Proses pemisahan merupakan proses perpindahan masa, perpindahan dapat terjadi jika senyawa-senyawa yang ada dalam campuran memiliki sifat fisika atau sifat kimia yang berbeda. Perbedaan sifat inilah yang menyebabkan kita dapat memisahkannya. Sebagai contoh kita dapat pisahkan satu zat karena berbeda dalam hal ukuran partikelnya, pemisahan dapat kita lakukan dengan pengayakan. Beberapa sifat fisika zat yang dapat dipergunakan misalnya berat jenis, muatan listrik, titik didih, titik beku dan lainnya. Selain itu sifat-sifat kimia juga dapat dipergunakan khususnya adalah interaksi kimia antara satu zat dengan zat lainnya. Secara teknis, pemisahan suatu campuran dapat dapat dilakukan dengan berbagai metode. Umumnya pemisahan dilakukan dengan mempertimbangkan fasa komponen dari campuran tersebut. Suatu campuran dapat berupa campuran homogen (satu fasa) atau campuran heterogen (lebih dari satu fasa). Campuran heterogen dapat dibentuk dari beberapa fasa misalnya padat padat, padat-cair, padat-gas, cair-cair, cair-gas, gas-gas, atau campuran ketiganya padat-cair-dan gas. Sehingga dalam proses pemisahan seringkali kita melakukan beberapa kali proses pemisahan serta mengkombinasikan berbagai teknik pemisahan agar mendapatkan hasil pemisahan yang diinginkan.
Teknik pemisahan, secara umum u mum dapat kita klasifikasikan sebagai pemisahan secara mekanik atau berdasarkan sifat fisika dan pemisahan secara k imia. Atas dasar ini teknik pemisahan kita bahas.
Campuran heterogen terdiri dari senyawa-senyawa denga n berat jenis berdekatan sulit dipisahkan. Membiarkan senyawa tersebut terendapkan t erendapkan karena adanya grafitasi berjalan sangat lambat. Beberapa campuran senyawa yang memiliki sifat seperti ini adalah koloid, seperti emulsi. Salah satu teknik yang dapat dipergunakan untuk memisahkan campuran ini adalah teknik sentrifugasi, yaitu metode yang digunakan dalam untuk mempercepat proses pengendapan dengan memberikan gaya sentrifugasi pada partikel-partikelnya.
Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana o bjek diputar secara horizontal pada jarak tertentu. Apabila objek berotasi di dalam tabu ng atau silinder yang berisi campuran cairan da n partikel, maka campuran tersebut dapat bergerak menuju pusat rotasi, namun hal t ersebut tidak terjadi karena adanya gaya yang berlawanan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung, gaya tersebut adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah yang menyebabkan partikel-partikel menuju dinding tanbung dan terakumulasi membentuk endapan (Gambar 15.6).
Gambar 15.6. Pengendapan dengan teknik sentrifugasi Mari kita perhatikan proses pembuatan minyak k elapa, dimana teknik pemisahan sentrifugasi cukup berperan. Buah kelapa dihancurkan, dan diperas sehingga didapat bagian santan. Didalam santan terdapat campuran minyak dengan air. Dengan melakukan sentrifugasi dengan kecepatan antara 3000-3500 rpm, maka terjadi pemisahan dan terdapat dua bagian yaitu fraksi kaya minyak (krim) dan fraksi miskin minyak (skim). Selanjutnya krim diasamkan, kemudian d iberi perlakuan sentrifugasi sekali lagi untuk memisahkan minyak dari bagian buka n minyak. Dalam pengolahan minyak kelapa, sering juga dilakukan modifikasi khususnya dalam pemisahan krim untuk mendapatkan bagian minyak. Modifikasi tersebut dilakukan dengan cara pemanasan krim, dan akan dihasilkan padatan dan minyak, selanjutnya dengan penyaringan kita dapatkan minyak kelapa yang bersih dan jernih.
