Laboratorio de Microbiología Industrial
2017 - I
Aislamiento de microorganismos amilolíticos y producción de amilasa en cultivo sumergido y mediante fermentación en estado sólido A. Barrientos1 - J. Cachay 1 - J.Cisneros 1 - R. Rodríguez 1
Summary: Amylolytic microorganisms were isolated from a soil sample from the district of San Borja, Lima - Peru. The isolate with the highest hydrolysis halo was identified as Aspergillus Aspergillus sp. sp. and was selected for the production production of amylases in submerged fermentation fermentation (FS) (soluble starch 20 g / L) and in solid state fermentation (FSS) (wheat bran 7.5 g). In FS, the enzyme activity was 3052.5 U/L while in FSS it was 121.0232 U/g. Volumetric productivity for amylase ( ΓE) was 31.7969 (U L-1 h -1) for submerged fermentation and in FSS it was 256,292 (U L -1 h -1). It was found that the FSS system culture gives a higher amylase production than a FS culture in the case of Aspergill of Aspergillus us sp. sp.
Keywords: Aspergill Keywords: Aspergillus us sp amylases, sp amylases, submerged fermentation, solid state f ermentation
Resumen: Se aislaron microorganismos productores de amilasas de una muestra de suelo del distrito de San Borja, Lima - Perú. El aislado con mayor halo de hidrólisis se identificó como Aspergillus Aspergillus sp. sp. y se seleccionó para la producción de amilasas en fermentación sumergida (FS) (almidón soluble 20 g/L) y en fermentación en sustrato sólido (FSS) (salvado de trigo 7.5 g). En la FS la actividad enzimática enzimática fue 3052.5 U/L mientras que en la FSS fue 121.0232 U/g. La productividad volumétrica (Γ E) de amilasa amilasa fue 31.7969 (U L -1 h-1) para el cultivo sumergido y para el caso de la FSS tuvo un valor de 256.292 (U L -1 h-1) . Esto indica que el sistema de cultivo en FSS fue más eficaz que el de FS para la producción de amilasas en el caso de Aspergillus Aspergillus sp. sp.
Introducción:
al. al. (2000), su uso en la biotecnología es
Amilasas es la denominación denominación que ha
importante
recibido aquella familia de carbohidrasas
industriales como lo son las industrias de
encargadas de la degradación del almidón,
los alimentos, del papel y los textiles,
una de los polisacáridos más conocidos
siendo muy útil al reemplazar los procesos
según Redleman (2000). Según Pandey et
de hidrólisis del almidón mediante métodos
1
para
diferentes
procesos
Pregrado en Biología, Laboratorio de Micología y Biotecnología (LMB), Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Agraria La
Molina (UNALM), Lima-Perú.
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químicos, los cuales suelen dejar tras de sí
directo y el uso del enriquecimiento del
residuos
son
cultivo. En el primero es deseable que el
enzimas que se han reportado muy
medio que se utiliza para el aislamiento
extensamente en los microorganismos
posibilite la máxima expresión del material
(aunque también en animales y plantas),
genético del organismo, basándose en la
siendo la α-amilasa y la glucoamilasa las
forma de crecimiento o en la formación de
que se identifican con mayor frecuencia en
halos de degradación del sustrato u otro
estos.
factor.
Debido
contaminantes.
a
su
la
Actualmente hay varios sistemas de cultivo cultivo
producción de estas enzimas a gran escala
conocidos, como lo son el uso de la
es sin duda beneficiosa. Sin embargo,
fermentación
primero debemos tener en cuenta que es
fermentación sobre sustrato sólido (FSS) y
necesario identificar a los organismos que
la fermentación por adhesión a superficies. superficies.
son capaces de producirla. La OEA (2000)
Según Gutiérrez-Correa & Villena (2003),
establece que el éxito o fracaso de un
cada sistema tiene sus ventajas y sus
proceso fermentativo va a depender del
defectos, por ejemplo cuando se refiere a
microorganismo
elegido,
teniendo
en
FSS debido a su limitación de agua en el
cuenta
criterios
como
la
sistema, se puede tener una mayor
estabilidad estabilidad genética de la cepa, que tenga
concentración de productos así como una
una alta velocidad v elocidad de crecimiento, que esté
alta
libre de contaminantes (como fagos), que
embargo,
tengan requerimientos nutricionales tales
procesos en este tipo de fermentaciones
que sean satisfechos por medios de costo
para llegar a nivel de industria. Para los
reducido, de fácil conservación por largos
procesos en FS, es muy útil referente a
períodos
sus
aspectos de ingeniería como el diseño del
características, que sea capaz de realizar
biorreactor a usar, el control del proceso y
el proceso fermentativo completo en un
el modelamiento de la fermentación; a
lapso corto de tiempo y que si fuese
pesar de ello no es tan barato ni permite
obtenerse un producto lo haga con el
tanto ahorro de energía como lo haría un
mayor rendimiento y con la mejor facilidad
proceso de FSS.
