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1. Tipos de electroforesis
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Existen principalmente dos métodos electroforéticos ampliamente utilizados electroforesis convencional y la electroforesis capilar. La primera se lle sobre papel o sobre un gel, en los que se aplica la muestra directamente. disolución tampón, que será el medio conductivo, cubre la capa de papel o Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a través de la Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe e la corriente y, si es necesario, las muestras se tiñen para visualizarlas. 1.1 Electroforesis de frente móvil o libre 1.2. Electroforesis de zona: • Electroforesis en papel • Electroforesis en gel
Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden en dos categorías: a) Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo) Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
○
PAGE en condiciones desnaturalizante
○
PAGE en condiciones no desnaturalizantes
○
SDS – PAGE
○
Isoelectroenfoque ○ Electroforesis en campos pulsantes ○
b) Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)
1.3 Electroforesis capilar 1.3.1 Electroforesis capilar de zona (CZE) 1.3.2 Electroforesis capilar en gel (CGE) 1.3.3 Isotacoforesis capilar (CITP) 1.3.4 Isoelectroenfoque capilar (CIEF) 1.3.5 Cromatografía electrocinética capilar micelar (MEKC)
Sign up to vote on this title Explicaremos ahora las electroforesis más comunes, utilizadas en laborator Useful Not useful
SDS – PAGE
○
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1 La gran mayoría de las proteínas son solubles en SDS. 2 Todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por lo el mismo sentido. 3 Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migració lo es y las electroforesis son muy rápidas. 4 La separación depende de un parámetro físico-químico, como es la masa mo que se puede calcular. 5 Los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente.
Figura: Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electroforetica de protei monomericas. En una proteina nativa de 25 KDa, carente de puentes disulfur tratamiento con SDS (_____) o con SDS + DTT (--------) producen identico r La proteina con un puente disulfuro intracatenario, en presencia de SDS se desnaturaliza parcialmente, manteniendo sin desplegar la zona que abarca e disulfuro. El tratamiento con SDS + DTT rompe el puente disulfuro y permit despliegue total de la proteina.
Isoelectroenfoque Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfóteros separan según su punto isoeléctrico (pI; pH al cual la carga neta de la pr nula) en un gradiente continuo de pH. En todos los métodos electroforéticos descritos anteriormente, la difusión fenómeno con efectos negativos, que tiende a ensanchar las bandas, disminu resolución. En el EEF el efecto de la difusión es mínimo y por ello posee You're Reading a Preview enorme resolución, pudiendo llegar a separar proteínas que difieran en 0.0 unidades de pI. Esto se debe a que si Unlock full una accessproteína with a free trial.focalizada en su pI se desplazase por difusión, adquiriría carga (positiva o negativa según hacia que difundiera) y por efecto del Download campo eléctrico volvería a la zona de su With Free Trial se llama efecto focalizante del EEF y es el responsable de su enorme resol Además, el EEF aumenta su resolución al disminuir el intervalo de gradient Por todo esto, el disponer de un gradiente estable de pH es lo esencial de para ello, se emplean compuestos anfóteros de bajo peso molecular llamados anfolitos portadores, que son pequeñas poliaminas (alrededor de 750 kDa) c abundantes grupos ácidos y básicos, con un pI que abarca desde 2.5 hasta 1 gran capacidad de tamponación cerca de su pI y con una gran solubilidad y conductividad. Sign up to vote thispróximo title Una disolución de una mezcla de estos anfolitos tendrán unonpH al p Useful Notde useful de los pI. Si esta disolución se emplea para la preparación un gel de poliacrilamida, al aplicar una diferencia de potencial cada molécula de an migrará hacia uno u otro polo en función de su carga, hasta alcanzar la zo ○
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1. Desventajas presentes en la electroforesis Desventajas en la e. con papel: • si el papel es fino se puede desgarrar con facilidad • si el papel es grueso, las bandas se distor sionan
• se produce iteración entre las proteinas y los grupos hidroxilos de la c
del papel, por lo tanto la migración se frena.
