Interpretação de Exames Laboratoriais (4).pdf

Curso ur so de de Inte nt erpreta rp retação ção de Exames Exames Laboratoriais

MÓDUL MÓDULO O IV At enção: enç ão: O O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para este Programa de Educação Continuada, é proibida qualquer forma de comercialização do mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores descritos na Referência Consultada.

MÓDULO IV

Imunologia 1. Princípios

A Imunologia é o ramo da biologia que biologia que estuda o sistema imunológico, sistema imunológico, suas características características físicas, químicas e fisiológicas, funções de seus componentes in vitro e in vivo, etc. Estuda o funcionamento fisiopatológico do sistema imune de um indivíduo no estado sadio e em casos de doenças, sejam elas imunológicas ou não (doenças autoimunes, hipersensitividade, deficiência imune rejeição pós-enxerto). O conceito de Imunologia foi criado por Elie Metchnikoff em 1882 1882.. As células células responsáveis pela imunidade são os linfócitos e os fagócitos (monócito e macrófagos). Os linfócitos podem apresentar-se como linfócitos T ou linfócitos B (estes são responsáveis pela produção de anticorpos, anticorpos, denominados Plasmócitos), os Linfócitos T Citotóxicos, destroem células infectadas por vírus e vírus e os Linfócitos T Auxiliares coordenam as respostas imunes. Além das defesas internas existem também defesas externas (Ex: pele como barreira física, ácidos graxos e microorganismos comensais). As defesas externas são a primeira barreira contra muitos organismos agressores. No entanto, muitos conseguem penetrar, ativando assim as defesas internas do organismo. O sistema imune pode sofrer um desequilíbrio que se apresenta como imunodeficiência, hipersensibilidade ou doença auto-imune. auto-imune. As respostas imunes imunes podem ser adaptativas ou inatas: as respostas adaptativas reagem melhor cada vez que encontram um determinado patógeno e a resposta inata, ao contrário da adaptativa, sempre dá a mesma resposta mesmo quando é exposta várias vezes ao patógeno patógeno.. Os fagócitos coordenam as respostas inatas e os linfócitos coordenam as respostas imunes adaptativas. Os principais 137 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

componentes do sistema imune são os Linfócitos T, Linfócitos B, Fagócitos Mononucleares, Neutrófilos, Eosinófilos, Basófilos, Plaquetas e células teciduais. Além dos leucócitos, também fazem parte do sistema imune às células do sistema mononuclear fagocitário (SMF), também conhecido por sistema retículoendotelial e mastócitos. As primeiras são células especializadas em fagocitose e apresentação do antígeno ao sistema imune. São elas: macrófagos alveolares (nos pulmões), micróglia (no tecido nervoso), células células de Kuppfer (no fígado) fígado) e macrófagos em geral. Os

mastócitos

são células do tecido conjuntivo, originadas a partir de células mesenquimatosas

(células

de

grande potência de diferenciação que dão origem às células do tecido

conjuntivo).

Possuem

citoplasma rico em grânulos basófilos (coram-se por corantes básicos). Sua principal principal função função é armazenar potentes mediadores químicos da inflamação, como a

Mastócitos Fonte: www.afh.bio.br www.afh.bio.br

histamina, heparina, ECF-A (fator quimiotáxico – de atração- dos eosinófilos)

e

fatores

quimiotáxicos (de atração) dos neutrófilos. Elas participam de reações

alérgicas

(de

hipersensibilidade), atraindo os leucócitos

até

o

proporcionando vasodilatação.

local

e uma

O

nosso

organismo possui mecanismos 138 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

de

defesa

que

diferenciados

podem

quanto

a

ser sua

especificidade, ou seja, existem os específicos contra o antígeno ("corpo

estranho")

e

os

inespecíficos que protegem o corpo de qualquer material ou microorganismo estranho, sem

Plasmócitos Fonte: www.efoa.br

que este seja específico.

O organismo possui barreiras naturais que são obviamente inespecíficas, como a da pele (queratina, lipídios e ácidos graxos), a saliva, o ácido clorídrico do estômago, o pH da vagina, a cera do ouvido externo, muco presente nas mucosas e no trato respiratório, cílios do epitélio respiratório, peristaltismo, flora normal, entre outros. Se

as

barreiras físicas, químicas e biológicas do corpo forem vencidas,

o

combate

ao

agente infeccioso entra em outra

fase.

Nos

tecidos,

existem células que liberam substâncias

vasoativas,

capazes de provocar dilatação das arteríolas da região, com aumento da permeabilidade e saída de líquido. Isso causa vermelhidão,

inchaço,

aumento da temperatura e dor, conjunto de alterações

139 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

conhecidas como inflamação. Essas

substâncias

atraem

mais células de defesa, como neutrófilos e macrófagos, para a área afetada. A vasodilatação aumenta a temperatura no local inflamado, a elevação na temperatura favorece as reações químicas e celulares, estimulando a migração de células de defesa. Algumas das substâncias liberadas no local da inflamação alcançam o centro termorregulador localizado no hipotálamo, originando a febre. Apesar

do

mal-estar

e

desconforto, a febre é um importante fator no combate às infecções, pois além de ser desfavorável

para

a

sobrevivência

dos

microorganismos invasores, também estimula muitos dos mecanismos de defesa de nosso corpo. Por diapedese, neutrófilos e monócitos são atraídos até o local da inflamação, passando a englobar e destruir (fagocitose) os agentes

invasores.

A

diapedese

e

a

Esquema simplificado do fagocitose fazem dos neutrófilos a linha de processo febril Fonte: www.afh.bio.br frente no combate às infecções. Outras substâncias liberadas no local da infecção chegam pelos vasos sangüíneos até a medula óssea, estimulando a liberação de mais neutrófilos, que ficam aumentados durante a fase aguda da infecção. No plasma também existem proteínas de ação bactericida que ajudam os neutrófilos no combate à infecção. A inflamação determina o acúmulo de fibrina, que forma um envoltório ao redor do local, evitando a progressão da infecção. Caso a resposta inflamatória não seja eficaz na contenção da infecção, o sistema imune passa a depender de mecanismos mais específicos e sofisticados,


dos quais tomam parte vários tipos celulares, o que chamamos resposta imune específica. Os linfócitos T e B são responsáveis

pelo

reconhecimento

específico dos antígenos. Cada célula B está geneticamente programada para codificar um receptor de superfície específico

para

um

determinado

antígeno, os linfócitos T constituem várias subpopulações diferentes com uma variedade de funções. Em outras palavras, os Linfócitos B são como soldados

pré-programados

para

combater uma determinada doença, existindo diversos batalhões, cada um direcionado

para

um

Foto em Microscopia Eletrônica de Varredura Aumento: 20.000 vezes Linfócito T Citotóxico (amarelo) atacando célula tumoral (vermelho) Fonte: www.ciencianews.com.br

antígeno

específico. Os linfócitos T são divididos em duas classes, os Linfócitos T Citotóxico e os Linfócitos T Auxiliar: Os Linfócitos

T

Auxiliares

são

como

comandantes que organizam as ações e os Linfócitos T Citotóxicos são como agentes especializados em destruir as células do próprio organismo infectadas pelos agentes estranhos ou mutantes.

2.

PRINCIPAIS

CÉLULAS

Linfócito B Imunoglobulinas Fonte: Escola Medicina - UNIFESP

DO

SISTEMA

IMUNE

produzindo Paulista

de

(RESPOSTA

CELULAR): 141 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

2.1 LINFÓCITOS LINFÓCITOS B:

Os linfócitos B são células que fazem parte de 5 a 15% dos linfócitos circulantes, se originam na medula óssea e se desenvolvem nos órgãos linfóides. O nome linfócito B é devido a sua origem na cloaca das aves, na Bursa de Fabricius. São células de núcleo grande e que possuem o retículo endoplasmático rugoso e o complexo de Golgi extremamente desenvolvidos em seu citoplasma, e especialistas em síntese de anticorpos quando ativadas. Porém em repouso, estas organelas não estão desenvolvidas. Os linfócitos B têm como função própria, a produção de anticorpos contra um determinado agressor. Anticorpos são proteínas denominadas de imunoglobulinas que exercem várias atividades de acordo com o seu isotipo (IgG, IgM, IgA, etc.) Estes anticorpos realizam diversas funções como: opsoninas, ativadores de complemento, neutralizadores de substâncias tóxicas, aglutinação, neutralização de bactérias, etc. Os linfócitos B possuem como

principal

marcador

de

superfície a IgM monomérica, que participa do complexo receptor de antígenos.

Esta

imunoglobulina

entra em contato com o antígeno quando

lhe

é

apresentado

diretamente ou indiretamente pelos macrófagos. A IgM se ligando ao epítopo (superfície específica de um Linfócito B Fonte: Eye Of Science / Science internaliza o complexo IgM-epítopo. Photo Library © Este complexo realiza diversas determinado

agente

estranho),

modificações na célula, que tem a finalidade de induzi-la a produção de imunoglobulinas. 142 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

Os linfócitos B em repouso não produzem imunoglobulinas, mas quando estimulados por substâncias químicas como interleucinas (como a IL-4 e a IL-1) vão sofrer expansão clonal e se transformar numa célula ativa denominada de plasmócito. Os plasmócitos possuem na sua ultra-estrutura, o Retículo Endoplasmático Rugoso e o Complexo de Golgi desenvolvidos, e o núcleo com aspecto de roda de carroça. Secretam ativamente anticorpos específicos na resposta imune específica. 2.2 LINFÓCITOS T:

Os linfócitos T são células que têm diversas funções no organismo, e todas são de extrema importância para o sistema imune. O nome linfócito T é devido ao fato destas células se maturarem no Timo sendo, então, o T de Timosdependentes. Funcionalmente os linfócitos são separados em Linfócito T Auxiliar, Linfócito T Citotóxico, Linfócito T Supressor e Linfócito T de Memória. Cada um deles possui receptores característicos, que são identificáveis por técnicas imunológicas e que têm funções específicas. Entretanto, todas as células T possuem os receptores TCR (do inglês, T-Cell-Receptor) e o CD3 (do inglês Cluster os Differentiation – 3). O linfócito T Auxiliar possui receptor CD4 na superfície, que tem a função de reconhecer macrófagos

ativados.

É

o

principal alvo do vírus HIV. Esta célula é o mensageiro mais importante do sistema imune. Ele envia mensagens de ataque para diversos leucócitos para realizar a guerra imunológica contra o agente agressor. O linfócito T

Linfócito T Citotóxico destruindo uma célula tumoral. 143

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Auxiliar é a célula que interage com

os

macrófagos,

Fonte: ASM Microbelibrary (http://www.microbelibrary.org).

©

reconhecendo o epítopo que lhe é apresentado. A interleucina-1 estimula a expansão clonal de linfócitos

T

Auxiliares

monoclonais. Eles vão secretar diversas interleucinas, sendo, portanto, dividido em Linfócitos T Auxiliar (Helper) 1 e Linfócito T Auxiliar (Helper) 2. Esses subtipos de LT Helper secretam interleucinas distintas, cada uma com uma função específica. Algumas funções principais dos linfócitos T-Helper: * Estimulação do crescimento e proliferação de linfócito T Citotóxicos e Supressores contra o antígeno; * Estimulação do crescimento e diferenciação dos Linfócitos B em plasmócitos para produzir anticorpos contra o antígeno; * Ativação dos macrófagos; * Auto estimulação (um linfócito T Helper pode estimular o crescimento da população de linfócito T Helpers). Linfócitos T Supressores são linfócitos que têm a função de modular a resposta imune através da inibição da mesma. Ainda não se conhece muito a respeito desta célula, mas sabe-se que ele age através da inativação dos linfócitos T Citotóxicos e Helpers, limitando a ação deles no organismo numa reação imune. Sabe-se que o linfócito T Helper ativa o linfócito T Supressor que vai controlar a atividade destes linfócitos Helpers, impedindo que eles exerçam suas atividades excessivamente. Os linfócitos T Supressores também participam da chamada tolerância imunológica, que é o mecanismo por qual o sistema imune usa para impedir que os leucócitos ataquem as próprias células do organismo. Portanto, se houver deficiência na produção ou ativação dos linfócitos T supressores, poderá haver um ataque auto-imune ao organismo. O linfócito T Citotóxico apresenta receptores TCR. Especializado para o reconhecimento de antígenos na superfície de outras células. Produz proteínas que 144 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

matam células estranhas, células infectadas por vírus e algumas células cancerosas. O linfócito T de memória apresenta receptores TCR, e é uma célula preparada para responder mais rapidamente e com maior intensidade, diante de nova exposição ao mesmo antígeno. 2.3 CÉLULAS NATURAIS KILLER (NK):

Os linfócitos NK (Natural Killer) são células matadoras naturais, ou células assassinas e fazem parte de 10-15% dos linfócitos do sangue. Elas lisam (destroem) a células tumorais (estranhas) ou infectadas por vírus sem que estas expressem algum antígeno ativador da resposta imune específica. Este tipo de resposta é chamado de resposta imune inespecífica, pois não há reconhecimento de epítopos e nem formação de células monoclonais específicas ou qualquer memória imunológica (que é sempre específica). Estas células costumam expressar

receptores

CD

de

superfície, não existindo nenhum marcador específico para os NK. O marcador

mais

encontrado

e

usado atualmente para detectá-los é o CD16 ou o CD56. As células Célula Natural Killer atacando uma célula tumoral Fonte: www.paginadigital.com.ar/

NK também lisam células cobertas por

IgG.

denominada

Essa de

função

é

citotoxidade

celular dependente de anticorpo. 2.4 MACRÓFAGOS:

Os macrófagos são células de altíssimo poder fagocitário. O Interferon Gama, substância produzida por linfócitos T Helper estimula a fusão dos lisossomas com o fagossoma para que haja a digestão intracelular. Estes fagócitos possuem 145 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

diversas enzimas hidrolíticas em seus lisossomas. Não possuem a mieloperoxidase, mas matam bactérias por liberação de radicais derivados do oxigênio, como o superóxido, radical hidroxila e o peróxido de hidrogênio (H 2O2). Estes vão oxidar a membrana da célula da bactéria e formar pontes dissulfeto entre os aminoácidos cisteína de diversas proteínas estruturais da bactéria, o que leva a morte da mesma. Possui funções de extrema importância para o sistema imune: * Apresentador de antígenos: Os macrófagos são células que vão fagocitar a antígeno e digeri-lo no fagolisossoma. Porém, os seus epítopos são levados até a superfície da célula e apresentado ao linfócito T ou ao linfócito B, que resumidamente irá estimular todo o sistema imune do organismo e "convocar" as células para o ataque. * Limpador: Os macrófagos são células que chegam para fazer a limpeza de um tecido que necrosou, ou que inflamou. Eles fagocitam restos celulares, células mortas, proteínas estranhas, calo ósseo que se formou numa fratura, tecido de cicatrização exuberante etc. Após esta limpeza, os fibroblastos ativos (no caso de uma necrose) vão ao local e preenchem o espaço com colágeno. * Produtor de interleucinas: O macrófago é o principal produtor da Interleucina I (IL-1). Ele produz a IL-1 quando fagocita organismos invasores (micróbios), que dá o alarme para o sistema imune. Esta citocina estimula linfócitos T Helper até o local da infecção, onde serão apresentados aos epítopos nos macrófagos. Além disso, a IL-1 estimula a expansão clonal dos linfócitos T Helper e dos linfócitos B específicos contra os epítopos (são moléculas específicas dos antígenos que é capaz de criar uma população de células específica para combatêlo). A IL-1 é responsável pela febre nas infecções e inflamações que ocorrem no corpo. Ela vai ao hipotálamo e estimula a produção de prostaglandinas, que ativam o sistema de elevação da temperatura. A IL-1 também aumenta a produção de prostaglandinas pelos leucócitos, que vai contribuir para a inflamação e dor. Além disso, a IL-1 estimula a síntese de proteínas de adesão leucocitária nos endotélios e facilita a adesão dos leucócitos para realizar a diapedese.


Os

macrófagos

são

responsáveis pelo sistema monocítico fagocitário

(SMF),

pois

vem

da

maturação dos monócitos que chegam pelo sangue. Existem células que são morfologicamente

diferentes

dos

macrófagos, mas tem a mesma função, e provém dos monócitos da mesma

Quatro macrófagos Fonte: www.aids-info.ch

forma, sendo, então parte do SMF. São eles: Monócito sangüíneo (circulante no sangue); Micróglia (SNC); Células de

Kuppfer

alveolares

(fígado);

Macrófagos

(pulmão);

Células

dendríticas (região subcortical dos linfonodos); Macrófagos sinusais do baço

(polpa

vermelha

do

baço); Macrófago fagocitando bactérias Fonte: www.aids-info.ch

Macrófagos das serosas (peritônio, pericárdio

e

pleura);

Células

de

Langerhans (pele).

2.5 MASTÓCITOS:

A principal função dos mastócitos é armazenar potentes mediadores químicos da inflamação, como a histamina, heparina, ECF-A (fator quimiotáxico dos eosinófilos), SRS-A, serotonina e fatores quimiotáxicos dos neutrófilos. Esta célula não tem significado no sangue, sendo uma célula própria do tecido conjuntivo. Ela participa de reações alérgicas (de hipersensibilidade), na qual chama os leucócitos até o local e cria uma vasodilatação.


É

a

principal

célula

responsável pelo choque anafilático. O processo de ativação da degranulação (exocitose) se baseia na sensibilização destas

células

(mastócitos).

Esta

sensibilização ocorre da seguinte forma: o primeiro contato com o alérgeno (substância irritante que causa a alergia) estimula a produção de IgE específicas que se unem

Mastócito Fonte: Escola Paulista de aos receptores de superfície dos mastócitos, Medicina - UNIFESP pois estes são rico em receptores de IgE. No segundo contanto, as IgE ligadas ao mastócito

se

ligam

ao

alérgeno

e

desencadeia a liberação de todos os mediadores inflamatórios. Com isso a histamina causa uma vasodilatação, a heparina é anticoagulante, o ECF-A chama os eosinófilos e a fator quimiotáxico dos neutrófilos chama os neutrófilos ao local. O SRS-A (slow reacting substance of anaphilaxis) tem como efeito produzir contração lenta da musculatura lisa. Esta contração da musculatura lisa é importante quando essa reação anafilática ocorre no pulmão e leva a uma broncoconstricção (asma alérgica). 3. PRINCIPAIS MOLÉCULAS DO SISTEMA IMUNE (RESPOSTA HUMORAL):

As moléculas envolvidas no desenvolvimento da resposta imune compreendem os anticorpos e as citosinas, produzidas pelos linfócitos, e uma ampla variedade de outras moléculas conhecidas como proteínas de fase aguda, porque as suas concentrações séricas elevam-se rapidamente durante a infecção. As moléculas que promovem a fagocitose são conhecidas como opsoninas.


O

sistema

complementar

(complemento)

é

um

conjunto

de

aproximadamente 20 proteínas séricas cuja principal função é o controle do processo inflamatório. As proteínas deste sistema promovem a fagocitose, controlam a inflamação e interagem com os anticorpos na defesa imune. As citosinas são moléculas diversas que fornecem sinais para os linfócitos, fagócitos e outras células do organismo. Todas as citosinas são proteínas ou péptidos, algumas contendo glicoproteínas. Os principais grupos de citosinas são: Interferons (IFNs, que limitam a propagação de certas infecções virais), Interleucinas (Ils, a maioria delas está envolvida na indução de divisão e diferenciação de outras células), Fatores estimuladores de colônias (CSFs, divisão e diferenciação das células tronco na medula óssea e dos precursores dos leucócitos sangüíneos), Quimiocinas (direcciona a movimentação das células pelo organismo) e outras citosinas (são particularmente importantes nas reacções inflamatórias e citotóxicas). 3.1 ANTICORPOS:

Sem dúvida alguma os anticorpos são as moléculas mais importantes de todo o sistema imune. Além disso, as pesquisas científicas possibilitaram o devenvolvimento em laboratório de anticorpos específicos contra inúmeras doenças, o que possibilitou a utilização destes em ensaios laboratoriais para diagnóstico dessas patologias. Todos os ensaios laboratoriais para detecção específica de doenças, os chamados marcadores, nada mais são que anticorpos produzidos pelo organismo do paciente e estes serão detectados ou não no soro do paciente. O inverso também é realizado em alguns testes, ou seja, utilizamos como reagentes anticorpos específicos contra uma determinada doença e ao reagir com o soro do paciente pode-se detectar a presença ou não do antígeno no soro do paciente. Os anticorpos são um grupo de proteínas séricas produzidas pelos linfócitos B. Eles são a forma solúvel do receptor de antígenos. Os anticorpos ligamse especificamente aos antígenos e assim promovem efeitos secundários. Enquanto uma parte da molécula do anticorpo se liga ao antígeno, outras regiões interagem


com outros elementos do sistema imune, como os fagócitos ou com uma das moléculas do complemento. Antígenos são quaisquer moléculas que possam ser reconhecidas pelo sistema imune adaptativo. O reconhecimento do antígeno é a base principal de todas as respostas imunes adaptativas. O ponto essencial a ser considerado com relação ao antígeno é que a estrutura é a força iniciadora e condutora de todas as respostas imunes. O sistema imune evoluiu com a finalidade de reconhecer os antígenos e destruir e eliminar a sua fonte. Quando o antígeno é eliminado, o sistema imune é desligado. O princípio da vacinação está baseado em dois elementos fundamentais da resposta imune adaptativa: memória e especificidade. O objectivo no desenvolvimento da vacina é alterar o patogene ou as suas toxinas de tal modo que eles se tornem inócuos sem perderem a antigenicidade.