ciertos
de
gran
Estas
tiempo
importancia,
sin
es
perder
sumergido
productividad es
(FS),
volumétrica;
complicado
escalar
la
sin los
de extracción del medio posible . Las fuentes de cepa pueden ser naturales o de
En este experimento, se ha hecho un
una colección de cepas. Una v ez elegida la
aislamiento
fuente de aislamiento, su éxito dependerá
amilolíticos amilolíticos que habitan en una muestra de
de la técnica usada por el mismo. Entre
suelo, de forma que se pueda realizar una
estas técnicas tenemos al aislamiento
identificación de aquellos con un gran
de
los
microorganismos
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potencial degradativo y poder comparar
S elecció elecc ión n e identifi id entifi cació cac ión n de hong os
ciertos parámetros de productividad al usar
amilolíticos : Terminado el periodo de
la FS o la FSS
incubación, se utilizó una cámara de yodo metálico para observar los halos de
Materiales y métodos:
hidrólisis.
Lug ar de mues mues treo: Se tomó una muestra
amilolíticas en base a la amplitud del halo
de suelo del distrito distrito de San Borja, Lima-
incoloro. Las colonias se identificaron
Perú (-12.08457812, -77.00393069), del
morfológicamente morfológicamente hasta el nivel de género
cual se seleccionó un área de 1m 2 de
empleando el manual de Barnett (Barnett,
suelo. Se retiró el material vegetal y se
H. y Hunter, B. 1998). La colonia que
removió
de
presento el mayor halo de hidrólisis fue
profundidad. No se realizó enriquecimiento
trasplantada a tubos con cuña y a placas
del área, sin embargo se mantuvo la
Petri ambos con Agar Papa Dextrosa
humedad durante los 15 días anteriores al
(PDA) los cuales se incubaron a 30º C por
muestreo.
3 días.
el
suelo
hasta
15
cm
Se
seleccionaron
cepas
Mues treo: Se tomó 100 g de suelo
P reparaci reparación ón del inóculo: Se seleccionó la
humedecido in situ en un recipiente
cuña de la colonia con mayor halo de
desinfectado y se guardó en un lugar
hidrolisis de almidón. Las esporas se
fresco, pero no refrigerado. refrigerado.
lavaron con 10 ml de solución Twen 80 de 0.1% (v/v) y el recuento se realizó con la
A is lamien lamiento to
de
micro mic roor orgg anis mo
cámara de Neubauer. Se diluyó hasta
amilolíticos : Se pesó 10 g de suelo y se
alcanzar una suspensión de 1 x 10 6
añadió a un matraz Erlenmeyer con 90 ml
esporas ml-1, la cual se usó como inóculo.
de agua destilada estéril (dilución 100) y se agitó por 10 minutos. Luego se realizó el
Cultivo Sumergido (FS): Del inóculo se
método
sucesivas
tomó 3 ml y se colocó en un matraz
llegando a la dilución 10 -5. Finalmente, se
Erlenmeyer que contenía 80 ml de medio
tomó 1 ml de cada dilución y se sembró por
de producción (20 g de almidón, 2.8 g
incorporación incorporación en placas petri con medio de
NH4NO3, 1 g K2HPO4, 0.5 g KCL, 0.03 g
aislamiento para hongos (10g almidón
FeSO4, 0.5 g CaCl2, 1 g peptona, 1000 ml
soluble, 0.5 g caseína, 1.4 g NH 4NO3, 0.5
agua destilada, pH 6.5) el cual se incubó
g K2HPO4, 0.5 g MgSO4, 0.1 ml tritón-x-
en baño a 30º C con agitación a 175 rpm
100, 15 g agar, 1000 ml agua destilada y
por 4 días.
de
las
diluciones
tetraciclina 100 g/ml). Las placas fueron incubadas por 4 días a 30º C.
Cultivo en Sustrato Sólido (FSS): Se añadió 3 ml de inóculo a un matraz
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Erlenmeyer
que
contenía
medio
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de
producción 7.5 g salvado de trigo con
empleó el método de Lowry (Lowry et al , 1951).