Jurnal farmasi Elektroforesis
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Sebagian besar senyawa kimia ditemukan di alam dalam keadaan yang tidak murni. Biasanya,
suatu senyawa kimia berada dalam keadaan tercampur dengan senyawa lain. Untuk beberapa keperluan seperti sintesis senyawa kimia yang memerlukan bahan baku senyawa kimia dalam keadaan murni atau proses produksi suatu senyawa kimia dengan kemurnian tinggi, proses pemisahan perlu dilakukan. Proses pemisahan sangat penting dalam bidang t eknik kimia Secara mendasar, proses pemisahan dapat diterangkan sebagai proses perpindahan massa. Proses pemisahan sendiri dapat diklasifikasikan menjadi proses pemisahan secara mekanis atau kimiawi. Pemilihan jenis proses pemisahan yang digunakan bergantung pada kondisi yang dihadapi. Pemisahan secara mekanis dilakukan kapanpun memungkinkan karena biaya operasinya lebih murah dari pemisahan secara kimiawi. Untuk campuran yang tidak dapat dipisahkan melalui proses pemisahan mekanis (seperti pemisahan minyak bumi), pro ses pemisahan kimiawi harus dilakukan. Proses pemisahan suatu campuran dapat dilakukan dengan berbagai metode. Metode pemisahan yang dipilih bergantung pada fasa komponen penyusun campuran. Suatu campuran dapat berupa campuran homogen (satu fasa) atau campuran heterogen (lebih dari satu fasa). Suat u campuran heterogen dapat mengandung dua atau lebih fasa: padat-padat, padat-cair, padat-gas, cair-cair, cair-gas, gas-gas, campuran padat-cair-gas, dan sebagainya. Pada berbagai kasus, dua atau lebih proses pemisahan harus dikombinasikan untuk mendapatkan hasil pemisahan yang diinginkan. Proses pemisahan suatu campuran homogen, prinsipnya merupakan pemisahan dari terbentuknya suatu fasa baru sehingga campuran menjadi suatu campuran heterogen yang mudah dipisahkan. Fasa baru terjadi / terbentuk dari adanya perbedaan sifat fisik dan kimiawi masing-masing komponen. Berbagai metode yang digunakan untuk terjadinya suatu fase baru sehingga campuran homogen dapat dipisahkan, salah satunya adalah dengan elektroforesis. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negat if dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Jenis elektroforesis antara lain, elektroforesis kertas, elektroforesis gel, dan elektroforesis kapiler. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang t erlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase d iam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan denga n medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940 untuk aplikasi dalam berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis farmasi.
Elektroforesis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabka n semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun boro s listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal. Elektroforesis kapiler (CE), juga dikenal sebagai zona e lektroforesis kapiler, dapat digunakan untuk memisahkan spesies ion oleh muatan mereka dan gesekan kekuatan dan radius hidrodinamika. Elektroforesis , bermuatan listrik bergerak analit dalam konduktif cairan menengah bawah pengaruh suatu medan listrik . Diperkenalkan pada tahun 1960-an, teknik elektroforesis kapiler (CE) dirancang untuk spesies terpisah berdasarkan ukuran mereka u ntuk mengisi rasio dalam interior sebuah kapiler kecil penuh de ngan elektrolit . 1.2. Rumusan Masalah Dari latar belakang di atas, yang menjadi rumusan masalah dalam makalah ini adalah : - Apa yang dimaksud elektroforesis kapiler? - Bagaimana proses elektroforesis kapiler? - Apa saja aplikasi elektroforesis kapiler dalam kehidupan? 1.3. Tujuan Adapun tujuan dari pembuatan makalah ini antara lain : - Untuk mengetahui pengertian elektro foresis kapiler. - Untuk mengetahui proses dari elektroforesis kapiler - Untuk mengetahui aplikasi elektroforesis kapiler. 1.4. Manfaat Dari pembuatan makalah ini diharapkan : - Dapat mengetahui dan mengerti tentang elektroforesis kapiler. - Dapat mengetahui proses dari elektroforesis kapiler. - Dapat mengetahui aplikasi elektroforesis kapiler.
BAB II PEMBAHASAN 2.1. Pengertian Elektroforesis Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994: 397).
