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Introducción
3.1
Los lípidos son sustancias no polares, prácticamente insolubles en agua, pero solubles en solventes grasos no polares como el cloroformo, benceno, etanol, metanol, etc.
Extracción y cuantificación de los diferentes lípidos
Los resultados de la extracción y cuantificación se presentan en la tabla 1.
Los lípidos generalmente se encuentran enlazados a proteínas y polisacáridos de los tejidos, formando complejos con diferentes grados de estabilidad, por lo que para romper estos complejos se requieren el empleo de condiciones de extracción capaces de desnaturalizar o separar las proteínas o carbohidratos asociados con ellos. El etanol, por ejemplo, desnaturaliza las proteínas y separa los complejos lipoproteínas.
Tabla 1. Datos experimentales de la extracción y cuantificación de lípidos.
Lípido Extraído Lípidos totales Lecitina Colesterol
Cantidad 60.3 % 5.6 % 1.7 %
La separación de los lípidos basada en sus diferencias de solubilidad, son desafortunadamente casi siempre, parcialmente parcialmente satisfactoria, debido a que la solubilidad de los constituyentes de la mezclas de lípidos son bastante diferentes a las de los lípidos puros [1].
Para realizar la extracción de los lípidos, es común el empleo de metanol al 95%, etanol al 95% o mezclas de metanol-cloroformo (3:1), o etanol-éter (2:1). Es conveniente adaptar las condiciones de extracción tanto al tipo de tejido empleado, así como la cantidad cantidad y naturaleza del del lípido deseado.
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Resultados y discusión
Según los valores reportados en la literatura, el contenido de lípidos en la yema seca es de aproximadamente el 62% [4] por tanto el rendimiento de la extracción realizada fue 97.3%.
Materiales y métodos
La metodología seguida, así como los reactivos empleados, fueron los mismos de las guías de laboratorio. Brevemente, la muestra de yema de huevo (8.379 g) se maceró y se mezcló en una solución etanol-éter (35 mL, 2:1), la cual se agitó continuamente por 10 minutos. Se filtró inicialmente la fase liquida de la sólida, esta última fue extraída con n-propanol (10 mL) y filtrada. Ambos filtrados se mezclaron y se llevaron a sequedad y se cuantificó el contenido de lípidos totales. Posteriormente la lecitina se extrajo mezclando el sólido con éter (10 mL) y acetona (30 mL), obteniendo a su vez los triglicéridos y el colesterol en la fase liquida.
Para la separación de las lecitinas de la solución etérea, se utiliza acetona, ya que las lecitinas, cefalinas y esfingolípidos son solubles en éter, etanol o cloroformo, pero insolubles en acetona por este motivo precipitan de la solución. Las lecitinas son esteres de la colina, estas se encuentran ampliamente en los tejidos de las plantas y animales. De la misma forma que los ácidos fosfatídicos, las lecitinas contienen una cabeza polar y dos colas de hidrocarburos no polares, largos. Al igual que el jabón pueden formar micelas y otros agregados con sus cabezas polares en la parte exterior y su cola no polar orientada hacia el interior [2].
El contenido de fosfato, colina y glicerol en la glicerina se identificó inicialmente por reacción en reflujo en una solución alcohólica de hidróxido de potasio (15 mL, 25%), la cual se filtró, y se analizó el filtrado: los fosfatos se identificaron por reacción del filtrado (1 mL) con ácido molibdico (1 mL) y ácido ascórbico (1 mL); la colina por reacción del filtrado (2 mL) con HCl (2N, 2 gotas) y reineckato de amonio (2 mL); el glicerol se identificó por la prueba de la acroleína.
La lecitina obtenida se sometió a una reacción de saponificación y después se neutralizo con hidróxido de potasio. La saponificación es la hidrolisis, promovida por base, de las uniones ésteres de las grasas y aceites [2], esquema 1.
El colesterol se obtuvo por disolución en KOH (10 mL, 10% en etanol), luego en éter (20 mL), y concentración). El ensayo semicuantitativo se realizó por la reacción del solido con cloruro de ácido férrico en etanol.
Esquema 1 Saponificación de la Lecitina.[3]
El filtrado obtenido acroleína la cual fue reacción indica la verifico debido al 1
se sometió a la prueba de positiva, La positividad de esta presencia de glicerina y se desprendimiento de vapores
blancos irritantes de olor desagradable, reacción se muestra en el esquema 2.
cuya
huevo tiene un alto contenido de hierro, cerca de 85 veces más que la clara que a su vez posee un mayor contenido de azufre que la yema. El azufre de la clara de huevo que proviene principalmente de la cisteína y la metionina presente en las proteínas de la misma es muy lábil y se separa con mucha facilidad de esta por calentamiento. En 1920 Tinkler y Soar [6] revelaron en sus investigaciones que la membrana de la yema del huevo no jugaba un rol determinante en este proceso y que el calentamiento prolongado de la clara a altas temperaturas genera cantidades considerables de sulfuro de hidrógeno, el cual posteriormente se combina con el hierro de la yema para forma el sulfuro de hierro que produce la coloración verdosa.