99.1% de almidón, 6 g torta de soya molida, 15 ml solución de sales (KH 2PO4
Resultados:
0.2%, MgSO4.7H2O 0.03%, CaCl2, agua de
A is lamien lamiento to: Se escogió la placa cuya
caño decantada). El matraz se incubó a
dilución fue de 10 -4 debido a la presencia
30º C por 4 días (96 h).
de colonias con una separación adecuada y de tamaño tam año considerable. considerable. La selección del
R ecuperaci ecuperación ón de la enzima: enzima: Para el
microorganismo se realizó en función al
sistema (FS), la suspensión de enzimas se
tamaño del halo de hidrolisis después del
separó de la biomasa utilizando filtración al
revelado en yodo metálico. Se procedió
vacío. Además se empleó papel filtro de
luego a la identificación del hongo de
peso conocido. El producto de la filtración
acuerdo
se secó a 80º C por 2 días, la cantidad de
morfológicas, morfológicas, las cuales se comparó con lo
biomasa se determinó por diferencia de
estipulado en el Manual de Barnett (Barnett
peso seco. Para el cultivo (FSS) se añadió
y
69 ml de tampón acetato 50mM, pH 4.8, se
microscópica a través del aumento 400x
agitó homogéneamente a 200 rpm por 20
permitió
min
microorganismo
y
por
filtración
se
separó
el
Hunter,
a
sus
1998).
determinar
características
La
identificación
que
pertenecía
al
dicho género
sobrenadante sobrenadante del precipitado.
Aspergillus Aspergillus sp.
D etermin eterminación ación de la activ actividad idad amila amilass a y
Consumo de sustrato, secreción de
proteín pr oteínas as s olubles : Del sobrenadante
proteín pr oteínas as y biomas bi omasa a formada for mada: En la
obtenido de los dos sistemas de cultivo se
Tabla 01 podemos ver para el sistema FS
determinó la actividad enzimática (FS
la concentración de proteínas secretadas,
dilución 1/20, 1/50, 1/100. FSS dilución
el consumo de sustrato y la biomasa
1/150, 1/200, 1/300) mediante análisis de
formada. Debido a que se presentan
azúcares reductores liberados durante la
ciertas complicaciones en el sistema FSS
hidrólisis de almidón, método de Miller
para separar la biomasa formada del
(Miller, G. 1959), empleando DNS como
sustrato, así como la complejidad del
reactivo. La lectura se realizó a 540 nm. Se
mismo, no se pudo calcular los dos últimos
entiende por unidad enzimática (UI) como
valores, sin embargo si se pudo cuantificar
la cantidad de enzima que libera 1µmol de
la concentración de proteína secretada.
glucosa por minuto a 50ºC y pH 4.8. La
Como se puede apreciar, la concentración
lectura fue realiza a 550 nm. Para la
de amilasa producida por el sistema FSS
determinación de proteína soluble se
fue 96.5 veces mayor que para el sistema FS.
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Tabla 01. Comparación de parámetros de biomasa, sustrato consumido y proteínas solubles por Aspergill por Aspergillus us sp. sp. obtenidos en los sistemas FS y FSS Proceso
Biomasa formada (g L-1)
Sustrato consumido (g L-1)
Concentración de proteínas secretadas (g/L)
FS FSS
6.29 -
21.835 -
0.823 7.940
Biomasa formada (g l -1)= biomasa producida (g)/volumen de medio de fermentación (l), Sustrato consumido (g l -1)=glucosa presente en el medio (g)/volumen del medio de fermentación, Proteína secretada total (g)=proteína secretada soluble (g) contenida en el volumen total utilizado (80mL para FS y 60mL para FSS).
Parámetros de productividad: productividad: Por las dificultades ya explicadas anteriormente para el sistema de cultivo FSS, algunos parámetros de productividad productividad tales como rendimiento enzima respecto a biomasa formada (YE/X), rendimiento enzima respecto a sustrato consumido (Y E/S), rendimiento biomasa formada respecto a sustrato consumido (YX/S), productividad volumétrica de biomasa (ΓX) y productividad volumétrica específica de amilasa (Γ (ΓE/X) no pueden ser calculados.
Los resultados de los diferentes parámetros de productividad están expresados en la Tabla 02. Como podemos observar, la actividad específica (YE/P) del sistema FS es un 16.45% mayor al sistema FSS. Sin embargo, el valor de la productividad volumétrica de amilasa (ΓE) del sistema FSS esta resulta ser 8.1 veces mayor que la presentada por el sistema FS.