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Se lain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug & Cummings 1994: A-7). Elektroforesis dapat dibagi menjadi tiga yaitu elektroforesis kertas, elektroforesis gel, dan elektroforesis kapiler. Dalam makalah ini dibahas elektro foresis kapiler. Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940. untuk aplikasi dalam berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis farmasi. Elektroforesis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabka n semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun boro s listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal. Karakteristik elektroforesis kapiler yaitu : ¾ Menggunakan pipa kapiler pada pe misahan elektroforesis. ¾ Memanfaatkan medan listrik berkekuatan tinggi, lebih dar i 5 V/cm. ¾ Menggunakan detektor berteknologi modern, sebagaimana yang ada pada kromatogram. ¾ Efisiensinya kadangkala sama dengan kromatografi gas kapiler, namun juga bisa lebih besar. ¾ Membutuhkan waktu beberapa menit untuk mengamati sampel. ¾ Mudah diotomatiskan untuk menganalisis dalam segi kuant itatif, dan mudah digunakan. ¾ Terbatas dalam mengkomsumsi (melibatkan) sejumlah reagent. ¾ Metode ini lebih aplikatif untuk menyeleksi dalam ukuran luas, dibandingkan dengan teknik separasi lainnya. Salah satu keuntungan utama dari CE adalah dibutuhkan peralatan yang sederhana. CE terdiri dari satu daya tegangan tinggi, penyangga reservoir, sebuah kapiler, dan sebuah detektor. Pengaturandasar dapat diuraikan dengn peningkatan fitur seperti sampel, peralatan injeksi ganda, mengontrol suhu kapiler, pengaturan penyediaan daya, detektr ganda, dan kumpulan fraksi. Berbagai model elektroforesis kapiler dapat dilakukan menggunakan instrumen CE. Dasar dari perbedaan model pemisahan dapat dikarenakan bahwa elektroforesis kapiler telah dikembangkan dari suatu kombinasi elektroforesis dan teknik kromatografi. Istilah umumnya ini dapat dianggap sebagai pemisahan elektroforesis dari sejumlah senyawa di dalam tabung sempit. Walaupun sebagian besar aplikasi telah dilakukan menggunakan cairan sebagai media pemisah, teknik elektroforesis kapiler dimana kapiler berisi elektroforesis gel, lapisan kromatografi.
2.2. Proses Elektroforesis Kapiler Alat-alat yang digunakan pada elektroforesis kapiler adalah i Kolom kapiler (dengan silika, jendela optis agar bisa d iamati prosesnya dari luar) i Dua buah elektroda. i Power supply (bisa diatur untuk bertegangan t inggi) i Detector (sinar UV)
i Larutan buffer beserta dua buah tempat penyimpanannya.
Gambar 2.1 Alat elektroforesis kapiler. Pergeseran waktu (migration time) tm merupakan waktu yang dibutuhkan larutan untuk bergerak dari kolom kapiler menuju jendela detektor. Hal-hal yang mempengaruhi mekanisme proses ialah mobilitas elektroforesis (electrophoretic mobility) µep(cm2/Vs), kecepat an elektroforesis (electrophoretic velocity) vep(cm/s), dan besarnya medan listrik (electric field strength) E (V/cm). Hubungannya dapat dilihat pada persamaan dibawah:
Kecepatan merupakan hasil kalkulasi dari membagi perpindahan waktu dengan jarak pipa kapiler dari detektor. Mobilitas tergantung pada hasil pembagian antara kecepatan dengan besar medan listrik. Ketinggian cairan sampel pada pipa kap iler tergantung pada jenis buffer yang dipakai, kondisi pH dan temperatur. Panjang pipa kapiler yaitu panjang menuju detektor (Ld), dan panjang total (Lt), panjang ket ika proses separasi terjadi pada segmen kapiler, Ld , dan panjang keselurahan adalah Lt, selisih atau kelebihan Lt terhadap Ld harus diketahui untuk menghubungkan pipa kapiler pada buffer reservoir. Pada sistem P/ACE excees panjangnya bernilai 7 cm, dengan ukuran panjang ini apabila susunan pipa tersebut dibalikkan maka akan terjadi suatu separasi yang cepat. Elektroosmosis Merupakan proses dasar yang mengendalikan CE, peristiwa ini merupakan hasil dari terdapat nya muatan pada dinding pipa kapiler. Aliran elektroosmosis didefenisikan dalam persamaan dibawah:
Dimana adalah konstanta d ielektrik, adalah viskositas larutan buffer , dan adalah pot ensial zeta diukur pada saat bidang pembatas menutup pada hubungan permukaan antara liquid dan padatan. Muatan negatif dinding menarik muatan positif ion dari larutan buffer, menghasilkan dua lapisan elektrik. Ketika tegangan yang dilibatkan melewati pipa kapiler, kation yang ada didalam jumlah yang panjang (banyak)pada lapisan ganda (double layer), berpindah secara langsung kadalam katoda dengan mengikutsertakan air. Hasilnya adalah jaringan aliran larutan buffer pada elektroda negatif. Meningkatnya konsentrasi akan mengakibatkan aliran elektroosmosisnya menjadi menurun.