Estrutura quaternária de Imunoglobulina G. Fonte: Genetics Home Reference http://ghr.nlm.nih.gov

uma

Esquema de uma Imunoglobulina G Fonte: www.bmb.leeds.ac.uk

A Resposta Imune Humoral (RIH) é mediada por anticorpos, que são proteínas gamaglobulinas sintetizadas por plasmócitos (linfócitos B diferenciado e


capaz de secretar anticorpos ativamente). Os anticorpos são produzidos com a função principal de neutralizar e eliminar o antígeno que estimulou a sua produção. Esse processo de eliminação é feito de diversas formas e, na maioria das vezes, a produção do anticorpo é mantida por longos períodos, sendo responsável pela chamada imunidade. Anticorpos também podem ser chamados de gamaglobulinas ou imunoglobulinas (Ig). Existem basicamente cinco classes de imunoglobulinas que variam na forma e atividade, porém mais de uma classe é produzida durante o processo de infecção, ou seja, duas classes de imunoglobulinas podem ser produzidas contra um mesmo antígeno. As classes de imunoglobulinas são A, M, G, D e E, sendo chamadas Imunoglobulina A (IgA), Imunoglobulina M (IgM), etc. Todo o desenvolvimento das atuais técnicas imunológicas aqui descritas só foi possível com o desenvolvimento da técnica de obtenção de anticorpos monoclonais, uma vez que os anticorpos utilizados em ensaios laboratoriais para detecção de marcadores devem ser específicos para a patologia que se está pesquisando. Os anticorpos são a chave para o diagnóstico e terapêutica de muitas patologias responsáveis por epidemias e por doenças como o cancro. A biotecnologia é um meio de obter e produzir esses anticorpos. A ligação de antigénios aos receptores membranares dos linfócitos que os reconhecem, estimula a sua divisão, originando clones - seleção clonal. Os anticorpos podem ser utilizados para reconhecer moléculas específicas com grande precisão e podem ser produzidos em laboratório através da injecção de antigénios em animais. Após a resposta imunitária efetuada pelos animais em contato com o agente infeccioso, recolhem-se os anticorpos do seu plasma sanguíneo. Este processo tem como vantagem a obtenção de uma elevada quantidade de anticorpos. Contudo, nos animais e nos seres humanos, a resposta imunitária é, na maior parte das vezes, policlonal, isto é, desenvolvem-se diferentes populações de linfócitos B perante o mesmo agente patogênico. Este tipo de resposta torna-se menos eficiente porque não é canalizado o esforço para a produção do anticorpo mais apropriado, produzido por um único clone de linfócitos B - monoclonal. Na produção deste tipo de anticorpos, um animal é injetado com um 151 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

antígeno e, passado algum tempo, é morto. Os linfócitos B são extraídos do baço do animal, incubados in vitro e é feita a fusão com células de mieloma (um tipo de célula tumoral), com o intuito de obter anticorpos monoclonais.

Procedimento laboratorial para a produção de anticorpos monoclonais. Fonte: http://pwp.netcabo.pt Após a obtenção dos anticorpos monoclonais estes são utilizados nos ensaios laboratorias de diversas formas que variam principalmente nas etapas do processo e na forma de visualização da reação. Basicamente as reações imunológicas para detecção de anticorpos ou antígenos utlizando anticorpos monoclonais são realizadas observando a alteração na coloração do meio de reação, que ocorre devido à agentes adicionados para tal. A coloração desenvolvida é medida por espectroscopia, porém a utilização de radiação, turvação, aglutinação, etc. Estas são outras formas de se detectar as reações antígeno-anticorpo.


A

técnica

atualmente

mais utilizada para detecção de marcadores de infecções é o ELISA (do inglês Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) e suas variações. De maneira geral a técnica

é

realizada

de

duas

maneiras: Pesquisa de antígenos e

Placa de ELISA

anticorpos.

Fonte: www.virology-online.com

A pesquisa de anticorpos utiliza-se placas com antígenos adsorvidos nas paredes dos poços de reação e, ao se pipetar o soro do paciente, caso este apresente anticorpos anti-antígeno adsorvido na placa, estes ficarão fixos. Em seguida realiza-se várias lavagens para retirada de todo o material que não foi ligado ao antígeno. Um nova etapa é a dição de anticorpos anti-região Fc de anticorpos. Este reagente é ligado a uma enzima em sua porção Fc e se liga na porção Fc do anticorpo do paciente ligado ao antígeno da placa. Realiza-se novas lavagens e no último processo é adicionado o substrato daquela enzima ligada na porção Fc e esta irá reagir com o substrato, alterando a cor do meio, que será analisada por espectroscopia.


Esquema de um ELISA para pesquisa de anticorpos

Na pesquisa de antígenos utiliza-se em cada poço da placa de reação, anticorpos adsorvidos na parede contra o antígeno a ser pesquisado e em seguida segue-se por duas maneiras diferentes (sanduíche ou competição) no ELISA por sanduíche, ocorre a adição do soro do paciente contendo o antígeno, em seguida adiciona-se um reagente contendo anticorpo monoclonal anti-antígeno. Lava-se as placas. No próximo passo é adicionado um reagente contendo anticorpos anti-região Fc de anticorpos e a partir daí a técnica segue como na pesquisa de anticorpos. No ELISA por competição, existe também anticorpos adsorvidos na parede do poço contra o antígeno a ser pesquisado porém, juntamente com a amostra de soro do 154 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

paciente é adicionado um reagente contendo agora o mesmo antígeno a ser pesquisado, marcado com a mesma enzima. Haverá uma competição para ligar-se aos anticorpos adsorvidos na parede do poço, quanto mais antígeno estiver presente no soro do paciente, menos antígeno do reagente irá se ligar. Percebe-se que neste caso, a reação é inversa, ou seja, quanto mais colorido for o meio, menos antígeno estava presente no soro do paciente.

Esquema de um ELISA para pesquisa de antígenos. Vale lembrar que na pesquisa de anticorpos pode-se pesquisar diferentes classes de anticorpos presentes no soro do paciente e para tal deve-se utilizar reagente contendo anticorpos anti-região Fc para cada classe de imunoglobulina e desta forma pode-se pesquisar especificamente a classe e contra qual antígeno o anticorpo presente no soro do paciente está direcionado.


Leitor de placas de ELISA

3.2 SISTEMA COMPLEMENTO:

O sistema complemento (SC) é o principal mediador humoral do processo inflamatório junto aos anticorpos. Está constituído por um conjunto de 20 – 30 proteínas, tanto solúveis no plasma como expressas na membrana celular, e é ativado por diversos mecanismos por duas vias, a clássica e a alternativa. O SC compreende apenas 2% das imunodeficiências primárias ou genéticas que é de cerca de 1:10.000 crianças, excluindo-se a deficiência seletiva assintomática de IgA. A deficiência de uma ou mais proteínas da cascata do SC, contudo, poderá ser responsável pela suscetibilidade aumentada a várias doenças. As deficiências podem ser genéticas, quando poderão faltar componentes de ativação, de regulação ou mesmo de receptores ou adquiridas. As proteínas do SC são sintetizadas principalmente nos hepatócitos e macrófagos/monócitos, além de outros tecidos. As proteínas reguladoras ligadas à membrana celular são sintetizadas nas células sobre as quais estão expressas. O SC constitui-se num dos principais efetores da imunidade humoral assim como da inflamação. O SC participa dos seguintes processos biológicos: fagocitose, opsonização, quimiotaxia de leucócitos, liberação de histamina dos mastócitos e 156 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

basófilos e de espécies ativas de oxigênio pelos leucócitos, vasoconstrição, contração da musculatura lisa, aumento da permeabilidade dos vasos, agregação plaquetária e citólise. O SC é uma cascata protéica com função importante na defesa humoral inespecífica. Para um funcionamento normal do mesmo, todos os componentes da cascata devem estar presentes em níveis plasmáticos normais e com uma função fisiológica adequada. A ativação do SC ocorre por duas vias, o que permite a resposta eficiente a diversos processos agressores. O dano provocado no tecido autólogo é controlado por mecanismos de regulação competentes. Os componentes da via clássica, assim como da via terminal, são designados com o símbolo "C" seguidos com o número correspondente (C1, C3, etc.). Já os componentes da via alternativa, exceto C3, são designados com nomes convencionais ou símbolos diferentes (exemplo: fator D, fator B, properdina). A designação dos componentes ativados é feita por uma barra colocada sobre o símbolo da proteína ou do complexo protéico correspondente (exemplo: C1-C4b2a, fator B, etc.). Os produtos da clivagem enzimática são designados por letras minúsculas que seguem o símbolo de determinado componente (exemplo: C5a, C5b). Quando o componente ou fragmento é inativado, é adicionada a letra "i" (exemplo: C3bi, Bbi). As deficiências de proteínas do SC são incomuns, mas não raras. Por exemplo, a freqüência da deficiência heterozigótica de C2 é de cerca de 1:100 nascidos vivos, enquanto que da homozigótica é de cerca de 1:10.000. A deficiência dos componentes iniciais da via clássica pode estar associada com saúde normal, doenças dos colágenos ou infecções. As deficiências de C3 ou de proteínas reguladoras de C3 freqüentemente levam a infecções severas. As deficiências de componentes da via alternativa ou da via efetora comum podem acarretar infecções, particularmente por Neisseria spp. A deficiência de inibidor de C1 causa angioedema. As deficiências congênitas (primárias) ou adquiridas (secundárias) de proteínas de ativação da cascata do SC predispõem as doenças auto-imunes ou infecciosas específicas, em sua maioria por bactérias piogênicas de agressividade considerável, como, por exemplo, o meningococo. As deficiências de proteínas de 157 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

regulação estão implicadas também em doenças do tipo auto-imunes, como é o caso do angioedema e da hemoglobinúria paroxística noturna.

Noção Geral do Sistema Complemento Fonte: G.R. Iturry-Yamamoto, C.P. Portinho. Sistema Complemento: Ativação, Regulação e Deficiências Congênitas e Adquiridas·. 3.3 CITOCINAS: 3.3.1 INTERFERONS (IFN):

Os interferons são proteínas sintetizadas por células em resposta a estímulos específicos. São a primeira linha de defesa contra infecções virais. Tratase de uma reação não-específica do Sistema Imune e é induzido no primeiro estágio das infecções virais antes da resposta imune específica ser estimulada. A ação dos Interferons na superfície das células alvo induz a transcrição de aproximadamente 20-30 genes que irão conduzir uma série de ações antivirais. Os interferons induzem um estado de resistência antiviral em células teciduais não infectadas. O vírus, ao 158 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

replicar-se, vai ativar o gene codificante do interferon. Após a síntese proteíca, a proteína sai da célula e entra na corrente sanguínea, até chegar às células vizinhas que ainda não foram atacadas. A proteína liga-se à membrana celular dessas células e ativa o gene codificante de proteínas antivirais. Estas proteínas virais, por sua vez, vão impedir a replicação do vírus, quando este tentar replicar-se nessas células. Os IFN são produzidos na fase inicial da infecção e constituem a primeira linha de resistência a muitas viroses. Existem três tipos de Interferons: *

Interferons

Alfa

(IFNa) é produzido por por leucócitos

e

outras

células

infectadas por vírus. O Interferon Alpha, sintético, é usado para o combate de muitas doenças virais, como Hepatite C e HIV, porém tem alta toxicidade. A malignidade dessas doenças,

Produção de Interferons infecção viral aguda

faz com que os efeitos colaterais

durante

sejam suportados. * (IFNb)

é

Interferon produzido

Beta por

fibroblastos e células epiteliais infectados por vírus. * Interferon Gama (IFNg) é produzido por alguns linfócitos T ativados e Células NK em resposta a um determinado antígeno (incluindo antígenos virais) ou por mitoses de linfócitos. 3.3.2 INTERLEUCINAS (IL):

As interleucinas compõem um grande grupo de citocinas denominadas por IL-1 a IL-15, produzidas principalmente por células T, embora algumas sejam sintetizadas também por macrófagos e células teciduais. As interleucinas possuem 159 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

uma variedade de funções, mas a maioria delas está envolvida na indução da divisão de outras células. Cada interleucina atua sobre um grupo limitado e específico de células que expressam receptores adequados para cada interleucina. É importante destacar que a hematopoiese é regulada por mais de uma interleucina. As IL-1 e IL-6 estão envolvidas na ativação do ciclo celular das células-tronco em repouso (ou auto-renováveis). A IL-3 está envolvida no crescimento dos precursores das linhagens hemopoiéticas da mesma forma que o fator estimulador de colônias de granulócitos/macrófagos (GM – CSF). Na medida em que as células se diferenciam, citocinas específicas de linhagens apresentam atividades importantes; a eritropoietina para os eritrócitos, o fator estimulador de colônias de macrófagos (M – CSF) para os macrófagos, o fator estimulador de colônias de granulócitos (G – CSF) para os granulócitos, entre outros.


Tabela de Interleucinas Fonte: Artigo Educacional: Avanços tecnológicos em hematologia laboratorial – Paulo C. Naoum.

3.3.3 FATORES ESTIMULADORES DE COLÔNIA (CSF):

Os fatores estimuladores de colônias (CSF) estão diretamente relacionados na divisão e diferenciação das células-tronco na medula óssea, bem como dos precursores dos leucócitos sanguíneos. A quantidade de diferentes CSF é parcialmente responsável pelas proporções dos diferentes tipos celulares que serão


produzidos. Alguns CSF também promovem a diferenciação extramedular de células. Finalmente outras citocinas além das acima citadas, como são os casos do fator de necrose tumoral - TNFa e TNFb e do fator de transformação de crescimento (TGF b) que, embora possuem várias funções, são particularmente importantes nas reações inflamatórias e citotóxicas. Nesse contexto específico das citocinas, o futuro da análise laboratorial certamente deverá estar direcionada na monitoração quantitativa e na determinação qualitativa das diferentes interleucinas, bem como nas respostas às reações fisiopatológicas causadas por processos inflamatórios e citotóxicos.

Ações das diversas citocinas na diferenciação e maturação celular Fonte: Escola Paulista de Medicina - UNIFESP


ENSAIOS IMUNOLÓGICOS:

Os ensaios imunológicos nada mais são que a detecção e quantificação de determinados agentes patológicos (antígenos) ou anticorpos presentes no soro do paciente. De maneira geral os antígenos podem ser vírus, bactérias, parasitas, ou mesmo proteínas dos mesmos. Os anticorpos podem ser contra agentes estranhos ou mesmo estruturas celulares normais onde à presença de anticorpos indica doença auto-imune. Os ensaios imunohematológicos utilizam anticorpos monoclonais ou policlonais e hemácias. Desta forma a determinação do Grupo Sanguíneo, os Testes de Coombs Direto e Indireto são ensaios imunohematológicos. A seguir serão discutidos os ensaios imunológicos de maior freqüência em laboratórios de análises clínicas e em seguida uma visão geral dos avanços na área: 1. FATOR REUMATÓIDE:

O termo fator reumatóide (FR) engloba um grupo de auto-anticorpos das classes IgG, IgM e IgA que têm em comum a capacidade de reagir com diferentes epítopos da porção Fc da molécula da imunoglobulina G humana. O FR IgM pode servir como marcador precoce na Artrite Reumatóide (AR), apoiando-se em dados que demonstram que o risco de desenvolvimento da doença aumenta de forma proporcional ao aumento da concentração de FR em indivíduos normais. Os pacientes com artrite que cursam com FR positivo, principalmente quando em concentrações elevadas, correm maiores riscos de apresentar complicações clínicas e uma menor resposta à terapia. O Fator Reumatóide está presente em cerca de 50-90% dos casos de AR clássicos, alguns meses após o início da doença. O FR está aumentado também em 15 a 35% dos casos de lúpus eritematoso sistêmico (LES). Sabe-se hoje que o FR não é produzido apenas sob condições patológicas, e uma pequena parcela da 163 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

população normal, especialmente os idosos, pode apresentar positividade para FR. Esses percentuais de incidência, tanto nas patologias como nos pacientes normais, assim como a ocorrência de falsos positivos, variam de acordo com a sensibilidade e a especificidade do método utilizado. Os ensaios tradicionais para investigação do FR empregavam partículas de látex revestidas por imunoglobulina G humana (Prova do Látex) ou, na Hemaglutinação Indireta, hemácias de carneiro, revestidas por imunoglobulina de coelho (Reação de Waller-Rose). A prova do látex era considerada mais sensível, e a reação de Waller-Rose mais específica. Realizadas em conjunto, fornecem dados complementares. Atualmente, o método de referência para a pesquisa do FR é a nefelometria, que fornece um resultado numérico em UI/mL, em vez dos resultados em títulos, resultantes de diluições fornecidas pelo método anterior (látex), o que permite um melhor acompanhamento dos pacientes. Com a nefelometria, podem ser identificadas as três classes de auto-anticorpos, ou seja, o FR das classes IgG, IgM e IgA. A identificação e a quantificação da classe do FR que se encontra elevada podem ser realizadas pelo método de ensaio imunoenzimático. A utilidade clínica dessa individualização e quantificação tem sido cada vez mais explorada. Por exemplo, a presença de FR IgA nas manifestações extra-articulares da AR com ausência de FR IgM ou IgG; a predominância na AR de FR IgM, sendo que o FR IgG e IgA estão geralmente presentes, mas em baixa freqüência e quantidade. É incomum a detecção concomitante do FR das três classes em outra patologia que não a artrite reumatóide. 2. VDRL (LUES):

A prova do VDRL (Veneral Disease Research Laboratories test) é um dos testes não treponêmicos utilizados rotineiramente no teste de triagem no imunodiagnóstico da sífilis. Devido ao baixo custo e praticidade quanto à sua realização, vem sendo usado em larga escala na maioria dos laboratórios de 164 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

unidades de atenção primária de saúde. Apresenta uma técnica rápida de microfloculação, na qual utiliza antígenos extraídos de tecidos como a cardiolipina, um lípide derivado do coração de bovinos. A cardiolipina, quando combinada com lecitina e colesterol, forma sorologicamente um antígeno ativo, capaz de detectar anticorpos humorais presentes no soro durante a infecção sifilítica, uma a quatro semanas após o aparecimento do cancro primário. As dosagens quantitativas do VDRL, expressas em títulos, em geral se elevam até o estágio secundário. A partir do primeiro ano da doença, os títulos tendem a diminuir, podendo a reatividade desaparecer mesmo sem tratamento. Com a infecção corretamente tratada, o VDRL tende a negativar-se entre 9-12 meses, embora a reatividade em baixos títulos (< 1:8) possa perdurar por vários anos ou até por toda a vida. Os anticorpos estão presentes nas primeiras semanas da doença e, quando em títulos iguais ou maiores de 1/16, sugerem fortemente casos de sífilis; títulos inferiores, geralmente até 1/8, são encontrados em diferentes patologias, especialmente no lúpus eritematoso sistêmico e como títulos residuais (cicatriz sorológica) de sífilis anteriormente tratada. A pesquisa de anticorpos treponêmicos, que são específicos contra o Treponema pallidum, é indicada como testes confirmatórios e

pode

ser

realizada

pela

imunofluorescência indireta (FTAABS) e pela hemaglutinação passiva

visto em microscopia de Campo Escuro Treponema

(TPHA).

pallidum

O FTA-ABS (fluorescent treponemal antibody absorption) é o mais sensível específico para Sífilis e auxilia no diagnóstico de diferentes estágios da doença. Permite a pesquisa de anticorpos IgG e IgM, fundamental na investigação diagnóstica da sífilis congênita, assim como na avaliação do estágio da doença. Quando positivos, permanecem por toda a vida como cicatriz sorológica. Quando negativos, afastam o diagnóstico de sífilis. Apesar de sua alta especificidade, existem relatos de reações falso-positivas em 2% da população normal em pacientes 165 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

com lúpus eritematoso sistêmico, durante a gravidez, na lepra, mononucleose, leptospirose, artrite reumatóide, cirrose biliar primária e doenças associadas à produção de globulinas anormais. A reação de hemaglutinação passiva (TPHA) é, também, considerada teste confirmatório. Resultados falso-positivos são relatados em diferentes patologias. Sua sensibilidade é similar à do FTA-ABS, com exceção da investigação da fase primária, quando é menos sensível. Assim como no FTA-ABS, se positivos, os anticorpos permanecem por toda a vida como cicatriz sorológica. O diagnóstico da sífilis congênita baseia-se na presença de anticorpos IgM, sendo o método de escolha a pesquisa do FTA-ABS IgM. Entretanto, um resultado negativo não afasta a possibilidade de infecção, já que a positividade só acontece em cerca de 80% dos casos. A persistência de reações sorológicas positivas, treponêmicas e nãotreponêmicas, por mais de seis meses após o nascimento é altamente indicativa de sífilis congênita. 3. ASLO (ANTIESTREPTOLISINA “ O” ):

Os Streptococcus beta-hemolíticos do grupo A causam infecções clínicas especialmente de orofaringe e pele, endocardites e quadros não-supurativos, como febre reumática e glomerulonefrite aguda. A estreptolisina O é uma das toxinas extracelulares liberadas pelo Streptococcus beta-hemolítico do grupo A. Ela é capaz de induzir a síntese de anticorpos específicos, os anticorpos antiestreptolisina O (ASLO), em cerca de 80% das infecções. O uso de antibióticos, corticóides e drogas imunossupressoras podem inibir a produção de ASLO. Os anticorpos elevam-se na primeira semana, atingindo valores máximos em 2 a 4 semanas após a infecção estreptocócica e retornando aos valores normais após 6 a 12 meses. A manutenção de títulos de elevados ou a sua elevação em amostras seguidas são indicativas de infecção aguda,

reinfecção

ou

lesões

pós166


estreptocócicas.

