahan pada plat silika yang bersifat polar dilihat dari nilai Af nya yang rendah. &ada sampel buah makota dewa, fraksi yang diuji menggunakan () adalah fraksi n!heksana, etil asetat dan n!butanol. 9luen yang digunakan pada fraksi n! heksana adalah n!heksana = etil asetat $<=-% dan n!heksana = metanol $<=-%. &ada fraksi etil asetat, eluen yang digunakan adalah n!heksana = etil asetat $<=-%, n! heksaan = etil asetat $-=<%, n!heksana = etil asetat $-='%, n!heksana = etil asetat $-=-% dan metanol = etil asetat $-=-%. &ada fraksi n!butanol, eluen yang digunakan adalah n!heksana = etil asetat $<=-%, metanol = etil asetat $5=<%, metanol = etil asetat $<=5%, metanol = etil asetat $/=0% dan metanol = etil asetat $2=5%. &ada fraksi n! heksana, noda yang teramati tidak bergerak dari batas bawah jika dilihat pada sinar tampak maupun pada sinar U8. &ada fraksi etil asetat, noda yang teramati pada sinar U8 tampak berekor, sedangkan pada fraksi n!butanol, noda yang teramati juga tampak berekor pada sinar U8. 4ilai Af yang didapat pada fraksi etil asetat menggunakan metanol = etil asetat $-=-% adalah ,'' pada sinar tampak,
pada U8 2/< nm adalah ,;- dan pada U8 #00 nm ,;-. &ada fraksi n!butanol dengan eluen metanol = etil asetat $2=5% nilai Af pada sinar tampak adalah ,55, pada sinar U8 2/< nm adalah ,'5 dan pada U8 #00 nm adalah ,'5. &ada eluen metanol = etil asetat $/=0% pada "ahaya tampak adalah ,5<, pada U8 2/< nm adalah ,5; dan pada U8 #00 adalah ,5;. 9luen metanol = etil asetat $5=<% pada "ahaya tampak adalah ,'/, pada U8 2/< nm adalah ,; dan U8 #00 nm adalah ,;. 7umlah noda yang didapatkan adalah < noda. arakter warna noda pada sinar tampak adalah berwarna kuning, pada U8 2/< nm adalah "oklat dan pada U8 #00 nm adalah hijau kehitaman, arakter bentuk noda ada yang berekor dan bertumpuk. &ada fraksi etil asetat dapat teramati karakter senyawa dari nilai Af nya yaitu bersifat semi!polar karena kemampuannya mengikuti eluen semi!polar tinggi. &ada fraksi n!butanol dapat teramati karakter senyawa dari nilai Af nya yaitu "enderung bersifat polar. al ini dapat terlihat dari tingginya nilai Af pada saat elusi menggunakan eluen bersifat polar. 5.5. Islasi /./.-.romatografi olom onvensional
Metode
kromatografi
kolom
konvensional
adalah
suatu
metode
kromatografi klasik yang didasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu absorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya. &rinsip dari metode kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap dari masing!masing komponen. &ada kromatografi kolom, "ampuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom, penjerap yang berada dalam tabung ka"a, tabung logam atau bahkan tabung plastik. &elarut $fase gerak% dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. &ita senyawa bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom. *lat yang digunakan adalah kolom gelas yang diisi dengan zat padat aktif seperti silika gel sebagai fase diam. Cat yang dimasukkan melalui pun"ak kolom akan mengalir ke dalam zat penyerap. Cat diserap dari larutan se"ara sempurna oleh zat penyerapan berupa pita sempit pada ujung kolom dengan ke"epatan yang berbeda, sehingga terjadi pemisahan dalam kolom.
&ada kromatografi kolom konvensional hanya digunakan fraksi batang keladi. )ahap diawali dengan dilakukan preparasi kromatografi kolom yang dilakukan dengan membuat bubur silika. &embuatan bubur silika dengan perbandingan eluen dan silika adalah -=-. &erbandingan yang digunakan harus sesuai, jika silikanya terlalu sedikit maka tidak dapat memisahkan senyawa dengan maksimal, sedangkan jika eluennya terlalu sedikit maka dikhawatirkan tidak dapat mengelusi senyawa dengan optimal sehingga pemisahan menjadi tidak baik. Setelah silika siap, maka dimasukkan di dalam kolom, lalu dipipet sampel dan dimasukkan dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit. ran dibuka dan diatur tetesannya dan ditambahkan "airan pengelusi. (alu ditampung tetesan!tetesan yang keluar pada botol vial. *dapun alasan harus dibukanya kran pada saat awal ialah agar tidak terjadi keadaan mampat oleh silika gel di keseluruhan tabung kromatografi kolom.(alu ditutup kran agar eluen tidak keluar atau terbuang selama pengisian berlangsung. 4!butanol digunakan dalam tahap ini karena telah teramati pemisahan dengan baik pada proses (). 9luen yang digunakan yakni n!heksana dan etil asetat dengan variasi perbandingannya yaitu <=-, #=-, 2=-, -=2, -=<, -=;, serta etil asetat dan methanol dengan perbandingan -=-. *dapun tujuan dari dilakukannnya variasi perbandingan eluen terhadap fraksi n!butanol ialah untuk memastikan keberadaan senyawa di dalam sampel dengan baik dari tahap pemurnian senyawa aktif. asil dari fraksi!fraksi tersebut akan diperoleh dalam jumlah banyak sesuai dengan pemakaian volume eluen. +otol vial yang digunakan untuk menampung tetesan harus segera diganti dengan botol vial yang lain ketika terjadi perbedaan warna
dari tetesan
tersebut.