Gambar 2.2. Pengaruh pH terhadap EOF Dari gambar di atas, ion zwiter seperti peptida telah dipisahkan kedalam dua ko ndisi pH, pada pH tinggi EOF besar dan pept ida bermuatan negatif sehingga perpindahan e lektroforesis menuju kearah elektroda positif (anoda).
Gambar 2.3. Gambar aliran pipa kap iler Dari gambar di atas pada saat aliran pada pipa kapiler diberikan suatu pendorong yaitu tekanan maka akan terlihat perbedaan kecepatan aliran yaitu pada lintasan tengah pipa lebih cepat dibanding dengan pada dinding, hal ini terjadi karena ada gaya friksional(gesek) liquid terhadap dinding kapiler (sistem hidrodinamik). Gambar bagian atas menunjukkan sistem yang dikendalikan secara elektris, gaya do rong pada EOF terdistribusi secara uniform(merata) sepanjang pipa tersebut, sehingga tidak ada pengaruh tekanan, distribusi kecepatan merata kecuali pada bagian yang dekat sekali pada dinding pipa kapiler. Nilai kecepatan aliran dapat ditentukan berdasarkan persamaan dasar:
Waktu yang dibutuhkan untuk berpindah (migration time) ialah:
Sepanjang berpindah , terjadi difusi molekular kemudian memuncak pada dispersi, persamaan dispersi sebagai berikut: (5)
Dimana Dm adalah koefesien difusi larutan cm2/s. Angka teoritis pelat alas diberikan dalam persamaan sebagai berikut: (6)
Mensubtitusikan persamaan 5 kedalam persamaan 6
Diameter Kapiler dan Panas Joule Penggunaan tegangan listrik yang tinggi mengakibatkan terdapatnya panas yang terhimpun dalam sistem. Ada dua masalah yang cukup besar yang timbul sebagai akibat dari panas yang dihasilkan, yaitu gradien temperatur yang melintasi kolom kapiler dan pert ukaran temperatur dalam beberapa waktu menjadi tidak efektif terhadap panas yang hilang. Kecepatan panas yang dihasilkan pada kolom kapiler dapat ditinjau melalui pendekatan persamaan sebagai berikut :
Dimana L adalah panjang pipa kapiler, A adalah luas area yang dialiri. Apabila i=VR dan R=L/kA sedangkan k ada lah koduktivitas maka:
Gradien temperatur yang melintas pada ko lom kapiler merupakan akibat dari dissipasi panas, temperatur pada aliran tengah kolom kapiler lebih tinggi dibandingkan dengan temperatur pada dinding kapiler.