Esquema 2Reacción de la prueba de acroleína para glicerol.
La determinación de fósforo se llevó a cabo, utilizando el método colorimétrico dado por la reacción de azul de molibdeno, para ello el fósforo presente se llevó al estado de fósforo inorgánico que posteriormente en medio ácido y en presencia de exceso de molibdato amónico se transformó en el complejo fosfomolibdico (NH3)4(PMo12O40) que por reducción con el ácido ascórbico da un complejo coloreado estimable colorimétricamente [14]. La formación de este complejo con molibdeno se realiza porque es más estable el complejo que el ión simple, dando un compuesto de estado de oxidación inferior y de coloración azul intenso, el cual se observó experimentalmente. Este método es satisfactorio para concentraciones de fosfato superiores a 1 mg por litro.
El estudio de Tinkler y Soar también demostró que la cantidad de sulfuro de hidrógeno forma depende del tiempo de cocción, la temperatura alcanzada y la reacción del huevo. De esta manera Tinkler y Soar exhibieron que la formación de sulfuro de hierro es muy lenta hasta que la yema alcanza una temperatura cerca a los 70ºC, mostrando que se forma muy poco sulfuro de hierro cuando los huevos son cocinados por 1 hora a 70ºC o por o por 35 minutos a 85 ºC, hecho que les permitió concluír que la formación del sulfuro de hidrógeno depende tanto de la temperatura aplicada al huevo como del tiempo como del tiempo que es sometido a esta temperatura.
La determinación semicuantitativa de colesterol es posible debido a la reacción de colesterol con ácido fuerte concentrado en la cual se forma una sustancia coloreada, 3,5-colestadieno debido a la deshidratación y oxidación del colestero; los colestapolienos son de color verde y sus iones de color rojo. El ácido sulfúrico concentrado se utiliza como deshidratante y oxidante, y el hierro (III) para aumentar la reacción de color [12].
Finalmente Tinkler y Soar también demostraron que a medida que la reacción se hace más alcalina el sulfuro de hidrógeno se libera con mayor facilidad, por tanto el deterioro del huevo también afecta la cantidad de sulfuro de hidrógeno formado. Este hecho evidenció por qué en algunos huevos se forma más sulfuro de hierro que en otros aun cuando fueran cocinados con la misma temperatura y por el mismo tiempo.
En este sistema se forma un ion tetraenilico con máxima absorción a 536 nm (color rojo), tras 30 minutos de reacción, tiempo óptimo para la medición espectrometrica en este sistema, el rendimiento es próximo al 100 %, hecho que explica la mayor sensibilidad de los métodos que utilizan este sistema en comparación con los que utilizan el procedimiento de Liebermann-Burchard [12].
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4.2
Preguntas
4.1 ¿A qué se debe la coloración verdosa-gris de algunas yemas de huevos cocidas?
¿Qué hubiese pasado si la extracción de colesterol no se hubiera realizado en condiciones anhidras? ¿Qué resultados esperaría?
Si la extracción de colesterol no se hubiera llevado a cabo en condiciones anhidras, el colesterol que tiene un comportamiento de solubilidad muy bajo en agua (0,095 mg de colesterol / L de agua), no se hubiera obtenido una cantidad significativa de colesterol ya que habría una cantidad muy baja de colesterol en la solución [7]. Además con la adición de agua después de la formación de la sal potásica de los triglicéridos presentes en la muestra a partir de la cual se obtuvo, se hubieran formado micelas
La coloración gris-verdosa de algunas yemas de huevo cuando se cocinan por más de 15 minutos se debe esencialmente a la reacción entre el azufre en forma de sulfuro de hidrógeno presente en la clara del huevo con el hierro presente en la yema, para formar sulfuro de hierro [5] ya que la yema del 2
de los correspondientes ácidos grasos, para formar una emulsión [8].
4.4
4.3 ¿Qué se conoce como materia grasa saponificable y no saponificable? En qué punto se aplicó esto en la práctica.
¿Por qué aconseja analizar el colesterol de huevos por cromatografía y no colorimétricamente?
Los análisis colorimétricos directos para el análisis de colesterol sin preparación previa de la muestra, es decir sin realizar la extracción y la saponificación, para separar el colesterol libre del colesterol esterificado correspondiente a menudo conlleva a errores principalmente causados por interferencias químicas como la presencia de proteínas y a diferencias del color desarrollado por el colesterol libre y el esterificado[11].
Se conoce como materia saponificable a los lípidos que tienen grupos funcionales ester y por lo tanto son susceptibles de saponificación, los lípidos saponificables (ésteres) a su vez se dividen en lípidos simples y lípidos compuestos, basándose en la complejidad del ester y de los productos de su hidrólisis o saponificación, los lípidos simples solamente producen alcoholes y sales de ácidos carboxílicos, mientras que los lípidos compuestos producen otros compuestos como ácido fosfórico y aminas.