• Calidad del papel: 90% de alfa celulosa. Absorción de agua y conductivid
electrica. • Efecto electroosmotico anodo - cátodo(1)
Desventajas en la e. con acetato de celulosa:
• puede contener algunos grupos, como acido carboxilico y sulfato, que pro
fenómeno electroósmosis. Desventajas de la e. en gel: • El tamaño de los po ros y el radio de la molécula van a producir cierta
resistencia o friccio al movimiento de migración de la muestra en el gel. Desventajas de la e. en acetato de celulosa: • La tiras de acetato de celulosa tiene propiedades de adsorcion minimas,
que captan poco agua y son mas susceptibles a la evaporación que el papel. • Son tambien mas susceptibles al flujo electro - endosmotico (1)
You're Reading a Preview
Electroendósmosis (EEO). Es un fenómeno quewith se datrial. en algunos soportes (sob Unlock full access a free en los no restrictivos de tipo I), en los que aparecen cargas negativas, d grupos carboxilo o sulfato, al estar en contacto con una disolución iónica Download With Free Trial Al aplicar el campo eléctrico, los iones y las moléculas se desplazan segú carga, pero en su migración se encuentran con un flujo de cationes desplaz sobre la superficie del soporte y otro de aniones haciéndolo por el centro poros (figura 2.1). Este flujo orientado se llama flujo electroendosmótico va en contra de la resolución de una electroforesis, ya que las bandas de muestra se ensanchan y se distorsionan; sin embargo, la EEO contribuirá a resolución en las inmunoelectroforesis y en la electroforesis Sign up to vote on this title
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SDS – PAGE Permite el cálculo de parámetros moleculares, pues los complejos SDS-prote separan estrictamente según su tamaño molecular. El SDS interacciona con l proteínas formando complejos de características comunes independientemente de cada proteína. Las proteínas unen una molécula de SDS por cada dos amin lo que implica que las cargas propias de las proteínas quedan enmascaradas anuladas; asimismo, la molécula de SDS proporciona una carga negativa, por los complejos SDS-proteína están cargados negativamente de forma uniforme. Como se comentó, la movilidad electroforética en una PAGE es función del t de la carga por unidad de masa; como ésta es constante para todos los comp SDS-proteína, esta movilidad es solamente función de la masa molecular, es You're Reading a Preview cuanto menor sea la masa molecular de la proteína, mayor será la movilidad misma y viceversa. Unlock full access with a free trial. En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis más utilizada para el análisi proteínas debido a: Download With Free Trial 1 La gran mayoría de las proteínas son solubles en SDS. 2 Todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por lo el mismo sentido. 3 Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migració lo es y las electroforesis son muy rápidas. 4 La separación depende de un parámetro físico-químico, como es la masa mo que se puede calcular. 5 Los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente. Sign up to vote on this title ○
Useful Not useful de protei Figura: Efecto del SDS y del DTT en la movilidadelectroforetica monomericas. En una proteina nativa de 25 KDa, carente de puentes disulfur tratamiento con SDS (_____) o con SDS + DTT (--------) producen identico r
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resolución. En el EEF el efecto de la difusión es mínimo y por ello posee enorme resolución, pudiendo llegar a separar proteínas que difieran en 0.0 unidades de pI. Esto se debe a que si una proteína focalizada en su pI se desplazase por difusión, adquiriría carga (positiva o negativa según hacia que difundiera) y por efecto del campo eléctrico volvería a la zona de su se llama efecto focalizante del EEF y es el responsable de su enorme resol Además, el EEF aumenta su resolución al disminuir el intervalo de gradient Por todo esto, el disponer de un gradiente estable de pH es lo esencial de para ello, se emplean compuestos anfóteros de bajo peso molecular llamados anfolitos portadores, que son pequeñas poliaminas (alrededor de 750 kDa) c abundantes grupos ácidos y básicos, con un pI que abarca desde 2.5 hasta 1 gran capacidad de tamponación cerca de su pI y con una gran solubilidad y conductividad. Una disolución de una mezcla de estos anfolitos tendrán un pH próximo al p de los pI. Si esta disolución se emplea para la preparación de un gel de poliacrilamida, al aplicar una diferencia de potencial cada molécula de an migrará hacia uno u otro polo en función de su carga, hasta alcanzar la zo pI. Cuando se alcanza el equilibrio queda formado un gradiente de pH a lo gel. Si, debido a la difusión, los anfolitos abandonasen la zona de su pI, adquirirían carga y experimentarían el e fecto focalizante mencionado anter Una de las aplicaciones más importantes del EEF es el cálculo de pI (figur el pocillo I se aplican los marcadores de pI, y en el II la muestra (X) cu desea conocer. El carril III (sombreado) se emplea para determinar el grad pH. Una vez corrido el gel, se trocea el carril III y cada segmento (de introduce en 1mL de agua, determinándose su pH. Finalmente, se representa cada fracción, frente a su posición en gel. La distancia migrada por la mu You're Reading a Preview se interpola en la recta obtenida, determinándose así su pH. Unlock full access with a free trial.
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Figura: Determinación del punto isoelectrico de una muestra.
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