)erjadinya
perubahan
warna
kemungkinan
dikarenakan terdapatnya perbedaan kandungan dan konsentrasi senyawa serta keberadaan pengotor di dalam sampel.
/./.2. romatografi 3air 8akum $38%
romatografi 3air 8akum $38% merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan memisahkan crude etract menjadi fraksi!fraksinya yang lebih sederhana. &emisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum. 6asa diam yang digunakan dapat berupa silika gel. &rinsip dasar 38 ini adalah pemisahan se"ara adsorpsi dan partisi yang diper"epat dengan bantuan pompa vakum. euntungan 38 dibandingkan dengan kromatografi konvensional terletak pada jumlah fase gerak yang digunakan. &ada 38, konsumsi fase gerak hanya '1 atau lebih sedikit dibandingkan dengan kromatografi konvensional, sedangkan kekurangan metode ini adalah membutuhkan waktu yang "ukup lama. &ada 38 hanya menggunakan fraksi etil asetat kayu se"ang. 6ase diam yang digunakan adalah "ampuran silika gel kasar dan halus dengan perbandingan 2=-. Silika yang digunakan adalah 6 2/< dan . &ada 6 2/<, berarti gypsum $3aS@<% sebagai perekat, 6 berarti fluoresensi hingga plat berpendar di bawah sinar U8 2/< nm, angka 2/< menunjukkan besarnya panjang gelombang yaitu 2/< nm. Sedangkan silika gel adalah silika gel dengan tanpa adanya gypsum dan fluoresensi. Silika jenis ini biasa digunakan pada kromatografi kolom. 6ase diam dengan perbandingan -=- dengan ekstrak ini dimasukkan ke dalam kolom vakum yang terlebih dahulu telah dibilas dengan metanol. Dilakukan pemampatan silika gel dengan "ara dimasukkan n!heksana ke dalam kolom vakum dan vakum dijalankan. )etapi pada saat per"obaan berlangsung, tidak dilakukan pemampatan dengan n!heksana. emudian dimasukkan "ampuran bubur silika dengan ekstrak yang telah telah dilarutkan menggunakan metanol dan bagian atasnya ditutupi dengan kertas saring dan kapas agar menghindari per"ikan pada waktu penambahan
eluen.
Dilarutkan
menggunakan
metanolagar
terjadi
proses
rekristalisasi $pembentukan kristral kembali%. Ditambahkan / eluen se"ara berututan, yaitu n!heksana, n!heksana=etil asetat $-=#%, n!heksana=etil asetat $-=<%, n!heksana=etil asetat $-=/% dan metanol. Ditampung ke dalam botol ka"a dengan volume - m(. )ujuan penggunaan eluen yang bervariasi adalah untuk memastikan keberadaan senyawa dalam sampel dengan baik dari tahap pemurnian senyawa aktif yang nantinya akan terbentuk kristal. emudian dipilih beberapa
dari noda yang didapatkan untuk diujikan menggunakan (). asil dari 38 adalah noda I berwarna merah ke"okelatan yang memisah dengan minyak, noda II berwarna jingga, noda III berwarna merah jingga, noda I8 berwarna kuning ke"okelatan, noda 8 berwarna "okelat muda, noda 8I berwarna merah ke"okelatan, noda 8II berwarna kuning kehitaman, noda 8III berwarna kuning ke"okelatan, noda IE berwarna merah kehitaman, noda E berwarna merah kehitaman, noda EI berwarna merah kehitaman, noda EII berwarna merah, noda EIII berwarna merah dan endapan berwarna hitam ke"okelatan. Diambil / noda untuk dielusidasi dan diambil noda ketiga untuk dilanjutkan pada tahap ()&. anya diambil / noda karena pada noda!noda tersebut dianggap memiliki senyawa metabolit sekunder yang terbanyak dan sebagai perwakilan pada seluruh noda!noda yang didapatkan. /./.