Apesar

de

níveis

circulantes de ASLO serem encontrados na maioria dos pacientes com febre reumática

e

glomerulonefrite

pós-

estreptocócica, sua maior indicação é no seguimento de pacientes com febre Streptococcus visualizados em microscopia eletrônica

reumática, já que nesses casos os títulos se correlacionam melhor com a atividade da doença. Cerca de 80 a 85% dos casos de febre reumática cursam com altos títulos.

Streptococcus em microscopia óptica

visualizados

4. BRUCELOSE:

A brucelose é uma zoonose, e a forma humana é causada por uma das quatro espécies: Brucella melitensis, a causa mais comum em todo o mundo, adquirida pelo contato com cabras, carneiros e camelos; Brucella abortus, adquirida por contato com bois; Brucella suis, com porcos; e Brucella canis, com cães. O contágio se dá pelo contato com a pele ou por ingestão de secreções contaminadas por esses animais. Tais bactérias mantêm-se viáveis em solo seco por cerca de 40 dias, e no caso de solo úmido esse prazo é ainda maior. São destruídas pela pasteurização e fervura, mas resistem ao congelamento.


A

contaminação

relacionada

à

ocupação profissional, como é o caso de fazendeiros, veterinários, processadores de carne, são a fonte mais freqüente. Na população em geral, a fonte mais comum de contaminação é a ingestão de leite e derivados

não-pasteurizados

e

o

Microscopia

eletrônica

consumo de carne crua. Pode ser

mostrando Brucella abortus

transmitida de pessoa a pessoa, pela

Fonte:

placenta e durante a amamentação, e

www.cienciahoje.uol.com.br

são citados casos raros de contaminação por atividade sexual. A infecção pode distribuir-se amplamente pelo organismo, causando lesões praticamente em qualquer órgão, com mais freqüência no coração, ossos e articulações, tratos respiratório, gastrointestinal e geniturinário, globo ocular, pele, sistema nervoso central e sistema endócrino. O quadro clínico inicial é comum a outras doenças febris. O período de incubação dura em média de 1 a 3 semanas, podendo, em alguns casos, durar vários meses. A multiplicação intracelular do microrganismo ocorre nos gânglios linfáticos e sistema reticuloendotelial. A gravidade do quadro é variável, podendo apresentar-se com comprometimento leve a grave. O quadro apresenta sintomas comuns como febre, mialgia, cefaléia, anorexia, artralgia e lombalgia. O exame clínico pode ser pouco expressivo ou apresentar linfadenopatia, hepatoesplenomegalia, dor à palpação da coluna vertebral, dor abdominal e outras manifestações. O diagnóstico preciso é feito mediante a associação de história compatível com probabilidade de infecção, sinais clínicos e detecção de anticorpos por reações de aglutinação, visíveis a olho nu. O diagnóstico é de grande importância no período pré-natal, pois pode levar à morte fetal. Os antígenos bacterianos têm a capacidade de induzir a formação de anticorpos específicos, inicialmente da classe IgM e logo após das classes IgG e IgA . Esses anticorpos aparecem a partir da segunda semana da doença, com picos 168 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

entre a terceira e sexta semanas. Títulos maiores ou iguais a 1/160 são considerados significativos quando encontrados em região não-endêmica. Em áreas endêmicas e em profissionais de alto risco de contaminação, são considerados significativos títulos iguais ou acima de 1/320. Altos títulos de IgM indicam infecção aguda; altos títulos de IgG, infecção em atividade; quando mais baixos, podem significar infecção passada. Recomendase a análise pareada com intervalo de duas semanas na avaliação dos casos duvidosos: variações de quatro vezes o título anterior são sugestivas de infecção aguda. Reações com títulos baixos podem ser encontradas em pacientes vacinados contra febre tifóide. Podem ser encontradas reações cruzadas por infecção por outras bactérias e após intradermorreação, com antígenos de Brucella. 5. DOENÇA DE CHAGAS:

A tripanossomíase americana ou doença de Chagas é uma parasitose endêmica causada pelo Trypanosoma cruzi. Pode cursar com infecções agudas ou crônicas. A forma aguda em geral é uma doença febril discreta. Podem evoluir especialmente em crianças, com um quadro mais exuberante, que se caracteriza por febre, anorexia, edema da face e dos membros inferiores, linfadenopatia e hepatoesplenomegalia discreta. Mais raramente ocorre miocardite. Após a fase aguda, o paciente, permanece infectado e passa para uma fase crônica assintomática. A doença crônica sintomática irá se manifestar anos ou mesmo décadas após a fase aguda. As clássicas manifestações crônicas se relacionam com distúrbios de ritmo e condução cardíaca, tromboembolias, miocardiopatia chagásica, megaesôfago e megacólon.


Nas

situações

de

imunossupressão, pode ocorrer a reativação do quadro, que muitas vezes é fatal. A transmissão

ocorre

por

vetores

hematófagos, mas pode se dar por via congênita, transfusional e outras formas menos freqüentes, como a inoculação involuntária em laboratório. Os métodos sorológicos para diagnóstico

da

doença

de

Chagas

Tripanosoma cruzi Agente causador Doença de Chagas

da

Barbeiro Agente transmissor doença de Chagas

da

apresentam sensibilidade e especificidade elevadas, sendo úteis para o diagnóstico nas fases

aguda

e

crônica

da

doença.

Entretanto, é possível a reação positiva por reatividade cruzada com as leishmanioses, especialmente com a forma visceral e as formas cutâneo-mucosas da leishmaniose tegumentar, e com outros antígenos em comum. Por isso, é recomendável a realização de reações por diferentes métodos como Hemaglutinação (Hemácias de carneiro com antígenos de Tripanosoma cruzi adsorvido nas membranas e com a presença de anticorpos no soro do paciente haverá uma aglutinação visível a olho nu), Imunofluorescência (utilização de placas contendo antígenos de Tripanosoma cruzi e após mistura com soro do paciente são adicionados anticorpos marcados com reagentes fluorescentes que serão posteriormente analisados em microscópios especiais), e Enzima Imunoensaio (ELISA). Devem ser realizados no mínimo dois métodos, para que se controlem mutuamente, visto que, em cada método, são utilizados diferentes antígenos e formas do parasita, o que permite diminuir a possibilidade de resultados falsopositivos. Resultados positivos devem ser encontrados nos dois métodos utilizados para confirmar o diagnóstico. Nos casos de apenas um método apresentar 170 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

positividade, faz-se necessária a análise clínica da história epidemiológica, achados clínicos e outros exames diagnósticos complementares. Na fase aguda, anticorpos das classes IgM e IgG são detectáveis. Na fase crônica, são encontrados anticorpos da classe IgG. Os níveis de reatividade diferem para cada método e de acordo com a finalidade do diagnóstico. Os valores considerados para triagem de doadores de sangue são sempre inferiores aos considerados para o diagnóstico clínico. 6. PROTEÍNA C REATIVA:

A Proteína C Reativa (PCR) é, por vezes, confundida com uma técnica laboratorial denominada PCR (Polimerase Chain Reaction), uma reação que possibilita a amplificação de fragmentos de DNA e em seguida analisá-los. As reações inflamatórias são respostas do organismo aos diferentes tipos de agressão tecidual, como as infecções virais, bacterianas, parasitárias ou fúngicas, e às agressões físicas, químicas e imunológicas. Diante da reação inflamatória, os monócitos secretam substâncias como IL-6, IL-1 e TNF, que levam ao hepatócito a informação da necessidade de síntese das denominadas proteínas de fase aguda. A determinação da concentração plasmática dessas proteínas ajuda, clinicamente, a avaliar a presença, a extensão e a atividade do processo inflamatório e a monitorar a evolução e a resposta terapêutica. A proteína C reativa (PCR) é uma das proteínas plasmáticas de fase aguda. Foi identificada no soro de pacientes com pneumonia pneumocócica, em reação de precipitação do polissacarídeo C da parede do pneumococo (Grampositivo), agente etiológico da patologia. É usada rotineiramente para monitorar a resposta de fase aguda, sendo considerada uma das mais sensíveis, por apresentar algumas características, como meia-vida curta (entre 8 a 12 horas) e valores normais muito baixos (< 0,5 mg/dL), que, em resposta a estímulos inflamatórios, podem atingir valores até 100 vezes o normal em menos de 24 horas. Além de elevar-se rapidamente após o estímulo inflamatório (4 a 6 horas), na ausência de estímulo crônico, normaliza-se em 3 a 4 dias.


A proteína C reativa deve ser utilizada como auxiliar no diagnóstico, controle terapêutico e acompanhamento de diversas patologias, uma vez que é o mais sensível e precoce indicador de processos inflamatórios resultantes de infecções, carcinomas, necrose tecidual e cirurgias. Depois de 24 horas, a velocidade de hemossedimentação (VHS) é complementar à PCR. Durante muitos anos, a PCR foi utilizada apenas no contexto de avaliação de processos inflamatórios, mas, atualmente, vem assumindo outros papéis importantes na clínica devido ao desenvolvimento de técnicas que possibilitam dosar a quantidade desta proteína em valores mínimos, e tal técnica é descrita como PCR Ultra-sensível. A dosagem quantitativa, pela técnica de imunonefelometria, utilizando anticorpos monoclonais antiPCR, ao contrário dos métodos tradicionais qualitativos, permite a liberação de resultados quantitativos (mg/dL) que facilitam a interpretação clínica e o acompanhamento laboratorial de cada caso. Por exemplo, podemos citar que, como marcador de mortalidade nos primeiros 24 meses após infarto agudo do miocárdio (IAM), foi de maior valor que as enzimas cardíacas. Além disso, altos níveis séricos de PCR puderam ser considerados fatores preditivos de ruptura cardíaca subaguda pós-IAM. Nove pacientes apresentando esse tipo de complicação foram comparados ao grupo controle de 28 pacientes infartados sem complicações. No grupo com ruptura cardíaca, níveis elevados de PCR, superiores a 20 mg/dL, foram evidenciados no segundo dia pós-IAM. Um marcador tradicional de lesão muscular, a enzima CPK, não mostrou diferença significativa entre os dois grupos. A sensibilidade diagnóstica de altos níveis séricos de PCR, predizendo uma possível ruptura cardíaca pós-IAM, foi de 89%, garantindo o seu uso na prática cardiológica. Com

a

recente

descoberta

de

componentes

inflamatórios

na

arteriosclerose, a PCR foi proposta como indicador de risco para doença coronariana e acidentes vasculares cerebrais. O risco, revelado pelos altos teores séricos de PCR, é independente de fatores ligados à dislipidemia e pode ser reduzido pelo uso de aspirina como tratamento profilático. Essas novas hipóteses de patogêneses de doenças arterioescleróticas associadas à possibilidade de terapêutica preventiva abrem novas perspectivas, que devem ser consideradas. Da mesma forma, níveis 172 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

aumentados da PCR parecem estar relacionados a eventos coronarianos em pacientes com angina estável ou instável. Em outras áreas da medicina, como a infectologia e a cirurgia, a importância da PCR também deve ser levada em conta. O uso da dosagem da PCR foi avaliado num estudo envolvendo 193 casos de endocardite infecciosa. Níveis elevados de PCR puderam ser evidenciados em casos que cursaram com complicações, levando à conclusão de que a PCR é um bom marcador prognóstico e pode ser utilizada para monitorar a resposta à terapia antimicrobiana em endocardites infecciosas. Na recuperação cirúrgica, a PCR aumenta nas primeiras 4 a 6 horas, revelando picos séricos por volta das 48 a 72 horas de pós-operatório, em concentrações de 2,5 a 3,5 mg/dL. Em cirurgias que cursam com evolução favorável, os níveis de PCR normalizam-se por volta do sétimo dia após o procedimento cirúrgico. Na vigência de complicações, os valores da PCR permanecem elevados, e podem atingir níveis superiores a 3,5 mg/dL. Em estados inflamatórios crônicos, as concentrações de PCR podem persistir altas indefinidamente. Em casos de LES e outras doenças do colágeno, colites ulcerativas e leucemia, as concentrações são, geralmente, normais, porém marcadamente mais altas nas infecções bacterianas do que nas virais, auxiliando no diagnóstico diferencial. Na febre reumática, a PCR é um bom parâmetro de reagudização, pois persiste em concentrações elevadas (>4 mg/dL) quando a doença está ativa, embora decaindo a níveis normais durante a remissão. Encontram-se níveis elevados de PCR e de haptoglobina em pacientes com espondilite anquilosante HLA-B27 clinicamente ativa; mas nem a PCR nem a haptoglobulina estão elevadas nos casos ativos com HLA-B27, em que são encontradas concentrações elevadas de IgA. Soros com altas concentrações de PCR contêm normalmente fator de necrose de tumor elevado (FNT). A relação de FNT/PCR poderia ser útil no acompanhamento de rejeição de transplantes renais. O aumento da PCR urinária em associação com baixos níveis de beta-2macroglobulina em pacientes com transplante renal é indicativo de infecção extra-


renal (sensibilidade 100%, especificidade 99%). A elevação de ambas as proteínas na urina é uma forte indicação de infecção bacteriana ou de rejeição aguda. Aproximadamente 60% de recém-nascidos saudáveis podem apresentar, normalmente, concentrações concentrações de PCR acima de 1 mg/dL durante os primeiros 20 dias de vida. Conseqüentemente, as faixas de referência de adultos não são adequadas para crianças. 7. MONONUCLEOSE INFECCIOSA:

Doença infecciosa aguda causada pelo vírus Epstein-Barr (EBV), apresenta uma maior incidência em crianças, adolescentes e adultos jovens. Durante o curso da doença, aparecem anticorpos heterófilos, capazes de aglutinar hemácias de carneiro e de cavalo, que são uma característica dessa infecção. São anticorpos da classe IgM não-específicos para mononucleose, podendo estar presentes em outras patologias. O diagnóstico é feito pelo conjunto dos sinais clínicos associados à positividade para anticorpos heterófilos. Diante de um quadro sugestivo que apresente a pesquisa negativa para esses anticorpos, faz-se necessária a pesquisa de anticorpos específicos para EBV, visto que mais de 70% das crianças e cerca de 10% dos adultos não desenvolvem anticorpos heterófilos. Os achados clínicos mais freqüentes são: febre, adenomegalia, linfocitose com alto grau de atipia linfocitária (mais de 50%, geralmente com presença de células de Downey), esplenomegalia e hepatomegalia. O monoteste, também conhecido como reação de Hoff e Bauer, é uma reação de hemaglutinação que detecta a presença de anticorpos heterófilos utilizando hemácias de cavalo, sendo útil como teste de triagem para mononucleose. É sensível, positivando logo nas primeiras semanas e mantendo-se positivo por cerca de 12 semanas. O monoteste não é um exame específico para EBV, não sendo útil na

Vírus causador da mononucleose Fonte: www.spaceflight.esa.int


avaliação da doença crônica. A reação de Paul-Bunnell pesquisa a presença de anticorpos heterófilos contra hemácias de carneiro. São considerados sugestivos de mononucleose títulos superiores a 1/56. Entretanto, esses anticorpos podem pertencer a outro grupo de anticorpos heterófilos, como os encontrados na doença do soro e no soro normal (anticorpos de Forssman). Como os anticorpos heterófilos que surgem na mononucleose possuem a característica característica de serem absorvidos pela hemácia de boi e de não serem absorvidos pelo rim de cobaia, a reação de Paul-Bunnell-Davidsohn explora essa característica, permitindo a exclusão de outros anticorpos heterófilos, servindo dessa forma como teste confirmatório. Um pequeno percentual de falsopositivos foi descrito em linfomas, na leucemia linfocítica aguda, na hepatite infecciosa, no carcinoma de pâncreas, na infecção por citomegalovírus, na artrite reumatóide e na rubéola. A pesquisa de anticorpos para o vírus EBV se faz necessária para a confirmação do diagnóstico da mononucleose naqueles casos nos quais os pacientes apresentam alterações clínicas sugestivas, porém sem os achados hematológicos clássicos e os títulos negativos para anticorpos heterófilos. São anticorpos específicos que aparecem ao final do período de incubação, atingindo títulos mais baixos durante a fase de recuperação, que irão persistir por toda a vida como indicadores de imunidade para essa doença. Os anticorpos específicos para EBV devem ser pesquisados também para o diagnóstico diferencial das patologias que podem mimetizar um quadro de mononucleose, como pode acontecer em quadros de hepatites virais agudas, colagenoses, síndrome de soroconversão do HIV-1, infecção por citomegalovírus e toxoplasmose. 8. EPSTEIN-BA EPSTEIN-BARR RR VÍRUS:

O vírus Epstein-Barr (EBV) é um herpesvírus humano conhecido por causar a mononucleose infecciosa e também por sua provável participação na etiologia de alguns carcinomas (nasofaríngeo), linfomas (linfoma de Burkitt) e 175 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

desordens linfoproliferativas em pacientes imunossuprimidos. Recentemente, foi descrita a síndrome ativa crônica severa, na qual a linfoproliferação continua ativa. Já o papel etiológico do EBV em outras patologias como artrites reumáticas, doença de Hodgkin e síndrome de fadiga crônica ainda não estão bem definidas. Na fase aguda da mononucleose infecciosa, anticorpos IgM e IgG para antígenos precoces do EBV (EA), antígenos do capsídeo viral (VCA) e antígenos nucleares (EBNA) aparecem em seqüência. A pesquisa mais utilizada é a de anticorpos IgM contra VCA por enzima imunoensaio. A positividade indica infecção aguda. Entretanto, a presença de anticorpos IgM para VCA ou IgM /IgG para EA, com ausência ou baixa concentração de anticorpos contra EBNA, indica infecção recente ou em curso. A presença de anticorpos contra VCA e a relação IgG/IgM inferior a 1 podem auxiliar no diagnóstico de casos difíceis. A análise da avidez de anticorpos IgG contra VCA do EBV também é útil em casos de reativação ou infecção recente. A persistência de EA e/ou VCA IgG em títulos altos indica infecção crônica pelo EBV. A pesquisa de anticorpos específicos para EBV deve ser realizada nos quadros de mononucleose para confirmação do diagnóstico ou nos casos com suspeita clínica que cursa com anticorpos heterófilos negativos, não sendo diagnosticada pelos métodos tradicionais,

e

também

para

o

diagnóstico diferencial das patologias

Vírus Epstein-Barr

que podem mimetizar um quadro de

Fonte: www.sciencenews.org www.sciencenews.org

mononucleose como

hepatites

colagenoses,

(mononucleose-like), virais síndrome

agudas, de

soroconversão do HIV-1, citomegalia e toxoplasmose. 176 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