Gambar 2.4 Viskositas akan menjadi lebih rendah pada saat temperatur tinggi, dalam kondisi ini pula EOF dan mobilitas elektroforesis (EPM) juga akan meningkat. Gradien temperatur sebanding dengan kuadrat diameter dari pipa kapiler, dapat dilihat melalui persamaan dibawah:
Diman W adalah usaha, r merupakan jari-jari kapiler, dan K adalah ko nduktivitas termal. Efek Tegangan dan Temperatur Aliran elektroosmosis dan kecepatan elektroforesis sebanding dengan kuat nya medan listrik, sehingga pemberian tegangan begitu tinggi akan mempercepat proses separasi, umumnya proses separasi terjadi pada kondisi temperatur 25oC (mendekati suhu kamar). Dengan mendinginnya liquid pada kolom kapiler, maka akan mudah untuk melakukan pengontrolan temperatur, pada saat buffer yang digunakan tersebut berkonsentrasi tinggi dan dengan lebar pipa kapiler yang agak besar. Ketika terdapat masalah dalam melakukan pengontrolan temperatur maka solusi yang biasa ditempuh adalah dengan menggunakan pipa kapiler yang lebih kecil, karena hal itu bisa menekan pemakaian arus dan mengurangi panas. Metode-metode Elektroforesis kolom kapiler 1. Capillary Zone Electrophoresis atau Zona elektroforesis kapiler 2. Isoelectric Focusing atau Pemusatan isoelektrik kapiler 3. Capillary Gel Electrophoresis atau Elektroforesis Kapiler Gel 4. Isotachophoresis atau Isotakoforesis Kapiler 5. Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography atau M isel Kapiler Kromatografi Elektrokinetik 6. Elektrokromatografi Kapiler Pada elektroforesis, campuran senyawa berbeda pada larutan biasanya dikenal sebagai zona relatif sempit, ke dalam sistem pemisah, dan induksi untuk bergerak di bawah pengaruh suat u potensial yang diterapkan. Sesuai dengan perbedaan pada keefektifan mobilitas dari perbedaan senyawa di bawah pengaruh medan listrik, kemudian campuran berpisah menjadi zona spasial diskrit senyawa tunggal setelah beberapa waktu. Pemisahan elektroforesis bisa dilakukan dengan sistem kont inu atau tidak kontinu. Pada kasus dimana digunakan elektrolit kontinu, larutan yang dinamakan elektrolit dasar membentuk sebuah rangkaian sepanjang jalur perpindahan. Rangkaian ini tidak berubah oleh waktu dan menyediakan sebuah media sambungan untuk aliran arus listrik serta pembentukan medan listrik sepanjang jalur perpindahan.Umumnyaelektrolit dasar adalah sebuah penyangga yang dengan selektif mempengaruhi keefektifan mobilitas. Dengan merubah karakt eristik dari sistem elektrolit dasar sepanjang jalur perpindahan, pemisahan bisa dioperasikan baik sebagai kinetik ataupun proses yang tidak bergerak. Pada proses kinetik, komposisi dari elektrolit dasar adalah konstan sepanjang jalur perpindahan. Potensial listrik dan keefekifan mobilitas dari senyawa yang dipisahkan juga konstan. Maka dari itu, senyawa yang berbeda berpindah dengan konstan tetapi kelajuan berbeda dengan arus
konstan lewat sistem. CZE, CGE, MEKC, dan CEC merupakan contoh dar i pemisahan. Pada proses statis, komposisi dari elektrolit dasar tidak konstan. Medan listik dan keefektifan mobilitas dapat berubah sepanjang jalur perpindahan. Tipe pemisahan ini paling sering digunakan untuk proses pembentukan gradien pH sepanjang jalur perpindahan. Setelah selang waktu, komponen tertentu dari sampel seperti ampholytes, akan berhenti untuk berpindah dan berpusat pada posisi tertentu sesuai pada titik isoelektriknya. 1. Capillary Zone Electrophoresis (CZE) Merupakan metode yang paling sederhana dari CE, mekanisme separasinya berdasarkan pada perbedaan rasio muatan-massa. Dasar-dasar CZE adalah keseraga man larutan buffer dan besarnya medan listrik yang tetap pada sepanjang kolom (pipa) kapiler. Komponen-komponen sampel terpisah menjadi zona-zona khusus yang bisa diamati pada gambar dibawah, untuk menentukan mobilitas elektroforesisnya maka digunakan persamaan dari teori Debeye-HuckelHenry.
Dengan q adalah muatan netto, R jari-jari Stokes, dan ada lah viskositas.