Tabla 02: Comparación 02: Comparación de parámetros de productividad para la producción de amilasa de Aspergillus Aspergillus bajo bajo (1) diferentes condiciones condiciones después de 96h de cultivo YE/X YE/S YE/P YX/S ΓE ΓX ΓE/X Proceso EA (U g-1) (U g-1) (U g-1) (g g-1) (U l-1 h-1) (g l-1 h-1) (U g-1 h-1) FS 3052.5 485.5836 139.7985 3708.99 0.2879 31.7969 0.0655 5.0582 (pH 6) FSS
121.0232
-
-
3098.74
-
256.292
-
-
(1) Parámetros de productividad: EA (U/l o U/g) : actividad enzimática, [P] (g/l) = concentración de proteínas, YE/X (U g-1) = Amilasa producida (U l-1)/ Biomasa formada (g l-1), YE/S (U g-1) = Amilasa producida (U l-1)/ sustrato consumido (g l-1), YE/P o actividad específica (U g-1) =Amilasa producida (U l-1) / proteína secretada (g l-1), YX/S (g g-1) = Biomasa formada (g l-1) / Sustrato consumido (g l-1), ΓE (U l-1 h-1) =Productividad volumétrica de amilasa, ΓX (g l-1 h-1) = Productividad volumétrica de biomasa, ΓE/X (U g-1 h-1)= Productividad volumétrica específica de amilasa. (2) (U l-1) (3) (U g-1)
Discusión:
de 400x se pudo determinar que la cepa
Del aislamiento de cepas, se eligió a la que
aislada se trata del hongo Aspergillus Aspergillus sp.
presentaba
hidrólisis,
Este es uno de los géneros más conocidos
debido a que esto sugiere que se trata de
y cuya capacidad de secretar enzimas
un microorganismo con alto potencial en la
amilolíticas ha sido previa y ampliamente
capacidad de producir enzimas. A través
estudiada. (Pandley, 2000). Sohail et al .
de la caracterización morfológica morfológica mediante
(2005), señala que el 75% de muestras
el uso del microscopio usando un aumento
aisladas del suelo pertenecen al género
mayor
halo
de
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Aspergillus Aspergillus y el 17% de los mismos
dirigir su metabolismo al crecimiento en
presenta actividad amilolítica.
lugar
de
producción
de
amilasas.
Adicionalmente, Adicionalmente, se ha reportado que el uso Al comparar el análisis de la productividad productividad
de fuentes de nitrógeno inorgánico como
en FS y FSS, se encontraron diferencias
nitrato de amonio presenta un efecto
entre los dos sistemas usados. Como
negativo en la producción de enzimas por
vemos en la Tabla 02, al comparar la
A. oryzae oryzae (Jin et
actividad específica (YE/P) de FS respecto
comparando
a la de FSS, se puede deducir que en el
enzimática (Γ (ΓE), así como la mayor
sistema FS se recuperó mayor cantidad de
concentración de proteínas secretadas al
producto
proteínico
actividad
medio en el sistema FSS con respecto al
amilolítica.
Respecto
actividad
sistema FS se explica según lo expresado
enzimática para FSS, la alta actividad
por Gutiérrez-Correa Gutiérrez-Correa et al. (2003) respecto
enzimática en términos de volumen en la
a lo anteriormente explicado respecto al
fermentación en sustrato sólido se ve
sustrato sólido. La diferencia obtenida se
apoyada por lo mencionado por Gutiérrez-
puede deber a que el sustrato sólido
Correa et al . (2003) al referirse al sustrato
empleado presenta mucha similitud al
sólido, donde se obtiene una mayor
sustrato que el género Aspergillus Aspergillus suele
concentración de productos, en esto caso
utilizar naturalmente para su crecimiento.
de enzimas amilolíticas. Investigaciones
En otras palabras, el hongo tiene un
anteriores confirman los resultados sobre
metabolismo que ya está preparado y
la producción de amilasas, donde se
especializado para el consumo de un
menciona que las ventajas del sistema
sustrato complejo (Hölker et al , 2004;
FSS ofrece sobre el desarrollo tradicional
Souza et al , 2010).
sin a
la
al .
la
1998). También
alta
productividad
son: altos rendimientos en cortos periodos de tiempo, mejor mejor circulación circulación de oxígeno, oxígeno,
Para la mayoría de α-amilasas α -amilasas producida
un ambiente natural parecido para hongos
por
filamentosos,
productividad
Aspergillus Aspergillus sp., sp., el intervalo de pH óptimo
volumétrica y alta producción de energía
se limita a 4.5-6.6 (Vihinen y Mäntsälä,
(Das et al . 2011).