#. romatografi (apis )ipis &reparatif $()&% romatografi lapis tipis $()% preparatif merupakan salah satu metode pemisahan dengan menggunakan peralatan sederhana. etebalan penjerap yang sering dipakai adalah ,/!2 mm, ukuran plat kromatografi biasanya 2:2 "m. &embatasan ketebalan lapisan dan ukuran plat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan () preparatif. &enjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel. &lat yang digunakan terbuat dari lempengan ka"a dengan bubur silika yang di"etak di lempengan ka"a. &ada ()& menggunakan fraksi kayu se"ang dibuat bubur silika dengan perbandingan -=2 dengan menggunakan pelarut air. Dihomogenkan di dalam 9rlenmeyer bertutup dengan "ara digojog hingga homogen. asil fraksi kayu se"ang yang telah dilarutkan ditotolkan pada plat silika gel dengan "ara ditotolkan dari kiri ke kanan hingga membentuk seperti pita. 6raksi yang digunakan adalah noda Ia, noda Ib, noda III, noda 8 dan noda 8I. 4oda I dibagi menjadi 2, yaitu berwarna kuning muda dan merah ke"okelatan. )etapi perlu diperhatikan pada saat penotolan diusahakan tidak merusak atau membentuk lubang pada silika gel yang nantinya akan membuat hasil elusi yang miring dan noda yang tidak bulat. emudian dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen n!heksana=etil asetat
$-=#% yang telah dijenuhkan. asil dari elusidasi ini akan dikerik dan akan dilanjutkan dengan () 2 dimensi. &ita yang dikerok adalah pita yang berwarna ungu muda.*lasannya penggunaan pita ini karena terpisah dengan baik, bagian atas dan bawahnya tidak berwarna $tetap putih%, serta pita ini memiliki warna dan batas yang jelas. &ada ()& menggunakan fraksi batang keladi, terlebih dahulu menyiapkan bubur silika dengan perbandingan eluen dan silika -=-. asil pemilihan fraksi pada kromatografi kolom yaitu vial -', dari proses kromatografi kolom konvensional, ditotolkan pada plat () yang telah diaktifkan, dari kiri ke kanan se"ara berulang hingga larutan habis. emudian dikerik plat () dimana yang diambil ialah pita yang lurus dan berpisah dari pita!pita lainnya agar mempermudah dalam mendapatkan senyawa tunggal. Dikerik pada deret silika yang terdapat noda dan dikumpulkan dalam satu wadah yang diekstraksi menggunakan larutan metanol. Dipipet hasil ekstraksi pada bagian atas dalam tabung sentrifugasi, karena pada bagian bawahnya ialah endapan silika. *dapun tujuan dari sentrifugasi adalah memisahkan antara endapan silika dengan senyawa hasil ekstraksi. asil dari ()& ini kemudian akan di () lagi untuk melihat profil senyawa. asil yang diperoleh dalam pengujian ini ialah noda yang tidak tampak se"ara jelas. al tersebut kemungkinan dikarenakan larutan yang ditotol terlalu en"er sehingga tidak terlihat baik pada U8 2/< nm atau #00 nm. Selain itu dapat
juga
disebabkan
karena
pemisahan
senyawa
dengan
silika
gel
menggunakan sentrifuge tidak berjalan optimal dimana masih banyak ekstrak yang menyelebungi silika gel dan tidak larut dalam pelarut sehingga pengujian tidak dapat dilanjutkan pada () dua dimensi. /./.<.romatografi Dua Dimensi () 2 dimensi atau () 2 arah ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen!komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Af juga hampir sama sebagaimana dalam asam! asam amino. Af $retention factor % merupakan nilai jarak relatif Af pada pelarut. arga Af dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh eluen. Senyawa yang
memiliki nilai Af lebih besar, berarti memilki kepolaran yang rendah dan senyawa yang memiliki nilai Af ke"il berarti memiliki kepolaran yang tinggi. Selain itu, sistem 2 fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan se"ara berurutan pada suatu "ampuran sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda. () dua arah pada fraksi kayu se"ang dilakukan dengan melakukan penotolan sampel pada salah satu sudut plat () dan dielusi menggunakan eluen n!heksana=etil asetat $-=#%. Setelah eluen naik hingga batas atas, plat () dikeluarkan dan kemudian dielusi lagi dengan keadaan diputar ke arah kiri ; o. emudian hasil elusidasi diamati pada sinar lampu U8 2/< nm dan #00 nm. asil elusidasinya adalah noda berekor. Mungkin hal tersebut diakibatkan oleh eluen yang digunakan adalah eluen yang sama, tanpa diganti dengan eluen yang lain.