A comparação de métodos de cultura de células e a amplificação genômica por PCR indicam a maior sensibilidade da técnica molecular (PCR) na detecção de EBV. A infecção crônica por EBV pode ser detectada pela presença do DNA-EBV em sangue periférico por PCR. Em pacientes em tratamento profilático com imunoglobulinas, o diagnóstico sorológico pode acarretar problemas relativos a reações falso-positivas. A técnica de PCR usando células mononucleares de sangue periférico pode ser usada para o diagnóstico preciso e precoce da infecção por EBV em pacientes altamente vulneráveis, com doenças linfoproliferativas, nos quais a PCR apresenta-se altamente sensível, mesmo em amostras de saliva. A PCR é útil em detectar o EBV em outras patologias tais como: pneumonite intertiscial, pericardite e miocardites a partir da análise de tecidos ou de líquidos corpóreos. Entretanto, deve-se ter o cuidado de proceder à avaliação qualitativa e quantitativa em amostras coletadas em diferentes datas, além da correlação clínica para a confirmação da relação entre os sintomas e a etiologia viral. 9. PPD (PROTEÍNA PURIFICADA DERIVADA):

O derivado protéico purificado (PPD) é um antígeno utilizado na realização do teste cutâneo que pode ser usado na avaliação da imunidade celular como auxiliar no diagnóstico de infecção pelo Mycobacterium tuberculosis (MB) e na avaliação após vacinação específica para MB. A avaliação da resposta considera a presença ou não de halo de enduração, que resulta da indução de uma reação de hipersensibilidade mediada por células (tipo IV), causada por linfócitos T sensibilizados após contato com o antígeno. A

formação

de

um

halo

eritematoso pode acontecer logo após a aplicação intradérmica do antígeno. Não deve ser valorizada por se tratar de uma reação inespecífica. A reação específica ocorre 24 a 72 h após a aplicação na forma 177 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

de uma enduração medida e liberada em milímetros. A leitura deve ser realizada 48 horas após a aplicação. A

ausência

de

enduração

significa um teste negativo, conforme esperado em pacientes não-vacinados, que nunca

tiveram

contato

com

o

microrganismo ou em situações que levem a alergia cutânea, como por exemplo: sarampo, sarcoidose, uso de corticóide ou de

drogas

imunossupressoras,

lepra

Reação de PPD positiva

lepromatosa, entre outras. A positividade encontrada em pacientes vacinados ou que já tiveram contato prévio com o microrganismo é normalmente entre 5 a 10 mm de enduração, podendo ser encontradas reações superiores geralmente associadas à presença de flictenas. Crianças imunizadas podem necessitar de dose de reforço para apresentar uma reação cutânea positiva. 10. HIV:

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é isolado de casos de síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), doença que se caracteriza por uma progressiva e fatal deterioração do sistema imune. Associados à infecção HIV ocorrem doenças oportunistas (pneumocistose, toxoplasmose, candidíase), neoplasias (sarcoma de Kaposi, linfomas B) e complexo demencial. O vírus entra no organismo na forma livre ou através de células infectadas; é transmitido por via sexual, produtos sangüíneos e aleitamento, dando início ao processo patogênico que resultará em morte a longo prazo do indivíduo. Na viremia inicial, poucas semanas após a infecção, há replicação de vírus com uma só especialidade, embora a população de vírus doador seja antigenicamente heterogênea. Aparecem mutantes e esta população passa a dominar na fase tardia da infecção. A resposta 178 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

de anticorpos ocorre quando a viremia inicial diminui e o quadro persiste até o aparecimento da doença. Anticorpos são neutralizantes do agente infeccioso, havendo forte correlação entre essa atividade e a habilidade de bloquear a interação entre as glicoproteínas do vírus gp 120/160 e as moléculas CD4 dos linfócitos. O vírus pertence ao gênero Lentivirus, da família Retroviridae. Após a penetração

na célula por fusão com a membrana,

o

core

viral

se

desintegra e o HIV transcreve o seu RNA em DNA através da transcriptase reversa. O DNA viral pode permanecer no citoplasma ou integrar-se ao genoma da

Partículas virais do HIV (azul) deixando um linfócito para infectar outra célula. Fonte: www.wellesley.edu

célula, sob forma de pró-vírus, latente

por

tempo

variável,

replicando toda vez que a célula entra em divisão. A acumulação destas partículas no citoplasma tem sido associada à morte celular isolada. A união das proteínas virais e genoma para formação de virion se dá no citoplasma, liberando-se por brotamento através de fusão com a membrana celular. Esse nível de interação varia de pessoa para pessoa e pode ser preditivo de um curso clínico de longa duração. Na fase clinicamente estável, indivíduos infectados geralmente apresentam níveis de viremia baixos e persistentes e uma depleção gradual de linfócitos T CD4(+) que pode levar a uma severa imunodeficiência, ao aparecimento de múltiplas infecções oportunistas, a neoplasias e à morte. O diagnóstico laboratorial pode ser feito pela pesquisa de anticorpos contra o HIV-1 por técnicas imunoenzimáticas e Western-blot. Essas técnicas, embora precisas, apresentam limitações em determinados casos, tais como: 179 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

crianças em idade até 15 meses, nas quais a permanência de anticorpos maternos, adquiridos na fase gestacional através da placenta, no momento do parto ou na fase pós-parto, através do colostro, pode determinar resultados falso-positivos; casos de infecção recente, em períodos inferiores a 2 ou 3 meses, nos quais não houve, ainda, a soroconversão, e casos que apresentam resultados indeterminados ou duvidosos. Sorologia: Os testes

sorológicos mais comuns são os

imunoenzimáticos

ELISA

(Enzyme

como Linked

Immunosorbent Assay) e ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay);

esses

pesquisam

testes

que

anticorpos

circulantes (anti-HIV) utilizam antígenos, adsorvidos em fases sólidas, que podem ser de origem

sintética,

peptídeos

sintéticos (geralmente gp41 e

Esquema de um vírus HIV Fonte: www.geocities.com/mpennafort/hiv_ciclo .html

p24 para o HIV-1 e gp36 para o HIV-2) ou o próprio vírus inativado. O método ELFA apresenta uma versão para a detecção simultânea de anti-HIV e antígeno p24 (HIV-DUO), favorecendo o diagnóstico precoce de infecção por HIV, antecipando-o em até sete dias, quando comparado a métodos que detectam apenas anti-HIV. Os métodos enzimáticos são, preferencialmente, utilizados para triagens de diferentes populações, em bancos de sangue e amostras sorológicas de indivíduos com sintomatologia sugestiva ou mesmo assintomáticos e com história de situação de risco.


Os testes imunoenzimáticos, licenciados e comercializados atualmente, apresentam sensibilidade e especificidade que ultrapassam 98% a 99%. Segundo recomendações do Ministério da Saúde, a liberação de um teste sorológico anti-HIV positivo só pode ser concretizada se pelo menos dois testes forem realizados em paralelo, com a mesma amostra, por metodologia de diferente procedência (outro fabricante, outro tipo de antígeno ou diferente princípio metodológico) Se os resultados forem positivos ou discordantes (+/ -), necessita-se da realização de um teste confirmatório, sendo o Western-blot o utilizado na rotina da maioria dos laboratórios privados. Caso após estas duas etapas o resultado final se caracterize como positivo, uma segunda amostra clínica deve ser solicitada para a repetição do procedimento realizado na primeira amostra. Havendo discordância entre os resultados da 1ª amostra com os obtidos na 2ª amostra, solicita-se uma nova coleta. O testes confirmatórios da presença de anticorpos anti-HIV indicado em crianças com até dois anos de idade é a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a pesquisa do cDNA-HIV. Em indivíduos com alto risco de exposição ao HIV, uma reatividade intensa pelo teste imunoenzimático apresenta um valor preditivo de 99%. Podem ocorrer reatividades falso-positivas em testes imunoenzimáticos, principalmente em pacientes com hepatite alcoólica, outras patologias em que ocorram anormalidades imunológicas, neoplasias, mulheres multíparas e indivíduos politransfundidos, os quais desenvolveram anticorpos contra antígenos HLA classe II, presentes em linhagens de células onde há a replicação do HIV. Os testes imunoenzimáticos para HIV-1 detectam 40% a 90% de infecções causadas por HIV-2, e testes de ELISA licenciados para HIV-2 divulgam a sensibilidade de 99%. A opção mais utilizada atualmente são os testes imunoenzimáticos que detectam, simultaneamente, anticorpos contra HIV-1 e HIV-2. A detecção de antígeno p24 do HIV-1 circulante por teste imunoenzimático é particularmente útil em determinadas situações. Nas primeiras semanas após a infecção, o antígeno p24 está presente no soro, antes da detecção dos anticorpos. Com o aparecimento desses, o antígeno p24 torna-se indetectável, permanecendo 181 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

assim por meses ou anos. O reaparecimento da antigenemia durante o curso da infecção geralmente está associado a um prognóstico desfavorável. Métodos para a detecção de antígeno p24, principalmente aqueles que utilizam dissociação ácida, também têm sido utilizados para acompanhar pacientes em tratamento antiviral, conforme demonstrado durante ensaios clínicos. Sua eficácia, porém é comprometida em virtude da baixa sensibilidade dos métodos atualmente disponíveis, sendo substituídos pela detecção da carga viral por metodologias de biologia molecular. Western-Blot: O método de Western-Blot é amplamente utilizado como

teste confirmatório dos resultados obtidos em testes imunoenzimáticos. Outros testes também são indicados, como imunofluorescência em células fixadas e o teste RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay). O Western-Blot utiliza antígenos do HIV, obtidos em cultura de linhagem celular, separados eletroforeticamente em bandas distintas, posteriormente transferidas para membrana de nitrocelulose. A reação ocorre entre os antígenos em contato com os anticorpos, presentes no soro ou no plasma de indivíduos infectados. Padrões específicos de reações podem ser identificados, e, embora a definição de testes positivos seja controvertida, a ausência de reações específicas para os diferentes antígenos do HIV confirma a reação negativa.

gp160

Precursor do Envelope Viral (env )

Proteína do Envelope Viral (env ) gp120 Liga-se ao CD4 p24

Proteína core viral (gag )

do

p31

Transcriptase Reversa (po l )

Tabela: Alguns antígenos utilizados na técnica de Western Blot.


Padrões de positividade (presença de anticorpos) podem ser definidos no teste confirmatório de Western-Blot, pela visualização de bandas correspondentes às três principais proteínas virais: a proteína do núcleo, p24 ou p31 e duas proteínas do envoltório, gp41 e gp120/gp160. Alternativamente, o Centers for Diseases Control and Prevention-CDC recomenda que pelo menos uma das duas, p24 ou gp120/gp160, seja identificada. Outras bandas de antígenos do HIV são p17, p31, p51, p55, p66. Padrões definindo casos indeterminados, quando apenas uma das três principais bandas é visualizada no teste de Western-Blot, podem ocorrer, causando dúvidas quanto a real interpretação. Indivíduos infectados, em fase avançada da AIDS, podem não apresentar reatividade para p24, sugerindo resultado indeterminado. Alguns podem apresentar esse padrão por longo período de tempo, sem evidências de infecção por HIV. As interpretações mais corretas e apropriadas para os resultados de testes de ELISA reativos e Western-blot indeterminados envolvem avaliações clínicas e acompanhamento laboratorial. Conforme Portaria n° 59 de 28/01/03 do Ministério da Saúde, deverão constar nos laudos as metodologias e antígenos virais usados em cada ensaio. O diagnóstico sorológico somente poderá ser confirmado após análise de no mínimo 02 (duas) amostras de sangue coletadas em momentos diferentes. Procedência dos kits e antígenos utilizados: BioRad - Proteína recombinante; Diasorin - Proteína recombinante; Biochem - Peptídios sintéticos


Linha 1: Soro HIV+ (Controle Positivo) Linha 2: Soro HIV- (Controle Negativo) Linha A: Paciente A - Ausência de Bandas: Negativo Linha B: Paciente B - Bandas presentes mas sem critérios: Indeterminado Linha C: Paciente C - Bandas p31 OU p24 E bandas gp 160 OU gp120: Positivo. 11. HTLV I/II:

O vírus linfotrópico de células T humanas tipo I (HTLV I) foi o primeiro retrovírus humano a ser descoberto. Descrito inicialmente nos Estados Unidos por Poiesz e cols. No ano de 1980, está atualmente classificado na família Retroviridae. O primeiro relato de infecção pelo HTLV I no Brasil foi feito por Kitagawa et al., após estudo da soroprevalência de anticorpos anti-HTLV I em imigrantes japoneses que viviam no país havia 50 anos. Atualmente, são descritos casos em todo o país, tanto em populações urbanas quanto em comunidades isoladas. Esse tipo viral está diretamente associado à leucemia/linfoma de células T do adulto e a paraparesia espástica tropical/mielopatia associada.


As

proteínas

HTLV

do

encontram-se

codificadas nos genes gag (grupo

antígeno),

pol.

(polimerase) e env (envelope), flanqueados por seqüências terminais

longas

repetidas

(LTR), que contêm sinais importantes para o controle da expressão dos genes virais. A região gag é inicialmente traduzida em uma proteína

Microscopia Eletrônica mostrando o vírus HTLV (verde) infectando um linfócito T (amarelo) Fonte: www.britannica.com

precursora (p53) que é clivada em: proteína da matriz (Ma) ou p19, proteína do capsídeo (Ca) ou p24 e proteína do nucleocapsídeo. A protease é codificada por uma seqüência de leitura aberta (open reading frame - ORF), situada entre a parte 3' da região gag e a parte 5' da região pol. A integrase e a transcriptase reversas são codificadas na região pol. De forma distinta dos outros retrovírus, esse possui uma região particular com cerca de 2 Kb, situada imediatamente acima da LTR 3', denominada inicialmente pX, em razão da sua natureza desconhecida. Essa região contém pelo menos 4 ORF que codificam as proteínas p40 tax, p27 Rex, p21 Rex, p12 I, p13 II, p30 II. O diagnóstico laboratorial da infecção por HTLV pode ser realizado por técnicas sorológicas, tais como testes imunoenzimáticos (ELISA), testes de imunoblotting (Western-Blot) e imunofluorescência indireta (IFI), que detectam anticorpos para as proteínas estruturais do vírus. Contudo, a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) permite rápido acesso às seqüências de DNA e RNA, celular e viral, possibilitando o diagnóstico dos indivíduos que, embora portadores do vírus, ainda não produzem anticorpos em níveis detectáveis. Essa é também a 185 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

técnica mais sensível para a detecção de seqüências de provírus de retrovírus humanos, mesmo quando o número de cópias é baixo. Além dessas técnicas, existem métodos moleculares que são utilizados na quantificação do vírus circulante no organismo do hospedeiro. O risco de transmissão via amamentação e o grau de infectividade in vitro podem ser avaliados através da detecção dos marcadores de infecção e replicação viral no leite de mães portadoras do HTLV, por técnicas de PCR e co-cultura de células mononucleares do leite materno (BMMC). 12. TOXOPLASMOSE:

A sorologia para Toxoplasmose é o método mais utilizado no diagnóstico, entretanto, não existe nenhum teste, que de forma única, suporte ou afaste o diagnóstico de infecção recente ou tardia. Assim, a análise do resultado deve ser cautelosa: Interpretação dos anticorpos IgG: Surgem em 1 a 2 semanas; pico em 1 a 2 meses; caem variavelmente, podendo persistir por toda vida. Valores elevados com IgM negativo não significam maior probabilidade de infecção recente. Interpretação dos anticorpos IgM: Surgem em 5 dias, diminuindo em poucas semanas ou meses. Podem persistir por até

18

meses,

não

significando

Toxoplasma gondii – Agente

necessariamente infecção recente. Um causador da Toxoplasmose Fonte: DPDx/CDC resultado de IgM negativo ou positivo na gravidez não diagnostica ou afasta infecção

aguda,

sendo

necessário

complementação diagnóstica.


A IgM não ultrapassa a placenta, sendo útil no diagnóstico da infecção congênita em recém-nascido. Interpretação dos anticorpos IgA: Detectados em infecções agudas e na doença congênita. Podem persistir por meses, até mais de 1 ano. Maior sensibilidade que IgM na infecção congênita. Teste de Hemaglutinação: Útil para indicar prevalência, mas não para o diagnóstico de infecção neonatal ou quadro recente em gestante, devido à possibilidade de falso-positivos. Detecta anticorpos mais tardiamente que a imunofluorescência e que os estes imunoenzimáticos. Teste de Imunofluorescência Indireta (IFI) IgM: Detecta IgM nas primeiras semanas, desaparecendo em meses. Títulos baixos podem persistir por mais de um ano em 20% dos casos. Falso-positivos para fator reumatóide e fator antinuclear podem ocorrer. Devido à possibilidade de resultados falso-positivos (7%) é aconselhável à repetição da sorologia em três semanas e a sua confirmação com um outro método mais específico como ELFA. Teste de Imunofluorescência Indireta (IFI) IgG: Título começa a subir entre 4 e 7 dias após IgM. Pico em oito semanas e início de queda no sexto mês, sendo que títulos baixos podem persistir por anos. Falso-positivos para fator antinuclear e falso-negativos para títulos baixos de IgG podem ocorrer. Imunoensaio

Enzimático

IgA:

Detectada

na

infecção

recente,

permanecendo elevada por no mínimo 26 semanas. Não atravessa a placenta e não é absorvida pelo leite materno, tendo, pois, utilidade no diagnóstico de Toxoplasmose congênita. Apresenta sensibilidade de 83,3% e especificidade de 94% em crianças com toxoplasmose congênita durante os doze primeiro meses de vida. No primeiro mês de vida, a combinação de IgA e IgM melhora o desempenho dos ensaios em relação aos mesmos de forma isolada. Imunoensaio

Enzimatico

IgM:

Trata-se

de

método

totalmente

automatizado, preciso, rápido e de alta reprodutibilidade. Apresenta especificidade de 98% e sensibilidade de 95%. Por tratar-se de um método sensível pode permanecer detectável até dois anos após a infecção aguda. Um único resultado positivo não pode ser considerado patognomônico de toxoplasmose recente. 187 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

Conforme orientação norte-americana do FDA, resultados positivos requerem confirmação por uma forma alternativa de ensaio, como ELFA, e coleta de nova amostra após três semanas. Imunoensaio Enzimático IgG: Esse método apresenta especificidade de 98% e sensibilidade de 96%. Independente do nível de anticorpos, não pode predizer se a infecção é recente ou tardia. Alto índice de positividade na população brasileira. Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) IgM - captura: Método automatizado, de grande reprodutibilidade, que elimina as interferências do fator reumatóide. Devido a sua alta sensibilidade, pode detectar níveis baixos de anticorpos por longos períodos após fase aguda (18 meses). Útil para confirmação de IgM positivos em outros ensaios. Apresenta sensibilidade de 100% e especificidade de 98,6%. Em pacientes imunocomprometidos resultado negativo desse teste não exclui o diagnóstico de toxoplasmose. Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) IgG: Títulos altos não predizem, de forma isolada, infecção recente. Apresenta sensibilidade de 98,1% e especificidade próxima a 100%. Teste de Avidez IgG (Imunoensaio enzimatico): Na fase aguda anticorpos IgG ligam-se fracamente ao antígeno (baixa avidez). Na fase crônica (> 4 meses) tem-se elevada avidez. É indicado para mulheres grávidas, principalmente no primeiro trimestre, que apresentam IgG e IgM positivos. A detecção de anticorpos de alta avidez em pacientes com IgM positivo indica infecção adquirida há mais de 4 meses. Tratamento antiparasitário pode manter a baixa avidez por mais de quatro meses. Estudo em amostra brasileira evidenciou ser o teste de Avidez de IgG o melhor marcador de infecção aguda em pacientes com IgM positivo. 13. CITOMEGALOVÍRUS:

O citomegalovírus (CMV) é membro do grupo dos beta-herpesvírus. Hoje, é reconhecido como um patógeno que afeta a todas as faixas etárias, tendo caráter 188 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

endêmico em todo o mundo e levando as graves lesões congênitas. A infecção pelo CMV causa um grande espectro de manifestações clínicas, variando de evoluções assintomáticas e infecções sublínicas a quadros de maior gravidade, dependendo da condição imunológica do paciente. Quando sintomática em pacientes imunocompetentes, geralmente evolui com um quadro semelhante ao de mononucleose, com febre, linfadenopatia, alterações hematológicas (leucopenia e trombocitopenia) e, muitas vezes, com sinais e sintomas hepáticos, pulmonares, gastrintestinais ou neurológicos. A transmissão pode se dar por via transplacentária, respiratória, oral, venérea, por intermédio do aleitamento, de transplante de órgãos e transfusão sangüínea. O antígeno já pode ser detectado a partir da 4ª semana que se segue à infecção (período de incubação). Na fase aguda, o vírus pode ser identificado em diferentes secreções corporais. Os anticorpos da classe IgM aparecem logo no início da fase aguda, e os da classe IgG, uma semana mais tarde. Assim como no herpes simples e nos demais vírus do grupo herpes, a infecção pode permanecer latente por toda a vida ou evoluir com episódios de reativação. Depois da primoinfecção, o vírus se mantém de forma latente, com a viremia persistente, porém em níveis baixos. Os anticorpos desenvolvidos se mantêm positivos por toda a vida (IgG). Em situações que levem à diminuição da condição imunológica, pode ocorrer a replicação viral com reativação do quadro. A infecção pelo CMV apresenta maior

significado

grávidas,

em

clínico

nas

mulheres

recém-nascidos

(infecção

congênita), nos imunossuprimidos, como os casos de pacientes transplantados, portadores de neoplasias, pós-operatório de cirurgia cardíaca, em curso de grandes agressões infecciosas e nos indivíduos com AIDS.