Separasi molekul-molekul kecil dan besar dapat dilakukan dengan baik dengan metode CZE. Meskipun pada molekul yang lumayan kecil dimana rasio antara muatan dan massanya tidak begitu bagus. 2. Isoelectric focusing (IEF) Isoelectrik fokus kapiler (CIEF) belum memberikan dimensi lain untuk elektroforesis kapiler dengan memperkenalkan mekanisme pemisahan berdasarkan perbedaan titik isoelectrik (pI) dari biomolekul. Pemisahan protein dalam CIEF bergantung pada pembentukan gradien pH sepanjang sumbu longitudinal kapiler dan migrasi analit ke daerah pH, sama dengan pI mereka, di mana perpindahan titik molekul netral berhenti. Beberapa langkah, baik secara independen maupun simultan, terlibat dalam melaksanakan ana lisis yaitu dengan CIEF. Sampel adalah yang pertama dilarutkan dalam ampholytes mixturebof carrier, yang akan membentuk dasar dari gradien pH di kapiler tersebut. Pilihan kisaran pH didapatkan tergantung pada nilai-nilai pI dari analit, namun kisaran yang cukup sempit akan mencakup hasil PIs dalam kekuatan menyelesaikan lebih besar. Langkah fokus diperlukan untuk membentuk gradien pH dan sekaligus fokus analit ke dalam zona d iskrit sepanjang gradien pH. Setelah migrasi dari analit berhenti, arus akan berkurang. Dalam rangka untuk mendeteksi protein, zona individu harus dimobilisasi, atau dielusi, melewati detection window. Langkah ini dapat dilakukan elektroforesis dengan penambahan garam, hidrodinamis atau electroosmotically. Chen dan Wiktorowicz digunakan mobilisasi hidrodinamik di hadapan medan listrik untuk mendeteksi protein dan bentuk mutan terkait. Prosedur ini memungkinkan mobilisasi deteksi analit sementara. Perpindahan(pergerakan) cairan pada pipa kapiler akan terus berlangsung sepanjang larutan memiliki muatan atau diberi muatan, apabila kondisi sudah menjadi netral maka cairan akan
berhenti bergerak.
3. Capillary Gel Electrophoresis Mekanisme utama pemisahan elektroforesis kapiler gel didasarkan pada perbedaa n ukuran zat yang terlarut sebagai analit berpindah dari pori kolom gel yang terisi penuh. Gel berpotensi digunakan untuk pemisahan elektroforesis karena pemisahannya berdasarkan pada ³molecular sieving´ dan bertindak sebagai media anti konvektif, meminimalisir difusi zat yang terlarutkan yang mengkontribusi pelebaran zona, mencegah penyerapan zat yang terlarut ke dinding kapiler serta membantu eleminasi elektroosmosis. Gel harus memiliki karakter tertentu seperti stabilitas temperatur dan kesesuaian jarak ukuran po ri untuk menjadi media elektroforesis yang sesuai. Hijerten dan Zhu menggunakan poliaklrilamide dan agarose gelas kapiler dengan 150µm I.D. untuk pemisahan elektroforesis molekul kecil dan besar. CGE dengan koleksi fraksi telah tampil untuk mikropreparasi purifikasi dari makromolekul. Karger dan rekan kerjanya mendapatkan efisiensi pemisahan tingkat tinggi (hingga 30 juta plat teoritis per meter) menggunakan kolom kapiler berisi gel. Kapiler-kapiler tersebut dipenuhi gelgel poliakrelamide yang mengandung natrium dodesil sulfat. Teknik ini juga disebut pemisahan SDS-PAGE kapiler dan telah digunakan untuk pemisahan protein-protein, polinukleutida, dan fragmen-fragmen DNA. Kesuksesan yang didapatkan ditandai dengan sebagian teknik digunakan untuk pengembangan prosedur untuk pautan silang akrilamide dan disakrilamide monomer di dalam kapiler sumbu silika. Poliakrilamide hasilnya memiliki struktur gel yang acak yang dapat terikat ke dinding kapiler melalui adisi dari reagen dwifungsi. Ukuran pori ditentukan dari konsentrasi total gel, %T (T=[bis+akril]/V, dimana bis, akril, dan V ada lah berat bisakrilamit, berat akrilamit dan total volume) dan ko nsentrasi dari agen pautan silang, %C (C=[bis+akril]/akril). Ketika gel tersebut terikat pada perukaan kapiler elektroosmosis dapat dieleminasi sejak bentuk protein mengkompleks dengan SDS yang bermuatan negatif, injeksi dan deteksi dilakukan pada ujung katoda dan anoda dari kapiler. SDS-PAGE Kapiler memiliki beberapa keuntungan d ibandingkan gel elektroforesis konvensional, termasuk kebutuhan sampel yang kecil, kemungkinan automatisasi dan sensifitas yang tinggi. Dengan mengeksploitasi kemampuan melewati yang tinggi dan pemisahan dua dimensi dari susunan gel dan cepat dan penetapan masa molekul yang efisien dan kuantitas dari susunan kapiler, keuntungan tinggi telah dihasilkan dari pemisahan dan analisa variasi biomolekul besar yang luas. Metode seperti ini dilakukan dengan melibatkan gel, gel diisikan kedalam pipa kap iler contohnya polyacrylamida, dan agarosa. Metode ini penting diterapkan pada saat melakuka n separasi DNA.