Los métodos espectrofotométricos de análisis de colesterol basan su funcionamiento en la reacción del colesterol con un ácido u enzima para su posterior determinación colorimétrica, hecho que representa una gran desventaja porque el colesterol analizado no podría ser reutilizado inmediatamente si no que requeriría nuevamente de un tratamiento químico que permita recuperarlo de nuevo, lo cual no es un problema en el caso de los métodos cromatográficos que además aseguran una separación efectiva entre el colesterol libre y el colesterol esterificado en el momento de la cuantificación [12,13].
Entre la materia saponificable se encuentran por lo tanto compuestos como las grasas, aceites, las ceras, los fosfolípidos, los glicolípidos y lipoproteínas. Por otro lado en la materia insaponificable se encuentran compuestos como las vitaminas liposobles K, E, D y A, los esteroles, los hidrocarburos de cadena larga, los minerales trazas mercurio, cadmio y plomo y los terpenos [9].
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Conclusiones
Se pudo realizar de manera exitosa la extracción del contenido de lípidos totales en la yema de huevo, obteniendo: 60.3 % de totales, 5.6 % de lecitina, 1.7 % colesterol. Los ensayos para la lecitina fueron positivos, excepto para la colina, debido al mal estado de la solución de reineckato. No fue posible identificar la materia grasa saponificable de la fase del colesterol.
Durante este estudio se aplicó este concepto en dos ocasiones, la primera cuando se hizo reaccionar el filtrado de lecitina en la sección de extracción de lípidos totales con el hidróxido de potasio en reflujo, cuyos productos de reacción son generalmente glicerina, fosfato de sodio, jabón y colina [10] como se muestra en el esquema 3.
En la prueba de acroleína para el glicerol se tiene que utilizar altas temperaturas para favorecer la deshidratación del glicerol y obtener la acroleína fácil de identificar por su olor característico.
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Sugerencias
Realizar cuantificación de fosfato ya que en la técnica utilizada para identificarlo se obtiene complejo coloreado que se puede usar en el método colorimétrico.
Esquema 3. Saponificación de la Lecitina
El concepto se aplicó por segunda ocasión, cuando se efectuó la reacción entre el sobrenadante de trigliceridos y colesterol en la sección de extracción de lípidos totales con el hidróxido de potasio en reflujo, que permitió aislar el colesterol libre del colesterol esterificado, para su posterior análisis cualitativo [11].
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Referencias
[1] Anónimo. Extracción de lípidos. http://cdigital.dgb.uanl.mx/la/1020111502/10201 11502_017.pdf. Visitado 19 de noviembre de 2013.
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[2] WADE, L. Química Orgánica. 5ed. Madrid: Pearson Educación, 2004. p. 1166-1170. [3] Anónimo. Pruebas cualitativas para la
idenficación de lípidos. http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmen dez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO%2 010%20(IDENT%20LIPIDOS%200604).pdf. Visitado 19 de noviembre de 2013. [4] Huopalahti, R.; López-Fandiño, R.; Anton, M.; Schade, R. Bioactive Egg Compunds. Berlin. Springer Berlin Heidelberg. 2007. p. 2. [5] http://chestofbooks.com/food/science/Experime ntal-Cookery/The-Formation-Of-FerrousSulfide-In-Cooked-Eggs.html. Revisado mayo 26 de 2012. [6] Tinkler, C. K; Soar, M. C. The formation of ferrous sulphide in eggs during cooking. Biochem. J. 1920. 14(2). pp 114-119. [7] http://www.exp.uji.es/asignatura/obtener.php?let ra=I&codigo=A39&fichero=1132229711IA39 [8] Morrison, R. T.; Boyd, R. N. Química orgánica 5ta ed. Mexico: Pearson Educación. 1998. pp 1246-1247. [9] Restrepo, J. O.; Zuluaga, H. F. Fundamentos estructurales de bioquímica. Santiago de Cali: Editorial Universidad del Valle. 2011. pp 195215. [10] Fieser, L. F.; Fieser, M. Química Orgánica Fundamental. 4ta ed. Barcelona: Editorial Reverté. 1985. pp 293-295. [11] http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/pet it/A n%E1lisis%20sangre.pdf. [12] Arranz, M.; Esteban, M.; Palacios, M. Métodos recomendados para la determinación de la concentración de colesterol en suero o plasma y en otros especímenes biológicos. Quím. Clin. 1994. 13(7). pp 496-503. [13] http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=s036616442002000100011&script=sci_arttext. [14] Kaster, M., Secreción de fósforo durante la absorción de azucares. I. Métodos de determinación de fosforo. http://www.scielo.br/pdf/mioc/v57n2/tomo57(f2) _112-130.pdf Visitado 20 de Noviembre 2013.
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