Esquema do Citomegalovírus Fonte: www.laboratoriogenoma.it

Normalmente, em indivíduos saudáveis, há dificuldade de correlacionar a infecção por CMV ao episódio clínico da doença, pois a presença de anticorpos 189 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

(IgG) específicos para CMV tem uma prevalência muito alta (>60% da população de adulto), e, como já citado, as manifestações clínicas da infecção são muito variadas. Embora o isolamento do vírus seja ainda considerado o padrão ouro, outras técnicas estão sendo desenvolvidas para a avaliação da viremia, que, por ser intermitente, exige exame de amostras consecutivas para permitir um diagnóstico mais seguro. A coleta deve ser pareada com amostra da fase aguda e da fase de convalescença. Isso quer dizer que devem ser colhidas com 10 a 14 dias de intervalo. A presença de anticorpos heterófilos e de fator reumatóide pode levar a resultados falso-positivos dos anticorpos IgM. Nos casos neonatais, a transferência transplacentária pode também induzir a falsa positividade. As pesquisas geralmente se baseiam na presença de CMV (particularmente das inclusões virais). Aumentos significativos dos anticorpos IgG CMV específicos por IFI ou EIA sugerem, mas não comprovam, infecção aguda ou reativação de uma infecção por CMV. Anticorpos

de

baixa

avidez fazem a distinção entre a resposta imune primária e a reativação da infecção por CMV (caracterizada por alta avidez de IgG). O teste de avidez de anticorpos

é

um

procedimento

laboratorial que permite estimar o Microscopia

período aproximado em que ocorreu a infecção.

Eletrônica

mostrando Citomegalovírus Percentuais de avidez inferiores a 30% sugerem que a infecção ocorreu

há menos de dois meses. Percentagens superiores a 40% sugerem que a infecção ocorreu há mais de três meses e que os anticorpos IgM, caso presentes, são residuais e desprovidos de significado clínico. O achado de percentuais entre 30% e 40% é considerado indeterminado, já que não permite a definição do período provável da infecção. Quando a avaliação está sendo realizada em gestantes, o tempo de gestação deve ser levado em conta.


Anticorpos IgM específicos para CMV podem ser detectados em adultos por Enzima imunoensaio (EIA), em ambas as infecções de CMV nas infecções primárias, em cerca de 93 a 100% dos casos, e nas infecções reativadas, em aproximadamente 40% dos casos. Porém, a resposta de IgM pode estar reduzida ou ausente em pacientes imunocomprometidos com infecção ativa. A maioria dos pacientes de AIDS (95%) já é soropositivo para CMV antes de a infecção pelo HIV ser diagnosticada. Manifestações do sistema nervoso central e periférico causadas pela infecção por CMV são muito raras. Entretanto, nos casos de AIDS, comumente são diagnosticadas encefalites por CMV. Os índices dos anticorpos CMV podem ser usados para diferenciar síntese intratecal da infiltração da barreira hematoencefálica pelo CMV. Os métodos mais rápidos, sensíveis e específicos para diagnóstico de CMV são os de biologia molecular, a reação em cadeia da polimerase (PCR) e a captura híbrida, especialmente em neonatos infectados congenitamente, em amostras de medula óssea, análise de órgãos sólidos para transplante, pacientes imunocomprometidos, indivíduos imunocompetentes com infecção ativa e doadores de sangue. A evolução da PCR quantitativa para CMV tem mostrado que CMV DNA em liquor é mais elevado em pacientes com CMV relacionado à polirradiculopatia do que nos que sofrem de encefalites, e que a quantificação do CMV pode ser útil na monitoração da terapia antiviral. Sendo assim, os métodos moleculares para a detecção do vírus são importantes aliados para identificar os pacientes ao alto risco de desenvolvimento da doença. Nesse sentido, a qualificação da carga viral para o CMV pela técnica de reações em cadeia de polimerase ou pela captura híbrida permite a definição da viremia e a monitoração da terapêutica. 14. RUBÉOLA:

Causada por um vírus RNA do gênero Rubivirus, a rubéola continua a se manifestar na população, apesar das campanhas de vacinação, que conseguiram diminuir a incidência da doença. 191 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

É uma doença normalmente moderada, com complicações pouco freqüentes, que pode ser assintomática em cerca de 50% dos casos ou cursar com manifestações clínicas discretas. Entretanto, quando acomete gestantes suscetíveis, especialmente durante o primeiro trimestre e, com menor freqüência, no segundo trimestre de gravidez, pode levar ao aborto espontâneo ou à síndrome de rubéola congênita, com comprometimentos cardíacos, oculares, auditivos e do sistema nervoso fetal. Os riscos abortivos e teratogênicos da infecção em mulheres grávidas tornam de grande importância à investigação pré-natal de anticorpos contra o vírus da rubéola. O contágio ocorre por via respiratória, e o período de incubação, de 2 a 3 semanas, é seguido por sintomas virais e rash cutâneo maculopapular, com linfadenopatia suboccipital. Os anticorpos anti-rubéola são detectáveis logo após o desaparecimento do rash cutâneo. Os primeiros a aparecer são da classe IgM, detectáveis cerca de 4 a 5 semanas após a infecção (ou vacinação). Atualmente, métodos ultra-sensíveis possibilitam sua detecção por mais tempo (seis meses ou mais). A seguir, aparecem os da classe IgG, que, quer por infecção natural ou por vacinação, persistem pelo resto da vida. A infecção quase sempre confere

imunidade

Entretanto, ocorrer,

a

permanente.

reinfecção

especialmente

indivíduos

pode nos

vacinados,

apresentando

aumento

da

concentração de anticorpos da classe

IgG.

A

resposta

de

anticorpos da classe IgM está

Vírus da Rubéola Fonte : www.vietsciences.free.fr

tipicamente ausente ou baixa, mas pode acontecer, embora raramente, o que dificulta significativamente sua interpretação.


Anticorpos IgM são detectados por EIA em 100% dos pacientes entre 11 e 25 dias depois do exantema; em 60% a 80% dos indivíduos 15 a 25 dias após a vacinação, e em 90% a 97% das crianças com rubéola congênita, entre 2 semanas e 3 meses depois do nascimento. O anticorpo materno IgG, adquirido passivamente, desaparece após 6 a 7 meses. O feto não desenvolve IgM antes de 18 a 20 semanas de gestação. A imunidade ativa é raramente adquirida antes dos dois anos de idade. Nas investigações de possíveis infecções fetais e pós-natais, é necessário evitar reações falso-positivas para IgM pela presença de fator reumatóide, mononucleose infecciosa, infecção por parvovírus e citomegalovírus. Em alguns casos, as mulheres grávidas podem ser reativas para anticorpos IgM para rubéola, citomegalovírus, varicela-zoster e sarampo. Todos os resultados de IgM positivos devem ser confirmados por mais de um método em soros pareados e comparados com a história clínica detalhada. O diagnóstico laboratorial é realizado por técnicas imunoenzimáticas que avaliam e quantificam a presença de anticorpos IgM e IgG, com a finalidade de diferenciar entre infecção aguda, passada, congênita ou vacinação. As novas técnicas imunoenzimáticas eliminaram a possibilidade de resultados falso-positivos e falso-negativos. Pesquisam anticorpos IgG e IgM com maior sensibilidade, permitindo detecção mais precoce e efetiva por maior período de tempo. No entanto, a grande sensibilidade desses testes, ao tornar possível a detecção de anticorpos IgM, mesmo em níveis baixos, por longo período de tempo após a fase aguda, fez com que a presença de IgM não seja suficiente para o diagnóstico da doença em fase aguda. A presença de soroconversão é conclusiva de infecção aguda. A presença de anticorpos IgM indica infecção aguda. Porém, pode ser atribuída a níveis residuais de infecção passada ou reação pós-vacinação. Atualmente, para definir a fase da doença, dispomos da avaliação dos testes de avidez dos anticorpos IgG. Esses testes baseiam-se na característica de baixa avidez que os anticorpos apresentam pelo antígeno, durante o início da resposta imunológica. Portanto, na 193 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

infecção recente, estão presentes os anticorpos IgG de baixa avidez, e nas infecções mais antigas, encontramos os de alta avidez. Consideram-se de baixa avidez índices inferiores a 30%, que indicam que a infecção ocorreu nos últimos três meses. Índices superiores a 60% são considerados de alta avidez, apontando para uma infecção ocorrida há mais de três meses. Valores entre 30% e 60% não permitem a caracterização da fase da doença. 15. HERPES SIMPLEX:

A infecção pelos vírus Herpes simplex (HSV) está entre as infecções virais de maior prevalência na população mundial. Existem dois sorotipos diferenciados: HSV1 e HSV2. São vírus DNA, da família Herpetoviridae, e reagem cruzadamente, pois os sorotipos possuem em torno de 50% de homologia seqüencial. O desenvolvimento, nas últimas décadas, de técnicas sorológicas que identificam e diferenciam os sorotipos tem aumentado não só a possibilidade de diagnosticar e tratar as infecções como também de compreender melhor sua patogenia e meios de transmissão, em especial do herpes perinatal. A transmissão pode se dar pelo contato com superfícies mucosas infectadas por soluções de continuidade da pele e mucosas, relações sexuais e durante o parto. A disseminação do vírus ocorre pela migração centrífuga dos vírions através dos nervos sensoriais periféricos. Na porta de entrada, na derme e na epiderme, ocorre o processo de replicação, e as partículas virais são transportadas pela terminação nervosa retrogradamente ao núcleo dos neurônios sensórios. Conhece-se menos a sucessão de eventos a partir desse ponto. Em alguns casos, ocorre a infecção com a replicação viral e morte celular em nível mucocutâneo. Em outros, o vírus fica em estado de latência. O detalhamento dos mecanismos da persistência em latência do HSV e sua reativação periódica permanecem obscuros. O primeiro episódio de doença herpética, a primoinfecção, é normalmente acompanhado de sinais e sintomas envolvendo lesões mucosas e extramucosas. Apresenta longa duração dos sintomas e da permanência dos vírus na lesão e uma taxa maior de complicações do que os episódios de reagudização ou recorrentes. A 194 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

gengivoestomatite aguda é a manifestação mais comum das primoinfecções. É mais freqüente entre um e quatro anos de idade. O herpes labial e as úlceras de córnea são as infecções sintomáticas recorrentes mais freqüentes. As manifestações clínicas e a evolução da infecção dependem da idade, da localização, do estado imunológico do paciente e do tipo antigênico do vírus. Exposição ao sol (luz ultravioleta), imunossupressão e traumas cutâneos ou do gânglio podem levar à reativação. Ocasionalmente, múltiplas linhagens do mesmo subtipo viral são detectadas em um mesmo paciente, principalmente os imunossuprimidos. Esse fato sugere a possibilidade de infecção exógena por diferentes linhagens de um mesmo subtipo. A infecção pelo tipo 1 é, freqüentemente, adquirida mais cedo do que a do tipo 2. Cerca de 90% dos adultos

apresenta

anticorpos

contra

HSV1 em torno dos 50 anos de idade. Nas

populações

socioeconômicas

desfavorecidas, a faixa etária decresce para 30 anos.

Herpes Vírus Fonte: www.kcom.edu

Os anticorpos contra o tipo 2 não são rotineiramente detectados até a puberdade. As taxas de prevalência desses anticorpos correlacionam-se com a fase de vida sexual ativa, o que distingue um grupo de outro. O percentual aumentou 30 pontos nos últimos 12 anos nos Estados Unidos. Numa avaliação obstétrica, 25% da população investigada tinham anticorpo positivo; entretanto, apenas 10% relatavam história de lesão genital. Cerca de 50% dos adultos heterossexuais, com vida sexual ativa, apresenta anticorpos positivos, sendo a taxa 5% maior entre as mulheres. O HSV tipo 1 está associado a uma variedade de infecções envolvendo lesões

mucocutâneas

orolabiais,

oftálmicas,

meningoencefálicas,

podendo

eventualmente causar lesões viscerais e genitais, enquanto o HSV tipo 2 (HSV2) normalmente causa as infecções genitais sexualmente adquiridas. Ambos os tipos podem causar lesões nas diferentes localizações, e a infecção clínica é indistinguível. 195 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

Tanto o HSV1 como o HSV2 pode ser responsável por lesões mucocutâneas primárias em qualquer localização. A duração e a intensidade da infecção independem do sorotipo envolvido. Entretanto, o tipo de vírus e a localização da primoinfecção irão afetar a freqüência e a probabilidade de recidiva. Estudos recentes demonstram que tanto a freqüência quanto à probabilidade são maiores quando a infecção é causada pelo HSV2. A infecção genital por HSV2 ocorre com freqüência oito a dez vezes maiores que a infecção genital por HSV1. Por outro lado, a infecção oral-labial por HSV1 ocorre mais freqüentemente do que a infecção oral-labial por HSV2. A probabilidade de reativação da infecção causada pelo HSV2 é duas vezes maior. Em indivíduos imunocompetentes, a infecção limita-se às localizações mucocutâneas e ao gânglio sensorial. Em indivíduos imunossuprimidos, as lesões causadas tanto pela primoinfecção quanto pelas reativações tendem a ser mais extensas e a persistir por muito mais tempo do que nos indivíduos imunocompetentes. Nesses pacientes, o quadro é grave, geralmente com comprometimento esofagiano, pneumonite intersticial e doença disseminada com comprometimento visceral. A infecção pelo HSV2 é do tipo infecção oportunista importante em indivíduos infectados pelo HIV. Calcula-se que até 90% desses são co-infectados com HSV2. Em um pequeno número de casos, a infecção pelo HSV leva a encefalite viral e a um dano neurológico severo. O HSV, principalmente o tipo 1, pode causar encefalite em adultos pela reativação de infecção latente. As infecções mais agressivas, com risco de vida, são a perinatal e as que ocorrem em indivíduos imunocomprometidos, incluindo pacientes com AIDS. Existem dados que demonstram que os pacientes que apresentam episódio primário intenso e não-tratado têm índices mais elevados de recorrência em longo prazo. A resposta imune, humoral e celular manifestam-se nas primeiras semanas e persistem por toda a vida. Embora não possuam caráter imunizante, induzem manifestações mais brandas e apresentam reação cruzada entre os dois subtipos. A sorologia permite a identificação de anticorpos IgM e IgG de forma 196 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

qualitativa. A avaliação deve ser realizada em sorologia pareada para melhor interpretação dos resultados. O isolamento viral em cultura de tecidos era o método de escolha para o diagnóstico e tipagem do HSV. O HSV pode ser detectado em cultura depois de 2 a 8 dias, mas, em vários casos, como nos de baixos títulos virais, cura das lesões ou lesões atípicas, o vírus não pode ser isolado. A sensibilidade do isolamento do HSV em cultura de tecido é de aproximadamente 105 vírions por mL. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é o método de escolha para o diagnóstico da infecção por HSV. É altamente sensível (até cinco vírions por ensaio), específica (98-100%), e pode identificar o genótipo e a quantificação viral. A PCR quantitativa pode ser útil para monitorar a resposta à terapia antiviral. Os ensaios mais comumente usados para distinguir o tipo 1 do tipo 2 são os que utilizam a avaliação da presença de anticorpos contra glicoproteínas do HSV1 (gG1) e do HSV2 (gG2). Além disso, o ensaio realizado por PCR permite o diagnóstico utilizandose diferentes materiais como sangue, liquor, líquido amniótico, vilosidades coriônicas e sangue fetal. O líquido amniótico poderá ser coletado a partir da 12ª semana até o final da gestação. Porém, o período ideal para a coleta situa-se entre a 14ª e a 16ª semana. O período ideal para a coleta de vilos trofoblásticos situa-se entre a 10ª e a 12ª semana de gestação. No entanto, esse prazo poderá estender-se até a 14ª semana. O período ideal para a coleta do sangue fetal situa-se entre a 18ª e a 22ª semana de gestação. 16. HEPATITES:

A hepatite é um termo geral que significa inflamação no fígado e o termo Hepatite Viral consiste em doença inflamatória, com quadro clínico infeccioso. São conhecidos vários tipos de vírus hepatotrópicos, com características físico-químicas e epidemiológicas próprias para cada tipo e subtipos. As infecções desenvolvem-se de forma transitória ou persistente, favorecendo a evolução para a infecção aguda autolimitada, estado de portador crônico assintomático e doença crônica. Observamos,

com

freqüência,

o

desenvolvimento

clínico

associado

às


manifestações sistêmicas, semelhantes àquelas observadas em diferentes infecções, não permitindo, dessa forma, um diagnóstico etiológico preciso. Os principais agentes virais hepatotrópicos causadores de hepatite são designados como: vírus da hepatite A (HAV); vírus da hepatite B (HBV); vírus da hepatite C (HCV); vírus da hepatite Delta (HDV); vírus da hepatite E (HEV) e vírus GBV-C (HGV). Cada um apresenta características estruturais e genômicas que permitem diferenciá-los, detectadas por diferentes metodologias laboratoriais com sensibilidade e especificidade definidas. Infecções persistentes causadas por HBV, HCV e HDV estão sempre associadas à doença hepática crônica, podendo evoluir para a cirrose e o hepatocarcinoma. 16.1 Hepatite A:

O vírus da hepatite A (HAV) classifica-se na família Picornaviridae e é transmitido por via fecal-oral, determinando formas esporádicas e epidêmicas de hepatite aguda. Água e alimentos contaminados constituem as vias mais comuns em surtos epidêmicos. O período de incubação da doença é de quatro semanas, com evolução clínica de forma branda a moderada e ausência de formas crônicas. A hepatite fulminante é descrita em 0,2 a 0,7% dos indivíduos infectados. Em

crianças

na

faixa etária de 1 a 10 anos, a hepatite A

geralmente

assintomática.