4. Isotachophoresis
Pada metode ini aliran elektroosmosis sama dengan 0, sistem pada buffer adalah hetero gen, pipa kapiler diisi dengan larutan elektrolit yang memiliki mobilitas tinggi dibandingkan sampelsampelnya yang akan diteliti sebagai leading , kemudian sampel diinjeksi, kemudian larutan elektrolit kembali dimasukkan kembali sebagai terminating. 5. Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography Konsep dari MEKC ini adalah surfaktan ionik dimasukkan ke dalam larutan buffer yang mengalir pada konsentrasi micelle kritis. Bagian da lam micelle bersifat hidrofobik sedangkan bagian luarnya bersifat anionik. Micelle memiliki fase pseudostation yang dapat memompa secara elektroforesis. Pemisahan didasarkan pada analisis perbedaan asosiasi dengan micelle. Interaksi antara analisis dan micelle mengarah pada salah satu atau kombinasi dari interaksi elektrostatik, ikatan hidrogen, dan atau interaksi hidrofobik. Aplikasi dari MEKC terbatas pada beberapa kasus untuk molekul-molekul kecil dan peptida-peptida yang mengarah ke ukuran fisik dari makromolekul dan ketidakmampuan mereka untuk memenuhi partisi ke bagian dalam dari micelle. Bagaimanapun juga, MEKC telah berhasil pada pemisahan dari famili antibiotika dekapeptida dengan menggunakan surfaktan Zwitter ion. Selektifitas MEKC mungkin dimanipulasi oleh variabe-variabel seperti tipe surfaktan, pH (pada larutan ionik), temperatur, dan bahan tamabahan lain (organik, pasangan ion, dll). Donato dkk mempelajari efek pH, konsentrasi surfaktan dan pengaruh pengubah organik pada pemisahan beberapa obat antiinflamasi non-steroidal. Grup yang sama juga menbgaplikasikan CE dan MEKC untuk analisis langsung dari obat-obat antiinflamasi non-steroidal pada beberapa formulasi farmasetika tanpa sampel pretreatment. Sebuah surfaktan katin (CTAB) efektif pada pemisahan kebalikan aliran elektroosmotik untuk kedua antibiotik netral dan anionik. Micellar merupakan agregat molekul yang ampifilik yang dikenal sebagai surfaktan, micelle berkemampuan untuk menganalisis analit pada level molekular berdasarkan interaksi hidrofobik dan elektrostatik.
6. Elektrokromatografi Kapiler (CEC) Dalam CEC kolom pemisahan dikemas dengan wadah kromatografi yang dapat menjerat atau menahan larutan dengan keseimbangan distribusi normal yang bergantung padanya dan di sini terdapat beberapa pengecualian elektroforesis. Pada CEC cairan mengalami kontak dengan dinding silika, begitu juga dengan permukaan-permukaan partikel. Konsekuensinya elektroforesis terjadi pada cara yang sama pada saluran terbuka karena kehadiran muatan netral pada beragam permukaan. Di mana aliran dari saluran terbuka adalah aliran masuk dan tidak terdapat variasi kecepatan aliran melewati bagian k olom, aliran pada tempat beristirahat terkemas lebih tidak sempurna karena kealamian darisaluran. Walaupun, mendekati aliran masuk dan tersusun lebih seragam daripada sistem doro ng tekanan. Di sini kolom yang sama dapat memberikan efisiensi yang lebih tinggi saat digunakan elektrografi daripada saat pemisahan dengan dorongan tekanan. 2.3. Aplikasi Elektroforesis Kapiler 1. Capillary Zone Electrophoresis (CZE)
CZE sangat berguna untuk men-separasi protein dan peptide, hasil yang didapat akan dianalisa perbedaannya berdasarkan satu subtituent dari asam amino. Hal ini berguna dalam memetakan tempat modifikasi mutasi dan post-translasi yang terdeteksi.