1989), coincidiendo con el pH en que se
alta
microorganismos
de
la
especie
obtuvo esta enzima en el sistema FS, El valor de Yx/s =0.2879 g g-1 para FS se
encontrándose
aproxima al encontrado por Spohr et al .
producción
(1998), siendo este de 0.51 g g -1, en
evidencia de existencia de las enzimas
fermentaciones
operadas
amilolíticas, confirmando a su vez la alta
como fed-batch. De esto se puede concluir concluir
capacidad de los hongos del género
sumergidas
que el hongo Aspergillus Aspergillus sp fue capaz de
de
dentro esta
del
rango
enzima,
de
siendo
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Aspergillus Aspergillus para para la producción de amilasas
sorgo, y en la productividad de borregos.
(Buendía et al , 2003).
Agrociencia. Agrociencia. 37(4): 317-322. 3. Gutierrez-Correa, Gutierrez-Correa, M. y Villena, G.K.
Aún resulta difícil trabajar con aspectos
2003. Surface adhesion fermentation: a
relacionados a la fisiología y biología
new fermentation category. Rev. Per. Biol., Biol.,
molecular de los cultivos microbianos en
p. 113-124, vol. 10, No. 2.
FSS, debido a ciertas dificultades que se
4. Holker U., Hofer, y J. Lenz. 2004.
presentan tales como la posibilidad de
Biotechnological Biotechnological advantages of laboratory-
realizar una cuantificación de la biomasa
scale solid-state fermentation with fungi.
formada por la complejidad involucrada en
Applied Microbiology Microbiology and Biotechnology Biotechnology
dicho proceso. Ocurre lo mismo con otros
64(2): 175-186.
factores que nos permitirán entender el
5. Jin B., Van Leeuwen Leeuwen HJ, Patel B y Yu Q.
comportamiento individual en el sustrato
1998. Utilization of starch processing
sólido, a esto es o que todavía se hace
wastewater for production of microbial
referencia
biomass protein and fungal α-amylase by
como
biotecnología
de
lo la
oculto
de
la
fermentación
en
Aspergillus Aspergillus
oryzae. oryzae.
Bioresource
sustrato sólido (Hölker, U. et al, 2004).
Technology . Technology . 66(3): 201-206.
Para finalizar con esta discusión, cabe
6. Lowry, O. H.; Rosebrough, N.; Farr, A.
mencionar que el éxito de un proceso
and
industrial implica el minimizar los costos
measurement with the folin phenol reagent.
desde
J. biol. Chem 193, 265-275.
el
mismo
desarrollo
de
la
Randall,
R.
(1951)
Protein
fermentación enfocados hacia la variable
7. Miller, G. (1959). Use of Dinitrosalicylic
que determina el costo de producción, por
Acid
lo que el uso de esta tecnología FSS
Reducing Sugar. Analytical Chemistry,
tendría que ser evaluado considerando la
31(3), pp.426-428.
dificultad de su empleo a escala industrial
8. Pandley A., Nigam P., Soccol Soccol C.,Soccol
debido a las limitaciones en el control de
V., Singh D., Mohan R. 2000. Advances in
las condiciones
microbial amylases.
Reagent
for
Determination Determination
Biotechnol.
of
Appl.
Biochem. Biochem . (31), 135 – 135 – 152. 152. Bibliografía: 1. Barnett,
9. Sohail, M.; Ahmad, A.; Shahzad, S. y H.
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Hunter,
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(1998)
Khan, S. 2005. A Survey Of Amylolytic
Illustrated genera of imperfect fungi, 4th
Bacteria
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Bárcena,
of
And
Fungi
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Botany 37(1):155-161.
Native
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A.;
R.; Ortega, M.; Solís, J. y Lara, A. 2003.
Carlsen, M.; Nielsen, J. y Villadsen John.
Efecto de la glucoamilasa de Aspergillus Aspergillus
1998.
niger en la digestibilidad in vitro de vitro de maíz y
Recombinant Aspergillus oryzae during
tx-Amylase
Production
in
Laboratorio de Microbiología Industrial
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Fed-Batch and Continuous Cultivations.
industry - A review. Brazilian Journal of
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Vihinen, M. y Mäntsälä, P. P. 1989. amylolytic
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