é A

anictérica presença

e da

imunoglobulina M específica (IgM antiHAV) no sangue é quase sempre concomitante ao período sintomático da hepatite aguda. Títulos elevados, obtidos por metodologias de diluições seriadas ou por comparação aos valores

limites

(cut

off),

Vírus da Hepatite A Fonte: CDC - FioCruz

são 198


detectados na fase aguda e no início da convalescença. Títulos menores são detectados 3 a 4 meses após o acometimento da doença e podem persistir por mais de 6 meses, em 20 a 30% dos indivíduos, e até por 1 ano em 5 a 10%. Nos casos em que os sintomas precedem por poucos dias a detecção de IgM anti-HAV, recomenda-se a sorologia pareada. A segunda coleta, feita após 15 a 20 dias, é útil para a confirmação do resultado reativo, definindo o laudo de positividade. Os métodos atuais para a pesquisa em soro e plasma permitem a detecção qualitativa e, eventualmente, um cálculo estimado, semiquantitativo, pela análise comparativa da reatividade do teste com o valor limite (cut off). Anticorpos da classe IgG anti-HAV permitem a definição de infecção passada. Resultados de soroconversão, traduzidos por anticorpos IgG não-reativos em uma primeira análise e reativos na segunda coleta, com intervalos de 20 a 30 dias, estão associados a infecção recente. A resposta imune aos diferentes antígenos estruturais, proteínas do capsídeo viral, VP0, VP1 e VP3, ocorrem a partir da quarta semana após a infecção, com títulos máximos de anticorpos após há sétima semana. A pesquisa do RNA-HAV em soro, plasma e suspensão fecal é um método pouco utilizado, embora permita a detecção do genoma viral a partir do segundo dia após a infecção, podendo prolongar-se até o 25o dia. A metodologia de PCR pode detectar períodos mais longos de viremia (várias semanas), em concentrações elevadas, de 104 a 106 partículas virais/mL de sangue. A heterogeneidade de seqüências genômicas de isolados virais obtidos em diferentes partes do mundo definiu, até o momento, 7 genótipos e 1 sorotipo de HAV.


16.2 Hepatite B:

O vírus da hepatite B (HBV) pertence à família Hepadnaviridae e apresenta três formas distintas: partículas defectivas esféricas, tubulares e o vírion, constituído de envoltório (antígeno de superfície do vírus da hepatite B - HBsAg), nucleocapsídeo (antígeno do core - HBcAg e antígeno e - HBeAg), DNA de cadeia dupla parcial e a enzima polimerase. A transmissão ocorre por via parenteral, com a presença obrigatória de sangue ou derivados. A transmissão sexual é eficaz, da mesma forma que a materno-fetal, sendo a eficácia definida pelo grau de replicação viral ou pela quantidade de vírions, avaliada pela concentração de DNA-HBV (carga viral) no sangue. O HBV é detectado em sangue, saliva, leite materno, secreções vaginais, sêmen e líquido ascítico. A transmissão diminuído

homossexual como

conseqüência

tem da

conscientização e das ações efetuadas para controlar a epidemia de AIDS. A transmissão heterossexual responde

Vírus da Hepatite B

por mais de um terço dos casos novos

Fonte: www.nih.go.jp

nos EUA. A taxa de portadores do HBV varia grandemente no mundo. A taxa global nos EUA é 0,3%; em partes da África, Filipinas, e Ásia, alcança 20%. O risco de adquirir HBV após acidente com agulhas contaminadas varia de 20%, nos casos em que o paciente era HBsAg-positivo, a 66%, quando o paciente era HBsAg e HBeAg-positivo. Estima-se a existência mundial de 300 milhões de portadores crônicos do vírus da hepatite B (HBV). A história natural de infecção aguda por HBV varia de acordo com a idade do paciente e o tempo de infecção. Em adultos, 95% dos casos evoluem com graus variados de gravidade da doença aguda, havendo resolução 200 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

espontânea na maioria. Cerca de 5% de adultos e 90% de neonatos infectados desenvolvem hepatites crônicas. O período de incubação para HBV varia de 45 a 180 dias. As características clínicas da doença variam consideravelmente. A icterícia acontece em menos de 10% dos casos em crianças abaixo de cinco anos de idade. Porém, a icterícia se manifesta em 50% de crianças mais velhas e em adultos. Os sintomas incluem anorexia, náusea, vômitos, queixas gripais e fadiga. Achados físicos variam de anormalidades inespecíficas mínimas a icterícia e hepatomegalia e, ocasionalmente,

características

extra-hepáticas

que

refletem

fenômenos

imunológicos, como vasculites, nefrites por imunocomplexos, artrites e poliarterite nodosa. A maioria dos adultos com infecção por HBV aguda apresenta recuperação total, e cerca de 5%, especialmente os homens, desenvolvem infecção crônica, que é freqüentemente assintomática. Dez a 20% desses pacientes podem progredir para cirrose ou câncer hepático. Três fases de replicação viral acontecem durante o curso da infecção por HBV, especialmente em pacientes com hepatites crônicas. Fase de Alta Replicação: Está associada à presença de HBsAg, HBeAg e HBV DNA. Ocorrem aumentos nas aminotransferases, e, histologicamente, comprova-se a atividade inflamatória moderada. O risco de evolução para cirrose é alto. Fase de Baixa Replicação: Associada à perda do HBeAg, a diminuição ou a não-detecção de concentrações de DNA-HBV. A soroconversão, com aparecimento de anti-HBe, pode indicar diminuição da atividade inflamatória, uma vez que indica diminuição da replicação viral. Fase

Não-Replicante:

Associada

à

ausência,

a

concentrações

indetectáveis ou só detectáveis por meio de técnicas ultra-sensíveis de marcadores de replicação viral, a inflamação apresenta-se diminuída, e os achados histológicos não são significativos. O aumento das aminotransferases, especialmente da ALT (TGP), durante a hepatite aguda B, varia de um aumento médio a moderado a um aumento notável, 201 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

superior a 100 vezes o valor da normalidade. As concentrações de ALT são normalmente mais altas que as de AST. A concentração de bilirrubina sobe na maioria dos pacientes com infecção aguda. A icterícia clínica manifesta-se em 50% de adultos com concentrações de bilirrubina de 3,0 mg/dL. Concentrações maiores podem acontecer. Uma elevação leve da fosfatase alcalina também é evidente. Em pacientes que desenvolvem insuficiência hepática fulminante, uma queda rápida em ALT e AST (TGO) pode levar à conclusão errônea de que a infecção hepática está se resolvendo, quando, na realidade há perda de hepatócitos. Aumentos nas concentrações de aminotransferases durante mais de seis meses são indicativos de evolução para a hepatite crônica. O HBV pode determinar uma variedade de doenças hepáticas, incluindo infecção aguda autolimitada, hepatite fulminante, hepatite crônica com progressão para cirrose e falência hepática, hepatocarcinoma e estado de portador crônico assintomático. Sistemas de antígenos e anticorpos específicos são definidos como marcadores biológicos e sorológicos do HBV e podem ser detectados por testes laboratoriais sorológicos que apresentam alta sensibilidade e especificidade. O HBsAg e a IgM anti-HBc são os principais marcadores em processos de infecção aguda, embora a IgM anti-HBc possa permanecer reativa por alguns meses, em determinados indivíduos, após essa fase. O HBsAg pode ser detectado em soro e plasma, em períodos de 3 a 13 semanas após o início da infecção, dependendo da carga viral à qual o indivíduo foi exposto. A concentração máxima anterior ao desenvolvimento dos sintomas pode ser definida por alguns métodos quantitativos ou estimada por métodos semiquantitativos, quando comparada ao valor limite da reação (cut off). Estima-se que de 5 a 10% dos indivíduos infectados apresentem a IgM anti-HBc como único marcador de infecção aguda. Outro antígeno estrutural, HBeAg, deve ser pesquisado sempre após a confirmação do marcador HBsAg. A detecção do antígeno, que pode ocorrer antes do desenvolvimento dos sintomas, define o grau de infectividade e de replicação viral. A soroconversão para anti-HBe ocorre durante as 5 primeiras semanas da doença, definindo a diminuição da replicação viral e, conseqüentemente, do grau de infectividade. 202 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

A persistência do HBsAg, em concentrações elevadas, da ordem de dez a cem vezes o valor limite, e a presença do HBeAg em análises seriadas, por períodos de até 4 meses, associam-se à evolução para a infecção crônica. Anticorpos contra o HBcAg, da classe IgG, são detectados de 12 a 20 dias após a fase aguda da doença, persistindo por muitos anos. Esses anticorpos podem indicar infecção passada, na ausência de HBsAg, ou infecção crônica, quando associados ao antígeno de superfície. Alguns

estudos

demonstram a presença de IgG anti-HBc como único marcador em até 10% dos indivíduos. Esse

resultado

diferentes

apresenta

significados

que

devem ser analisados para determinadas situações: -

Baixas

concentrações de IgG anti-HBc,

Evolução dos marcadores do HBV

geralmente

durante uma infecção

inferiores

a

10

vezes o valor limite, sugerem infecção

passada

sem

replicação viral; - Altas concentrações de IgG anti-HBc, superiores a 10 vezes o valor limite, sugerem infecção passada com replicação viral indetectável, sendo necessário, nesses casos, o acompanhamento por meio da pesquisa do DNA HBV por PCR qualitativo; - Valores de IgG anti-HBc próximos ao valor limite sugerem reatividade inespecífica. Em todos os casos mencionados, deve-se avaliar a necessidade de análises em novas coletas, utilizando-se metodologias de diferentes procedências. A complementação dos resultados, por meio da análise do HBeAg e anti-HBe, deve ser realizada. Porém, a ausência do antígeno nem sempre está associada à 203 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

diminuição da replicação viral. A não-detecção do HBeAg em portadores com elevada replicação viral é possível e associa-se às mutações do DNA HBV na região do pré-core/core. A detecção do DNA HBV em soro, plasma e tecido hepático auxilia na definição da replicação viral efetiva (indivíduos HBsAg-negativo) e no diagnóstico precoce (crianças nascidas de mães HBsAg-positivo). Após a detecção qualitativa, recomenda-se a análise quantitativa da carga viral (DNA HBV). Essa avaliação apresenta sensibilidade superior a 70% quando comparada à detecção do HBeAg, sendo indicada para a monitorização do tratamento. A pesquisa de anticorpos específicos para o HBsAg é indicada para definir a fase de convalescença e redução drástica da replicação viral, sugerindo imunidade. A recomendação para o diagnóstico laboratorial é a análise de pelo menos duas amostras de material biológico, soro ou plasma, em períodos diferentes, seguindo metodologias tradicionais. 16.3 HEPATITE C:

O vírus da hepatite C (HCV) é classificado na família Flaviviridae. Apresenta RNA de cadeia simples, polaridade positiva, com cerca de 9.400 nucleotídeos. Até sua identificação e caracterização em 1989, por Choo e colaboradores, os casos clínicos não-diagnosticados sorologicamente para os vírus das hepatites A e B ou outros vírus hepatotrópicos conhecidos (Epstein-Barr, febre amarela, citomegalovírus, vírus da hepatite delta) eram rotulados como hepatite por vírus não-A não-B. Sabe-se, atualmente, que o HCV é o principal agente etiológico, responsável por 90 a 95% dos casos de hepatite pós-transfusional não-A não-B. A transmissão ocorre por via parenteral, por intermédio do sangue e derivados, pela utilização de agulhas e seringas contaminadas e transplantes de órgãos e tecidos. A transmissão sexual tem sido relatada, embora seja pouco freqüente. Ocorrências esporádicas, sem história prévia de transfusão ou outra causa aparente, representam cerca de 40% dos casos de hepatite C. 204 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

A

infecção

pelo

HCV

assemelha-se à causada pelo vírus B, e os sintomas iniciais da doença são inespecíficos e/ou gastrointestinais, seguindo-se a icterícia. Os níveis de alanina aminotransferase apresentam flutuações, com valores inferiores aos observados nas hepatites A e B. O curso clínico da hepatite C é menos severo que o da B, porém a evolução

Vírus da Hepatite C

para a forma crônica da doença ocorre

Fonte: www.nih.go.jp

em 50% dos pacientes infectados pelo vírus C, em comparação aos 5 a 10% dos casos de indivíduos infectados pelo vírus B. A detecção de anticorpos contra o HCV, em amostras de soro de pacientes infectados, pode ser feita por ensaios imunológicos específicos. Porém, esses anticorpos refletem a exposição prévia ao agente infeccioso e não podem ser considerados marcadores da infecção atual. Não estão, ainda, disponíveis métodos imunológicos diretos para a detecção de antígenos virais e métodos de cultura celular para o isolamento viral. A quantificação dos níveis de alanina aminotransferase, associada à sorologia, é utilizada como indicador auxiliar na avaliação da infecção pelo HCV, porém não constitui medida direta da viremia. A reação em cadeia da polimerase (PCR), pela amplificação exponencial do ácido nucleico viral, permite a detecção e a quantificação em amostras de soro ou plasma,

constituindo-se

em

medida

direta

para

avaliação

da

viremia.

A capacidade de detectar e de quantificar a carga viral é altamente desejável e será especificamente requerida nas seguintes condições: estabelecer o agente etiológico em casos de infecção aguda, quando ensaios imunodiagnósticos são negativos; identificação de indivíduos assintomáticos; monitorização da viremia em casos crônicos, com propósitos prognósticos ou quando o imunodiagnóstico resulta em 205 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

dados inconsistentes; identificação de pacientes crônicos com elevada carga viral, que possuem, portanto, alto risco de desenvolvimento do carcinoma hepatocelular; monitorização da terapia antiviral; detecção do HCV em indivíduos anti-HCV positivos que tenham desenvolvido auto-anticorpos; detecção do HCV em doadores e receptores de transplantes hepáticos; avaliação da transmissão vertical do HCV. As técnicas de rT-PCR e PCR são utilizadas para a detecção e a quantificação do RNA viral ou do DNA pró-viral integrado ao genoma da célula hospedeira, em amostras de soro ou plasma, tecido hepático e células do sangue periférico. Rotineiramente, o método da rT-PCR é utilizado com boa sensibilidade e especificidade como teste qualitativo e quantitativo em análises de soro ou plasma. A metodologia utilizada permite a amplificação em quantidade do genoma viral (RNA-HCV). Estudos têm demonstrado que reações contendo 10 ou mais cópias de RNA-HCV são positivas. Esse valor é equivalente a 2.000 cópias de RNA-HCV por mililitro de soro ou plasma. A genotipagem para HCV é obtida com a utilização de métodos em biologia molecular e de seqüenciamento genômico, os quais são úteis para definir os genótipos e subtipos para estudos de epidemiologia molecular, estudo clínico e monitoramento da hepatite C. 16.4 Hepatite D:

O vírus da hepatite Delta (HDV), as co-infecções pelos vírus da hepatite B (HBV) e HDV e as superinfecções por HDV em portadores do HBV podem ocorrer em indivíduos procedentes de áreas endêmicas. A presença (infecção aguda) ou a ausência (infecção crônica) de IgM anti-HDV deverá estar sempre associada a IgM anti-HBc ou a IgG anti-HBc, respectivamente. Baixas concentrações de HDAg podem ser detectadas na fase aguda, e anticorpos IgG anti-HDV, na fase crônica. A co-infecção HBV-HDV é diagnosticada pela detecção transitória, e em baixas concentrações, de anticorpos específicos para o HDV, principalmente da classe IgM, que poderão apresentar-se como os únicos marcadores da infecção no período de declínio de HDAg e desenvolvimento de anticorpos IgG. A presença constante de 206 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

HBsAg e de IgG anti-HDV, em altos títulos, indica evolução para a infecção crônica, com detecção e quantificação do RNA HDV em soro ou plasma e detecção do HDAg em tecido hepático. Testes específicos são desenvolvidos para a detecção do HDAg e RNA HDV no soro, complementados pela maior sensibilidade do teste para IgM anti-HDV. A monitorização do tratamento deve ser feita por testes quantitativos, que permitem a detecção mínima de 10 cópias do genoma viral. O HDV apresenta diferentes genótipos: I, II e III, sem haver, entretanto, correlação definida com a evolução clínica. 16.5 Hepatite E:

O vírus da hepatite E (HEV) é um dos agentes etiológicos de hepatites agudas por veiculação hídrica. São descritos casos de evolução aguda e fulminante. Partículas de HEV podem ser detectadas em suspensões fecais, na fase aguda da doença, por métodos aplicados à pesquisa. Anticorpos IgM e IgA são detectados em soro e plasma, por metodologias tradicionais, demonstrando percentuais variados de grupos populacionais com infecção aguda. Anticorpos IgG específicos para HEV apresentam-se em altos títulos na fase aguda da doença, posteriormente ao declínio de IgM. O RNA HEV pode ser detectado por PCR em soro, plasma ou suspensão fecal até 40 a 50 dias após o início da doença, durante a fase aguda. A detecção no material fecal é, entretanto, menos freqüente (até 70%) do que nos outros materiais biológicos (93%). 16.6 Hepatite G:

A hepatite viral é causada por diversos agentes, com seu próprio modo de transmissão e replicação, e as doenças causadas por esses vírus diferem significativamente em relação à severidade do dano hepático. Entretanto, várias evidências laboratoriais e epidemiológicas têm sugerido a existência de agentes adicionais, que podem ser transmitidos por via parenteral. Cerca de 10 a 20% de casos de doença hepática é de etiologia desconhecida. Um agente em potencial 207 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

está associado ao soro de um cirurgião (com as iniciais "GB"), que havia desenvolvido hepatite aguda sem história epidemiológica conhecida. Estudos experimentais de Deinhardt e cols. (1967) de inoculação em primatas (Saguinus sp.) com o soro desse indivíduo mostraram que o material induziu hepatite nos animais, e o agente envolvido é mencionado como agente GB. Experimentos adicionais de passagem em cultura de células levaram à caracterização de GB como agente viral. Entretanto, a variação de hospedeiros primatas e experimentos cross-challenge sugeria que o agente GB era distinto dos vírus das hepatites atualmente conhecidos, em humanos. Além disso, anticorpos específicos aos vírus das hepatites A, B, C, E não eram induzidos pela inoculação de GB em macacos, como não eram detectados em imunoensaios. Foi descrita a clonagem molecular de dois genomas, com características semelhantes à flavivirus de macacos experimentalmente infectados. Esses genomas representam dois vírus independentes: GB-vírus A (GBV-A) e GB-vírus B (GBV-B). Têm sido descritos estudos de PCR para a detecção de GBV-A e GBV-B RNA e o uso de imunoensaios para anticorpos específicos aos antígenos codificados pelos genomas dos agentes GB. Os genomas de GBV-A e GBV-B apresentam semelhança limitada na seqüência de nucleotídeos entre si (27%) e com o vírus da hepatite C (28%), nas regiões NS3 (helicase) e NS5B (RNA-polimerase dependente de RNA). Os seus genomas apresentam respectivamente 9.493 e 9.143 nucleotídeos. Os genomas desses agentes estão organizados de forma bastante semelhante à pestivírus e flavivírus, com genes codificando proteínas estruturais e não-estruturais em terminações 5' e 3', respectivamente. O grau de divergência na seqüência entre GBV-A e GBV-B e outros membros da família Flaviviridae demonstra que os agentes GB representam dois novos gêneros nessa família. Um terceiro agente viral, recentemente notificado, foi identificado no soro de vários pacientes com hepatite criptogênica (não A-E). Devido ao alto grau de identidade com GBV-A (59% em nível de nucleotídeos e 64% em nível de aminoácidos), esse vírus foi chamado GB-vírus C (GBV-C). Análises filogenéticas 208 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

demonstraram que o GBV-C é um membro adicional dos Flaviviridae, distinto do grupo HCV e mais intimamente relacionado ao GBV-A. A transmissão do HGV por meio de transfusões de sangue e por outras vias de exposição parenteral, tais como em usuários de drogas injetáveis, tem sido claramente estabelecida. A partir daí, conclui-se que vários pacientes HGV-positivo tenham sido co-infectados com HBV ou HCV, provavelmente devido aos fatores de risco compartilhados da infecção. O rastreamento das doações de sangue para esses vírus também elimina as unidades de sangue infectadas por HGV, reduzindo dessa forma a incidência de hepatite pós-transfusional relacionada ao HGV. Estudos demonstram que a infecção por HGV está associada à hepatite na maioria dos pacientes investigados. Há também pacientes com níveis normais de transaminases que requerem estudos adicionais de seqüenciamento para determinar se são portadores ou pacientes em estado quiescente da doença. A associação do vírus com a doença hepática crônica e sua presença em pacientes com dupla infecção por HBV ou HCV é irrefutável. Entretanto, sua associação e potencial envolvimento na hepatite fulminante e carcinoma hepatocelular ainda estão sendo investigados. Estudos retrospectivos evidenciaram os seguintes pontos: - a doença relacionada ao HGV é geralmente branda, com níveis pouco elevados de ALT (TGP); - a infecção por HGV pode ser persistente e acompanhada de hepatite crônica; - as infecções por HCV/HGV e HBV/HGV podem ocorrer simultaneamente e resultam em co-infecções persistentes; - a prevalência de HGV em doadores de sangue é maior do que HCV e não se relaciona aos níveis de ALT presentes nos doadores; - nas infecções duplas, os níveis de ALT são maiores e mais freqüentemente aumentados; - indivíduos com infecções duplas crônicas podem apresentar severa necroinflamação hepática; - 6% e 10% de indivíduos cronicamente infectados por HBV e HCV apresentam, respectivamente, positividade para HGV. 209 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

16.7 Hepatite p or TTV:

Partículas semelhantes à vírions são observadas com freqüência em amostras biológicas humanas sem, necessariamente, apresentarem correlação com alguma patologia. Recentemente, uma dessas observações, originada de um trabalho de pesquisa no Japão, por Nishizawa e colaboradores, originou o chamado Transmited Transfusion Virus (TTV), caracterizado como uma partícula semelhante a vírus, extraída de um paciente com doença hepática crônica, adquirida, provavelmente, após transfusão sangüínea. O TTV, vírus associado à hepatite pós-transfusional não A-não G, apresenta estrutura genômica formada por DNA de simples cadeia e duas Open Reading Frame (ORF), sugerindo relações filogenéticas com outros vírus da família Circiniviridae e originando dois grupos genéticos com 16 genótipos distintos. A replicação do TTV parece ocorrer em hepatócitos, onde foram detectados

DNA

por

métodos

moleculares.