2. Isoelectric focusing (IEF) IEF berguna untuk menentukan pI dari protein, terutama dalam memisahkan immunoglobulin , variasi hemoglobin dan menentukan po sisi translational modifikasi dari protein rekombinan, separasi campuran protein dapat dilihat pada gambar dibawah:
3. Capillary Gel Electrophoresis Pemisahan oligonucleotida dan sekuen produk DNA melibatkan agar polyacrylamide, gambar dibawah menunjukkan hasil separasi.
Secara umum aplikasi elektroforesis dapat debadakan d alam berbagai bidang, antara lain: 1) Forensics DNA fingerprinting. 2) Genetics i Mendeteksi kelainan genetik.
i Membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom. i Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen. i Mengetahui variasi genetik yang ada d i alam. i Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu 3) Biochemistry i Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan prot ein tertentu. 4) Mycrobiology i Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid. 5) Molecular Biology i Mempelajari evolusi tingkat molecular. i Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR i Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu. i Mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk P CR i Memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-sequencing, i Pemurnian atau purifikasi DNA. 6) Farmasetika dan Klinik Analisa formulasi farmasetika dan cairan biologis dengan CE sangat dibutuhkan, terutama potensial komplementaritas dari metode ini terhadap HPLC. Penerapan aplikasi dari CE pada farmasetika analisis dan klinik meningkat dibandingkan tiga t ahun lalu. Metodelogi, menggunakan daerah bebas CE atau MEKC, telah dikembangkan untuk analisa dari beberapa senyawa seperti salisilat (aspirin), acetaminophen (paracetamol), cimetidine, obat hipoglikemia, obat anti epilepsy, morfin, kokain pada urin. Analisa CE sangat sesuai saat diperlukan untuk menentukan persentase dari obat atau metabolit pada cairan biologis tanpa ketepat an kuantifikasi. Akuisisi dari keakuratan kuantitatif data membutuhkan sejumlah tindakan pencegahan. Misalnya, efek dari matriks biologis pada waktu perpindahan dari analit dapat diperjelas dengan CE, jadi model internal prosedur standar yang cocok sangat penting saat formulasi atau cairan biologis secara langsung dianalisa dengan metode ini. Sebagai alternatif, pada kasus untuk metode analisa lain, membersihkan sampel sebelum analisa CE yang mungkin diinginkan. Pilihan tepat dari prosedur yang dapat digunakan untuk memperoleh informasi analisa kuantitatif dari CE.
BAB III PENUTUP 3.1. Kesimpulan Dari makalah ini dapat disimpulkan : Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Proses elektroforesis dapat dibedakan dengan berbagai metode, antara lain : - Capillary Zone Electrophoresis atau Zona elektroforesis kapiler - Isoelectric Focusing atau Pemusatan isoelektrik kapiler - Capillary Gel Electrophoresis atau Elektroforesis Kapiler Gel - Isotachophoresis atau Isotakoforesis Kapiler - Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography atau Misel Kapiler Kromatografi Elektrokinetik - Elektrokromatografi Kapiler Aplikasi elektroforesis dapat diterapkan dalam berbagai bidang, seperti Forensics Genetics, Biochemistry, Mycrobiology, Molecular Biology, Farmasetika dan Klinik. 3.2. Saran Teknologi elektroforesis kapiler ini sebaiknya dikembangkan t erutama dari segi peralatannya agar dapat terjangkau untuk peneliti dari berbagai disiplin ilmu, mengingat aplikasi elektroforesis kapiler ini cukup luas di bidang forensic, biokimia, mikrobiologi, biologi molekuler, farmasetika, dan klinik.
DAFTAR PUSTAKA
Camilleri, Patrick. 1997. Capillary Elactrophoresis Theory and Pract ice. New York : CRC Press.
Klug, W. S. and M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood cliffs: xvi + 779 hlm. Li, S.F.Y. 1996. Capillary Electrophoresis Principles, Practice, and Applications. Netherlands : Elsevier.