Novas

metodologias

foram

desenvolvidas, com diferentes sensibilidades, permitindo determinar altas prevalências de DNA-TTV em sangue de doadores sem doença hepática aparente e em pacientes com hepatites associadas a outras etiologias virais - HCV e HBV, não havendo evidências de interferências na evolução da doença hepática por essas coinfecções. A via de transmissão parenteral parece ser a mais eficiente. Por outro lado, dados epidemiológicos de alta prevalência em países como Escócia (1,9%) e Japão (12%) sugerem a possibilidade de vias alternativas de transmissão. A detecção de DNA-TTV em amostras de fezes coletadas de pacientes com hepatite aguda e crônica demonstra a possibilidade de transmissão fecal-oral. No Brasil, alguns dados demonstram a prevalência de DNA-TTV em 62% dos indivíduos de uma casuística de 72 doadores de sangue e em 10% da população geral. No Japão, 12% dos doadores de sangue avaliados apresentaram DNATTV detectável, 47%, hepatites fulminantes não-A-G, 46%, hepatopatias crônicas de 210 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

etiologia desconhecida, 39%, carcinoma hepatocelular e 48%, cirroses. Embora a detecção de DNA-TTV tenha sido feita em tecidos hepáticos, não há confirmação de sua patogenicidade para o fígado. Estudos vêm sendo desenvolvidos para a definição de um novo agente hepatotrópico. 17. Marcadores Tumor ais:

O marcador tumoral perfeito seria aquele que fosse produzido somente por um tecido e secretado em quantidades mensuráveis em fluidos corpóreos, só estaria positivo na presença de uma neoplasia maligna e deveria ser capaz de identificá-la antes de sua expansão além do seu local de origem. Seus níveis séricos deveriam refletir o tamanho do tumor, permitir caracterizar seu tipo e estadiamento e refletir respostas ao tratamento e à progressão da doença. Esse marcador tumoral perfeito ainda não existe. Se existisse, poderia ser usado como triagem para a presença da neoplasia oculta em indivíduos assintomáticos, permitindo o diagnóstico e o tratamento precoce. Na prática, a maioria dos marcadores tumorais é achada em baixas concentrações em indivíduos normais e em quantidades mais altas durante processos inflamatórios e outras condições malignas e não-malignas. Por isso, seu papel mais importante não está no diagnóstico da neoplasia, e sim como um cofator, orientador e confirmatório, do diagnóstico, com um papel definido na avaliação das recidivas, na resposta à terapia e na avaliação do prognóstico de evolução do tumor. Os marcadores tumorais são divididos em cinco categorias: Enzimas e proteínas; Glicoproteínas; Glicoproteínas mucinas; Hormônios e Moléculas do sistema imune; 17.1 Enzimas e Proteínas:

A NSE (enolase neurônio-específica), na sua forma gama, está elevada nos soros dos pacientes com neuroblastoma, carcinoma pulmonar de pequenas 211 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

células, melanoma, carcinoma de células da ilhota pancreática e hipernefroma. No neuroblastoma, o NSE se correlaciona com o prognóstico, mas não é útil para o acompanhamento das recidivas. O uso primário de NSE está no carcinoma pulmonar de pequenas células. Cerca de 70% desses pacientes apresenta níveis altos de NSE. O NSE pode ser usado para monitorar os efeitos da terapia e a avaliação de recaídas antes das evidências clínicas. Elevações da desidrogenase láctica são notáveis em quase todas as malignidades. Os valores encontrados na neoplasia se sobrepõem com valores em doenças benignas. Não tem nenhum valor como um marcador tumoral de triagem, entretanto, tem utilidade limitada na monitorização da terapia em malignidades hematológicas. São encontrados níveis extremamente altos nos casos de leucemias em crianças e nos casos de linfoma não-Hodgkin nos qual o tratamento fracassou. Os níveis de ferritina podem elevar-se em neoplasias, especialmente na doença de Hodgkin, nas leucemias agudas, nos carcinomas de mama, fígado, pulmão, cólon e reto, em tumores de próstata e testículos e no mieloma múltiplo. São úteis na monitorização da evolução da doença. Os níveis de fosfatase alcalina são úteis em neoplasias para avaliar a presença de metástases envolvendo fígado e osso. Valores muito elevados são vistos em pacientes com lesões osteoblásticas, como as encontradas no carcinoma de próstata com metástase óssea. Elevações menores são vistas quando as lesões são osteolíticas, como as encontradas no carcinoma metastático de mama. Outras condições malignas com infiltração hepática como leucemias, linfomas e sarcoma podem cursar também com elevação da fosfatase alcalina. Sua elevação pode ocorrer também pela presença de isoformas patológicas. Os níveis de fosfatase ácida podem estar alterados em pacientes com carcinoma de próstata. Os que se encontram confinados dentro da cápsula normalmente apresentam níveis normais; já nos casos com metástases, mais da metade dos pacientes apresenta níveis elevados. Níveis alterados podem ser observados em pacientes com hipertrofia benigna de próstata, retenção urinária de monta e após manipulação prostática. A fração não-prostática encontra-se elevada em condições em que existe um hipermetabolismo ósseo, como nas metástases 212 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

ósseas no câncer de mama, pulmão, tireóide, mielomas e em situações de grande destruição de eritrócitos e de plaquetas em patologias hematológicas malignas. 17.2 GLICOPROTEÍNAS:

As glicoproteínas são marcadores tumorais derivados de tecido fetal ou placentário, encontrados em pequenas quantidades no tecido de adulto normal. Portanto, esses marcadores não são específicos para nenhum tumor. Exemplos de marcadores tumorais dessa classe são: antígeno carcinoembrionário (CEA), alfafetoproteína (AFP), gonadotrofina coriônica humana, (HCG), antígeno polipeptídio tecidual (TPA), antígeno do carcinoma de células escamosas (SCC-A) e antígeno prostático específico (PSA). O CEA foi primeiro identificado em 1965 em extratos de carcinoma de cólon humano e em células de cólon fetais. Ele existe em baixos níveis na mucosa do cólon normal, pulmão e tecido da mama, e é achado no soro associado com várias malignidades. É usado especialmente no monitoramento de tumores gastrointestinais, particularmente no câncer de colorretal. Cerca de 63% de pacientes com câncer de colorretal têm elevações de CEA. Quando presente, o CEA se correlaciona histologicamente e com a fase do tumor. Níveis pré-operatórios muito altos são prognósticos de altas taxas de retorno e baixas taxas de sobrevivência. Se o tumor secreta CEA, este pode ser usado para monitorar a eficácia da remoção cirúrgica do tumor, bem como para monitorar a recidiva da doença. Sua avaliação não é recomendada para screening por causa da incidência de elevação de CEA em outras doenças inflamatórias. A AFP é a principal glicoproteína plasmática precoce do feto humano. Encontra-se elevada no soro fetal, no soro materno e no soro de adultos com hepatomas e teratoblastomas testiculares. Nem todos os hepatomas ou teratoblastomas produzem AFP, mas, se sintetizam, o fazem em grandes quantidades. Nem sempre as elevações de AFP estão associadas à malignidade; os níveis podem estar elevados em doenças inflamatórias do fígado e intestino. É inútil como screening por causa das significativas elevações em condições benignas.


O HCG é secretado através do sinciciotrofoblasto placentário. A cadeia alfa dessa molécula compartilha seqüência homóloga com hormônio luteinizinante (LH), mas a cadeia beta é única. O beta-HCG é normalmente encontrado no soro e na urina durante a gravidez. Porém, pode também estar presente em 10% dos pacientes com doença inflamatória intestinal benigna, úlcera duodenal e cirrose hepática. Além disso, o beta-HCG é achado em quase 100% dos pacientes com tumores trofoblásticos e em 10% a 40% de tumores de células não-germinativas, como carcinoma do pulmão, mama, trato GI e ovário. Em pacientes com tumores trofoblásticos (células germinativas) comoseminomas, teratomas e coriocarcinomas, o beta-HCG é muito útil diagnosticando, monitorando terapia, prevendo o aparecimento de metástases e predizendo o fracasso de tratamento ou recidivas da doença. Quando avaliado em combinação com AFP, torna-se particularmente útil na detecção dos seminonas. O TPA é achado no soro de pacientes com carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, pulmão e bexiga, mas também é encontrado em condições benignas, processos cicatriciais, gravidez e doenças inflamatórias. Além disso, o TPA pode ser achado em 20% das doenças benignas da mama, sendo por isso não-específico para o diagnóstico ou a monitoração de câncer. O SCC-A, subfração do antígeno tumoral TA-4, está elevado nos carcinomas de células escamosas do útero, endométrio e em outros carcinomas da área genital. TA-4 e SCC-A também estão presentes em níveis altos em tumores de células escamosas de cabeça e pescoço, pulmão e cérvix. O SCC-A é útil na monitorização da terapia nesses tumores, mas não para o diagnóstico. O PSA é uma glicoproteína com atividade enzimática proteolítica que dissolve gel seminal depois da ejaculação. PSA é achado em tecido prostático normal, benigno e maligno e no plasma seminal, e é produzido no citoplasma das células acinares prostáticas e no epitélio ductal. Níveis de PSA são elevados no câncer de próstata. Também são achados níveis de PSA altos na hipertrofia benigna de próstata e nas prostatites agudas ou crônicas. Os níveis de PSA correlacionamse diretamente com o volume da próstata, com a fase do câncer e com a resposta à terapia. O carcinoma de próstata é a única forma de câncer em homens nos quais 214 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

PSA é detectável no soro. Por isso, a dosagem de PSA é recomendada, em combinação com o exame retal digital, para investigação do câncer de próstata. 17.3 GLICOPROTEÍNAS MUCINAS:

Glicoproteínas mucinas são antígenos de superfície celular de alto peso molecular. Elas são compostas por 60 a 80% de carboidrato e têm uma semelhança estrutural com os antígenos de grupo sangüíneo Lewis A e B. As glicoproteínas mucinas expressas na superfície epitelial incluem CA 15-3, MCA, CA 19-9 e CA 125. O CA 15-3 é expresso durante diferenciação mamária e é encontrado em células mamárias lactentes, epitélio pulmonar, carcinoma de mama, ovário, pâncreas, estômago e fígado. Podem ser encontrados níveis baixos de CA 15-3 em condições não-malignas como hepatites crônicas, cirrose, sarcoidose, tuberculose e lúpus eritematoso sistêmico. São detectados níveis elevados de CA 15-3 em carcinomas de mama, ovário, pâncreas, estômago e fígado. Sua utilização está indicada no acompanhamento do câncer de mama, especialmente no rastreamento da presença de metástases ósseas. Seus níveis diminuem em resposta a quimioterapia. Medidas consecutivas do CA 15-3 têm predito recaídas de câncer de mama antes da demonstração pelo exame clínico. O MCA é achado na maioria das células de câncer de mama, indiferentemente do grau histológico. Níveis são mais altos em metástases do carcinoma de mama, correspondendo às alterações encontradas nos níveis do CA 15-3. O CA 19-9 é uma muciglicoproteína idêntica em estrutura com antígeno Lewis A, e a expressão do CA 19-9 depende da expressão do antígeno Lewis. O CA 19-9 é encontrado nas pancreatites agudas e crônicas, na doença hepática benigna, no câncer de pâncreas e outras patologias malignas. Sua maior indicação está no acompanhamento do carcinoma de pâncreas. As diminuições dos valores séricos depois de ressecção cirúrgica demonstram que essas foram eficazes, e a avaliação periódica prevê a recorrência 3 a 9 meses antes de sintomas clínicos aparecerem.


O CA 125 é uma muciglicoproteína grande com baixo teor de carboidrato que se expressa no epitélio do cólon embrionário e é encontrada em várias doenças benignas e malignas. O monitoramento dos níveis de CA 125 é muito útil durante tratamento de câncer ovariano para mulheres de todas as idades. 17.4 HORMÔNIOS:

A calcitonina é um hormônio produzido pelas células C da tireóide e desempenha um papel na regulação do cálcio. A calcitonina está presente em altas concentrações na gravidez e em várias doenças benignas, como hipertireoidismo, doença de Paget e anemia perniciosa. Além disso, a calcitonina está elevada em neoplasias malignas específicas como câncer de mama, hepatoma, hipernefroma e câncer do pulmão, mas está notavelmente elevada no carcinoma medular da tireóide (CMT). Como um marcador tumoral para CMT, o nível de calcitonina se correlaciona com a gravidade da doença e é útil para monitorar a terapia, além de poder ser usado como triagem nas famílias com transmissão autossômica dominante de CMT. A tireoglobulina é uma glicoproteína produzida pelas células foliculares da tireóide e é necessária para proteólise e liberação da tiroxina (T4) e da triiodotironina (T3) na circulação. Níveis altos de tireoglobulina estão presentes em quase todas as desordens da tireóide, sendo, portanto inúteis para screening de doença benigna ou maligna. Porém, a tireoglobulina é um marcador tumoral útil, depois de tireoidectomia total ou radioterapia, quando níveis de tireoglobulina podem predizer o aparecimento de metástases. O ácido vanil mandélico (VMA) e o ácido homovanílico (HVA) são encontrados na urina nos casos de feocromocitoma e neuroblastoma. Os níveis prétratamento se correlacionam com a fase da doença, e as determinações consecutivas são úteis para o monitoramento da terapia. O

PTH-RP

(paratormônio,

proteína

relacionada)

é

secretado

principalmente por tumores que cursam com hipercalcemias malignas, como carcinoma epidermóide de pulmão, carcinoma de mama e do córtex renal e outros tumores epiteliais. 216 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

17.5 MOLÉCULAS DO SISTEMA IMUNE:

As imunoglobulinas monoclonais (proteínas M) foram os primeiros marcadores tumorais conhecidos. Elas são reconhecidas pela eletroforese de proteína do soro ou da urina e caracterizadas por imunofixação no soro ou na urina como imunoglobulina (IgG , IgA, IgM, IgD, IgE, ou cadeias leves livres k (kappa) ou l (lambda). As proteínas M estão presentes em quase 1% dos adultos, mas cerca de 25% dessas proteínas têm significado indeterminado. Cerca de 50% dessas proteínas

M

identificadas

indica

o

diagnóstico

de

mieloma

múltiplo.

Aproximadamente 4% dos pacientes com imunoglobulinas monoclonais têm macroglobulinemia de Waldenström, doença maligna de linfócitos B que secretam grandes quantidades de IgM. Quase 15% dos pacientes com proteínas M têm doença maligna linfoproliferativa de células B, como leucemia linfocítica crônica ou linfoma. A beta 2-microglobulina fica situada na superfície da membrana de quase todas as células nucleadas e é liberada na circulação durante turnover da membrana. A B2-M ajuda a predizer os fracassos de tratamento em pacientes com linfoma e mieloma múltiplo, guardando relação com o tamanho do tumor, e tem valor prognóstico. Oncogenes e produtos de genes como marcadores tumorais: A próxima geração de marcadores tumorais descoberta deverá incluir a descoberta de mutações em oncogenes, quantificações de proteínas codificadas através desses oncogenes, ou talvez auto-anticorpos produzidos pelas oncoproteínas na translocação cromossomial, algumas das quais podem ser descobertas através de técnicas de citogenética e também através de estudos usando hibridização com sondas radioativas, inclusive bcr/abl na leucemia mielogênica crônica, bcl-2 em linfomas

foliculares

e

myc

em

linfomas

e

outras

leucemias

Genes supressores do tumor (TSGs) regulam o crescimento das células, parando sua proliferação. Mutações em TSGs conhecidas envolvidas com neoplasias incluem inativação do gene de Rb encontrado no retinoblastoma familiar, gene de APC em 217 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

polipose familiar do cólon, WT-1 no tumor de Willms e p53 encontrado em uma grande variedade de tumores (epiteliais, leucemia, linfoma, sarcoma e neurogênicos). Um ensaio imunofluorimétrico para quantificação da proteína p53 tem demonstrado sua presença no câncer ovariano e no câncer de mama. Como já citado, não há nenhum marcador tumoral perfeito, e, por isso, não devem ser usados para screening da presença de neoplasias malignas. O PSA é atualmente o único marcador aprovado pelo FDA, em combinação com o toque retal para triagem para câncer de próstata. A AFP é apropriadamente usada como um teste de triagem em populações de risco (chineses, japoneses e esquimós do Alasca). A calcitonina pode ser usada como um teste de screening para câncer em famílias de pacientes com carcinoma medular da tireóide. Vários testes são eficazes no diagnóstico diferencial de tumores específicos. A AFP e beta-HCG são úteis no diagnóstico diferencial de tumores de células germinativas não-seminomas, quando utilizadas na colocação clínica apropriada. O CA 125 é usado na avaliação de massas ovarianas, mas com reservas. Embora CA125 tenha se mostrado elevado antes da descoberta clínica de câncer ovariano, menos de 50% dos pacientes com doença inicial apresentam elevações nos níveis de CA 125. Por outro lado, em mulheres na pré-menopausa, várias condições benignas são associadas a elevações moderadas de CA 125. Uma combinação de ensaios que usam CA 125, CA 15-3 e TAG72 (anticorpo monoclonal específico para fragmento de gonadotrofina urinária) demonstraram, em estudo realizado, uma especificidade de 99,9%, detectando câncer ovariano em estágios precoces, mas os números de pacientes foram considerados insuficientes para extrapolar o resultado para a população em geral. Proteínas M detectadas por eletroforese de proteína no soro não são úteis para screening para mieloma, porque só 50% dos pacientes que apresentam proteína monoclonal têm mieloma múltiplo. O diagnóstico, o prognóstico e a monitorização da terapia dependem não só da descoberta de uma proteína monoclonal, mas também da caracterização do tipo de imunoglobulina. Pacientes com mieloma IgA apresentam taxa de sobrevida significativamente reduzida e 218 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

complicações mais severas da doença do que os pacientes com mieloma IgG ou doença de cadeias leves. Os marcadores tumorais citados têm aplicabilidade na monitorização da progressão da doença ou da eficácia da terapia. A freqüência da monitorização não é padrão, mas uma freqüência apropriada deveria testar mensalmente no período pós-operatório, durante os primeiros seis meses, a cada dois meses durante mais seis meses, trimestralmente durante o ano seguinte e duas vezes ao ano nos anos subseqüentes. 18. DIFERENCIAÇÃO CELULAR OU CD:

Todas as células possuem em suas composições estruturais de membranas proteínas específicas capazes de serem reconhecidas por anticorpos sintetizados em laboratórios – os anticorpos monoclonais. Para os anticorpos monoclonais as proteínas de membrana de células blásticas, linfócitos, monócitos, entre outras, são identificadas como "antígenos celulares". Porém, observou-se que grupos de diferentes anticorpos monoclonais reconheciam o mesmo antígeno celular presente em mais de uma célula, quer fossem normais, malignas ou células de linhagens evolutivas. Esses antígenos de diferenciação celular reconhecidos por grupos de anticorpos monoclonais foram denominados por grupo de diferenciação celular ou CD. Foram reconhecidos em experimentação laboratorial perto de 170 diferentes tipos de CD, conhecidos por CD1, CD2, CD3, CD4, etc., cujas relações entre as células identificadas e suas funções específicas também foram relacionadas. Um dos exemplos mais conhecidos da aplicação de marcadores CD se refere à avaliação laboratorial da resistência imunológica em pacientes com AIDS por meio da determinação dos linfócitos CD4 (auxiliar) e CD 8 (citotóxico). Da mesma forma, a determinação do marcador CD 34 tem sido importante na determinação da presença de células progenitoras do sistema hematopoiético em sangue de medula óssea. Entretanto, é com relação aos linfócitos e macrófagos que é possível antever a importância da determinação dos CD para diferenciar subpopulações das 219 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

importantes células do nosso sistema imunológico, conforme mostra a tabela a seguir:

Atualmente o uso de anticorpos monoclonais para identificar antígenos de diferenciação celular está sendo aplicado para investigar e caracterizar laboratorialmente a maioria das leucemias agudas e crônicas de origens mielóide e linfóide, conforme tabela a seguir:


HEMOSTASIA:

A hemostasia é um complexo mecanismo desencadeado pelo organismo para manter o sangue no interior dos vasos e mantê-lo fluido, coibindo hemorragias e coagulações. Ela se passa no interior dos vasos de pequeno calibre (arteríola terminal, vênula pós-capilar e capilar) e para que tenha sucesso, é necessário a construção um tampão (trombo hemostático) na altura da lesão vascular. Para a formação do trombo hemostático participam as plaquetas, inúmeras substâncias do sangue circulante e a própria parede vascular no local da lesão. Após a injúria tecidual, o primeiro agente que entra em ação para conter o extravazamento do sangue é o vaso sanguíneo, que realiza vasoconstrição com conseqüente redução do fluxo sanguíneo no local lesado. 221 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

As plaquetas aderem à fibrila de colágeno (adesividade plaquetária) e, para que a adesividade seja estável, é importante a interação com o fator "von Willebrand" (glicoproteína de adesividade). Após a adesividade, outras plaquetas vão aderir às plaquetas unidas ao colágeno formando um aglomerado (agregação plaquetária). Esse processo se faz em poucos segundos e costuma-se designá-lo por hemostasia primária, reservandose a expressão hemostasia secundária para a ativação dos fatores que levam à formação da trombina e, conseqüentemente, da fibrina. Este segundo processo demora vários minutos para ser completado e é de suma importância porque, para que o trombo hemostático primário seja efetivo, ele deverá ser consolidado pela ação da trombina e pela participação da fibrina. Devemos ter em mente que essa subdivisão é puramente didática pois, há interdependência e simultaneidade na participação das plaquetas, dos fatores plasmáticos e da parede lesada do vaso. Há inúmeras situações em que este equilíbrio entre coagulaçãohemorragia está abalado e para tal deve-se analisar profundamente o “local” onde existe a deficiência e para tal lança-se mão dos testes laboratoriais para detecção das alterações na hemostasia, seja para avaliações da normalidade (préoperatórios), seja para avaliação de hemorragias ou acompanhamento do uso de medicamentos (anticoagulantes). Coagulação do sangue: A coagulação sangüínea pode ocorrer através de duas vias básicas: Intrínseca (em que os elementos necessários à coagulação já estão presentes no sangue) e a Extrínseca (em que há necessidade de um elemento externo ao sangue para que se processe). As vias intrínseca e extrínseca confluem para uma via final comum.


A Cascata da Coagulação: A via intrínseca da coagulação envolve mais fatores que a extrínseca. Na via extrínseca, a tromboplastina (III) atua sobre o fator VII, ativando-o. O fator VII ativado age sobre o fator X, já na via final comum. Na

via

intrínseca,

a

calicreína deflagra a ativação dos fatores XII, XI e IX, em cascata, ou seja, um ativa o seguinte numa seqüência ordenada. O fator IX, em presença de Cálcio e fator VIII (anti-hemofílico) ativa o fator X, iniciando a via final comum. Na via comum, a protrombina é ativada pelo fator X ativado (tenha o processo se iniciado pela via extrínseca ou pela intrínseca), formando-se Trombina. A trombina converte Fibrinogênio em Fibrina, mas também ativa o fator XIII, responsável pela polimerização da fibrina.


Formação do Retículo de Fibrina: A polimerização da fibrina é fruto da reação catalisada pelo fator VIII ativado, que se comporta como uma amidase. A fibrina polimerizada é insolúvel, arruma-se formando um retículo que aprisiona células do sangue, formando um tampão ou coágulo, cujo objetivo original seria o fechamento de uma solução de continuidade na parede do vaso. Quando o sistema é ativado dentro do vaso (ou no próprio coração), o coágulo obstrui o fluxo sangüíneo, sendo o processo chamado de Trombose. O coágulo é o trombo.

Os Fatores da Coagulação: A tabela abaixo relata os fatores da coagulação. Os fatores II, VII, IX e X são fatores dependentes da vitamina K.

Mecanismo de atuação do sistema Anticoagulante Proteína S-Proteína C: A proteína S atua estimulando a ação do inibidor do ativador de plasminogênio, liberando deste modo o plasminogênio que irá atuar sobre a fibrina, desfazendo o coágulo sangüíneo. A proteína C é um cofator necessário para sua atuação. O endotélio é capaz de transformar a trombina, a substância mais coagulante de nosso 224 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

organismo, num anticoagulante: ao produzir a trombomodulina, o endotélio cria um complexo capaz de ativar o sistema proteína S-proteína C.

Sistemas Anticoagulante e Fibrinolítico: A antitrombina III é ativada pela heparina e representa a principal

defesa

anticoagulante.

A

trombomodulina, produzida pelo endotélio, ativa o sistema proteína

C/proteína S, segunda linha de defesa antitrombo. Caso essa defesa seja vencida, entra em ação o sistema fibrinolítico, capaz de lisar o trombo e restabelecer a patência de vasos ocluídos por coágulos sangüíneos.


Esquema simplificado da cascata da coagulação 1. Anticoagulantes:

Dois tipos de anticoagulantes são mais utilizados na clínica: as heparinas e os anticoagulantes orais. As heparinas têm ação imediata após a administração, baseada na inibição da trombina e do fator X ativado, catalisando a reação dos mesmos com a antitrombina III (AT-III), enquanto que os anticoagulantes orais (cumarínicos) têm sua ação mais lenta, inibindo a síntese dos fatores vitamina K dependente. 1.1 Heparinas:

Pequenas concentrações de heparina podem inibir os estágios iniciais da coagulação, mas grandes concentrações são necessárias para inibir a ação prócoagulante da trombina ligada à superfície do trombo, a qual é resistente à inibição pelo complexo heparina-antitrombina III. A administração de Heparina deve ser iniciada precocemente, sob a forma não fracionada (administração endovenosa contínua) ou fracionada (administração subcutânea). A escolha da forma de heparina a ser administrada deve levar em conta os riscos de ocorrência de embolia pulmonar (tromboses venosas proximais), presença de quadro clínico exuberante, possibilidade de controle da atividade anticoagulante pelo tempo de tromboplastina 226 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

parcial e necessidade de infusão contínua rigorosamente controlada. De forma alternativa, pode-se iniciar o tratamento com heparinas de baixo peso molecular, que são fragmentos menores e purificados da molécula de heparina, administrados por via subcutânea. Esta forma de tratamento reserva-se a pacientes com trombose venosa distal, ou para aqueles que apresentem risco de sangramento. O tratamento deve ser iniciado com a heparina e, após um curto período, deve ser associado um anticoagulante oral. A utilização concomitante (heparina + anticoagulante oral) se faz necessária até o momento que o anticoagulante oral atinge seu pleno efeito (normalmente em 4 a 7 dias). A heparina é mantida até que o tempo de protrombina (PT), alterado pela antivitamina estiver em níveis terapêuticos, equivalente a uma relação normatizada internacional (RNI).

O uso de heparina apresenta como

complicações, além das hemorragias, a indução à trombocitopenia (podendo aparecer do 4º ao 15º dia do tratamento), cujas conseqüências podem ser catastróficas levando ao óbito se não diagnosticada precocemente. Podem ocorrer ainda osteoporose e fraturas espontâneas em pacientes em uso crônico (acima de três meses) de doses de iguais ou superiores a 30.000 UI diárias. Durante a gestação, deve ser usada apenas heparina, uma vez que não atravessa a barreira placentária; o mesmo não acontece com o uso de anticoagulantes orais que ultrapassam a placenta e causam malformações fetais. 1.2 Anticoagulantes Orais (Antivitamina K):

São derivados cumarínicos ou do Warfarin. Interferem com a produção dos fatores vitamina K dependentes, agindo como antagonistas competitivos da vitamina K, (fatores II, VII, IX e X). Os dicumarínicos não agem sobre os fatores já circulantes e sim, sobre aqueles que estão sendo sintetizados no fígado. Por este motivo, o tempo para que se inicie a ação do anticoagulante oral corresponde à meia-vida dos fatores que são: Fator VII: 6 horas; Fator IX: 24 horas; Fator X: 36 horas; Fator II: 60 horas. Possuem as seguintes características farmacológicas: São rapidamente absorvidos após dose oral, possui meia-vida na circulação variável de 15 a 60 horas, 227 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

em média 36 horas. O tratamento com warfarin deve ser iniciado após alguns dias de heparina ou até concomitante a esta. Uma vez que é necessário três a cinco dias para diminuir os fatores vitamina K-dependentes, a heparina deve ser mantida até alterar significativamente as duas vias da coagulação. 2. EXAMES LABORATORIAS PARA ANÁLISE DA HEMOSTASIA:

Dentre os inúmeros exames laboratoriais que analisam a hemostasia destacam-se o TAP (RNI) e o TTPA que “resumem” as vias extrínseca e intrínseca da coagulação, respectivamente. O coagulograma é um conjunto de testes que visa uma análise geral da hemostasia do paciente muito utilizado e pré-requisito em exames pré-operatórios. O coagulograma engloba o Tempo de Sangramento, Tempo de Coagulação, TAP (RNI), TTPA, Contagem de Plaquetas e às vezes Retração do Coágulo. 2.1 Tempo de Sangramento:

É um indicador de alterações numéricas (quantitativas) e funcionais (qualitativas) das plaquetas. Geralmente, mantém-se normal, mesmo quando as plaquetas se encontram diminuídas, porém acima do limite de 100.000/mm 3. Em pacientes com plaquetopenia, a variação do tempo de sangramento mantém uma boa correlação com os valores de plaquetas. Valores alterados podem ser encontrados nos defeitos congênitos da plaqueta, como a trombastenia de Glanzmann, e nos adquiridos, como nos quadros de uremia e síndromes mieloproliferativas.

2.2 Tempo de Coagulação:

O tempo de coagulação é um teste de baixa sensibilidade e de reprodutibilidade muito variável, sendo afetado principalmente por alterações da via intrínseca, do fibrinogênio e fibrina. Pode estar elevado no curso de heparinoterapia. 228 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

Esse teste é substituído pela realização do tempo de tromboplastina parcial ativado, que fornece um resultado fidedigno das alterações de via intrínseca. Está prolongado na deficiência severa (<6%) de qualquer fator de coagulação plasmática conhecido exceto o fator XIII (fator estabilizante da fibrina) e o fator VII; Afibrinogenemia; Presença de um anticoagulante circulante (incluindo heparina).

Apresenta-se normal na Trombocitopenia; Deficiência do fator VII; Doença de Von Willebrand; Leves defeitos de coagulação devido a qualquer causa. Interferentes:

Falsamente aumentado em pacientes em uso de Anticoagulantes e Tetraciclinas e falsamente reduzido em paciente em uso de Corticosteróides e Epinefrina. 2.3 Retração do Coágulo:

A retração é a fase final do processo de coagulação e está diretamente ligada à atividade funcional adequada das plaquetas. O coágulo pode estar alterado em volume na presença de plaquetopenia e nas anemias. A avaliação da retração tem sua maior utilidade na avaliação de deficiências funcionais das plaquetas. É quando a retração se encontra diminuída, mesmo na presença de um número normal de plaquetas. Pode ser influenciado pela quantidade de trombina e do fibrinogênio e por valores alterados do hematócrito.

2.4 Tempo de Ativ idade da Protrom bina (TAP):

As drogas anticoagulantes orais atuam sobre os fatores da coagulação pertencentes ao sistema extrínseco da coagulação. Por isso, o tempo de atividade da protrombina (TAP) é o exame de escolha para monitorização da terapêutica com essas drogas. Por avaliar a via extrínseca, o TAP pode estar elevado na deficiência isolada do fator VII, na presença de anticorpos inibidores circulantes e em patologias que afetem o processo de absorção, síntese e metabolização da vitamina K, visto que a produção desse fator é dependente dessa vitamina. Pode apresentar-se alterado também, quando ocorre comprometimento da via final comum (X, V, II e I). 229 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

Como teste de referência para o acompanhamento da anticoagulação oral, o TAP não fornecia a uniformidade desejada, gerando resultados que variavam amplamente em comparações intra e interlaboratoriais. Por esse motivo, depois de diferentes tentativas de padronização, em 1983, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estabeleceu em conjunto com o Comitê Internacional de Trombose e Hemostasia e a Comissão Internacional de Padronização em Hematologia, a recomendação para a utilização mundial do ISI (International Sensibility Index) e a conversão dos resultados obtidos em INR (International Normalized Ratio) ou RNI. Com esses dados, podem calcular o índice de sensibilidade internacional (ISI) para cada lote de tromboplastina produzido. Esse valor de ISI, fornecido pelo fabricante em cada lote enviado, é utilizado para o cálculo do INR (razão normalizada internacional). Quanto maior o ISI, menor a sensibilidade do reagente. O INR é obtido por um cálculo que divide o valor do TAP encontrado na amostra do paciente pelo resultado do TAP de um pool de plasmas normais, elevados ao ISI. Portanto, na prática, ele passa a funcionar como um TAP padronizado intra e interlaboratorialmente. O horário ideal para a coleta do sangue para avaliação do TAP está diretamente relacionado ao horário da administração do medicamento. Os principais protocolos apontam que os anticoagulantes devem ser administrados à tarde (18h) e o material colhido na manhã seguinte (até às 10h), de modo a garantir a absorção adequada do medicamento. Entretanto, na prática, a melhor indicação é que o paciente tome o medicamento sempre no mesmo horário e faça a coleta no mesmo prazo em que realizou as anteriores. O exame pode ser feito manualmente em BM ou através de diversos aparelhos disponíveis hoje no mercado. Verifica-se o tempo que leva para

esse

plasma

citratado

coagular e corresponde com uma

tabela

disponível

pelo 230


fabricante contendo o RNI/ISI.

Equipamento muito utilizado na determinação de TAP, TTPA, Fibrinogênio, Anticoagulante Lúpico.

Existem drogas que alteram

a

ação

dos

anticoagulantes orais: Drogas que potencializam a ação dos anticoagulantes orais: Alguns antibióticos, antiinflamatórios, ácido acetilsalicílico, antidepressivos tricíclicos, antiagragantes plaquetários, cimitidina e outras drogas com ação no trato gastrointestinal, hormônios tereoidianos, antilipemiantes, imunossupressores, entre outras; Drogas que inibem a ação dos anticoagulantes orais: Alguns antibióticos, antiácidos, contraceptivos orais, barbitúricos, antifúngicos, álcool, diuréticos, corticorióides, anti-histamínicos, esteróides, entre outros. 2.5 Tempo de Tromboplasmina Parcial At ivada (TTPA):

O tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA ou PTTA) avalia defeitos da via intrínseca da coagulação, podendo, portanto, constatar a deficiência dos fatores VIII, IX, XI e XII. É útil também no controle do uso terapêutico de heparina e na avaliação da presença de anticoagulantes circulantes. Pode apresentar-se alterado também quando ocorre comprometimento da via final comum (X, V, II e I). O achado de TTPA prolongado na presença de TAP normal indica a possível deficiência dos fatores XII, XI, IX, VIII. Ao contrário, TTPA normal na presença de TAP prolongado indica comprometimento do fator VII. Quando ambos (TTPA e TAP) estão alterados, indicam comprometimento da via final comum, ou seja, dos fatores X, V, II e I. Já ambos normais indicam pacientes sem alterações ou comprometimento do fator XIII.


2.6 Fibrinogênio:

O fibrinogênio (Fator I) é uma glicoproteína sintetizada no fígado e está envolvida na etapa final da coagulação, que consiste na sua conversão em fibrina, sob a ação da trombina. Além de seu papel na coagulação, é uma importante proteína na resposta de fase aguda. Portanto, pode estar elevado em diferentes patologias, como processos inflamatórios e infecciosos agudos, traumas, neoplasias, pós-operatório, uso de anticoncepcionais orais e síndrome nefrótica. Encontra-se também elevado por influências genéticas, na gravidez e no tabagismo. Entretanto, pode estar reduzido devido à diminuição da produção hepática, em doenças hepáticas graves, ou por aumento de consumo, com conversão excessiva de fibrinogênio em fibrina, sem tempo para reposição adequada, como nos quadros de coagulação intravascular disseminada. Pode também apresentar-se diminuído nos casos de fibrinólise primária e secundária e por conta do uso de agentes fibrinolíticos. Já foram identificadas diversas variantes hereditárias do fibrinogênio (disfibrinogenemia). Os quadros podem variar entre alterações hemorrágicas, tendência a distúrbios trombóticos ou indivíduos assintomáticos. A disfibrinogenemia adquirida está associada a doenças hepáticas ou renais. Sua avaliação tem um papel importante no diagnóstico diferencial das coagulopatias adquiridas, na coagulação intravascular disseminada, na fibrinólise primária e secundária, na disfibrinogenemia e na afibrinogenemia. 2.7 Antico agulante Lúpic o:

Os anticoagulantes lúpicos (ACL) são imunoglobulinas da classe IgG ou IgM. Assim como os anticorpos anticardiolipina (ACA), os anticoagulantes lúpicos fazem parte da família dos antifosfolipídios e interferem nos procedimentos de screening de coagulação que dependem da presença de fosfolipídios. Constituem uma causa comum do prolongamento do tempo de tromboplastina parcial ativado (APTT). 232 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

Os ACL são espécies-específicos e são neutralizados pela adição de fosfolipídios (plasma rico em plaqueta). São anticorpos muito heterogêneos no que diz respeito às suas características imunológicas e à variação de complexos fosfolipídicos e protéicos que atuam como seu alvo antigênico. Dados recentes sugerem que outras proteínas, como a proteína C, a proteína S e a trombomodulina, são também alvos para ACL. Apesar da sua atividade anticoagulante in vitro, na prática os anticoagulantes lúpicos estão relacionados a manifestações tromboembólicas recorrentes arteriais (menos freqüentemente) e venosas, abortos repetidos, e, em certos casos, são encontrados em pacientes hígidos, assim como em diferentes situações clínicas, como doenças auto-imunes, neoplasias, quadros infecciosos virais, bacterianos e parasitários, distúrbios neurológicos e uso de alguns medicamentos. A detecção laboratorial de ACL não deve ser baseada em um único teste. Deve-se realizar uma combinação de testes de screening com ensaios para excluir deficiências de fator de coagulação ou a presença de um inibidor de fator, os quais podem dar origem a resultados falso-positivos para ACL. Ou seja, a detecção deve ser realizada em etapas: screening para identificação da alteração; exclusão de déficit de fator, confirmando assim a presença de um inibidor e a caracterização do tipo de inibidor. É importante também a interferência da heparina e dos anticoagulantes orais nos resultados, determinando, portanto, que o teste seja realizado somente após 2 semanas da suspensão dos anticoagulantes orais e 48 horas após a última dose de heparina. Na avaliação da síndrome de antifosfolipídios, alguns dados indicam que os ensaios de ACL predizem com mais segurança trombose, perda fetal recorrente e trombocitopenia do que os ensaios para ACA. Entretanto, aproximadamente 60% dos pacientes são positivos tanto para ACL quanto para ACA, enquanto os 40% restantes são positivos apenas para ACA ou para ACL.


Interpretação de Exames Laboratoriais (4).pdf

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