ELECTROFORESIS
La e l e c t r o f o r e s i se s un mé t o dodel a bo r at o r i oe ne lq ues eut i l i z auna c o r r i e nt e el éct r i cacont r ol adaconl afinal i daddesepar arbi omo mol ecul assegún su t ama mañoy c ar g ae l é c t r i c aat r a v é sdeunama mat r i zg e l at i no s a. Lagr anmay or í ademacr omo mol éc ul as est án car gadase se l é c t r i c ame nt e y ,ali g ualque l os el ect r ol i t os ,s e pueden cl asi ficar en f uer t es y débi l es dependi endo de l a c o ns t a nt e de i o ni z a c i ó n de gr upos áci dos y |bási cos.Por ej emp mpl ol os á c i do s nuc l e i c os s onpo l i ác i do sf ue r t e s . []
La separaci ón puede r eal i zar sesobr el a super fici e hi dr at ada de un sopor t e
s ól i do e j e mp mpl o:
El ectr of oresi satr avésdeunama m at r i zporosa(e ) , l e ct r o f or e s i se ng el El ect r of oresi sen acet enpapel ) at odec e l ul o sa,( El ectr of oresi sendi sol uci ón( el ectrof oresi sl i bre) .
De Dependi endodel at écni caqueseuse,l asepar aci ón obedeceen di st i nt amedi da al acar gael éct r i cadel asmo mol écul asyasu masa.
1. -ELECTROFOR ORESI SDEGEL. ectr of oresi sen gel La el esun gr upodet écni casemp mpl eadasporl osci ent í ficos par asepararmol éc ul asbasándosee npr opi edadesc omo moelt ama maño,l af or maoel punt oi s oe l é c t r i c o.Lae ae l e ct r of or e si s e ng e ls eut i l i z ag e ne r a l me nt econ pr o pó s i t o s anal í t i cos,per o puede ser una t écni ca pr epar at i va par a pur i ficar mol écul as par ci al ment e ant es de apl i car es pect r ome me t r í a de masas , PCR, c l o nac i ó n o s e c ue nc i a c i ó n deADN DN. l e c t r o f o r e s i s La pri mer apar t edelnomb mbre ,e ,s er e fie r eal af ue r z ael e c t r o mo mo t r i z
que es emp mpl eada par a despl azarl as mol écul as a t r avésdelgel .Alsi t uarl as
mo l é c ul ase ne lg e lyapl i c arunadi f e r e nc i adepo t e nc i ale l é c t r i c o ,l asmo l é c ul as se mue v en a di f er ent es v el oc i dades , haci a el cátodo, si es t án car gadas posi t i vament e, y haci a elánodo, s ie s t án car gadas neg at i v ament e( en una e l e c t r o f o r e s i s ,l o se l e c t r o do ss ec o mpo r t a ni g ua lq uee nunac ube t ael ect r ol í t i ca) . La se gunda par t edelnombr e,gel ser efier ea l amat r i zusadaparasepar arl as mol éc ul as.En muchos cas os un ge lesun pol í mer o ent r el az ado de por osi dad c ont r o l abl e .
PROCESO DE ELECTROFORESI S EN GEL EN ESTE CASO GELAGAROSA EN ELANALI SI SDELADN Laag a r o s ae sunpo l i s a cá r i do( o r i g i na l me nt eo bt e ni dodea l g a s ,c o moe la g ar a g ar ,pe r ode composi ci ón homogé nea) ,c uyas di sol uci ones ( t í pi cament e de 0. 5 a 2 %) pos ee nl a pr opi edaddeper manecerl i qui dasporenci made50gr adosC yf ormarun gel ,semi sól i do alenf ri arse.Est egelest a const i t ui do poruna mat ri zo t r ama t ri di mensi onaldefibr as pol i mér i cas embebi da en gr an cant i dad de medi ol í qui do,que r et ar da elpaso de l as mol éc ul as,se usa usual ment e para se parar mol éc ul as gr andes de al r ededor 20. 000 nuc l e ó t i do s
1)Fabri caci óndelgel : Ag r e g arl aag ar o s as ol i daaunf r as c o. Ag r e g are lbuffe rp ar adi s ol v e rl aag ar o s a. Col ocarelf r escoenelmi cr oondasporunt i empo. Ag r e g arl as ol uc i ó nal ac uba. Col o care lpe i nepar ahac e rl asc al l e s . De j ars ol i di fic aryl ue g oq ui t are lpe i nec onc ui dado .
2)Configur aci óndel acaj adeel ect r of or esi s: Po ne rs o l uc i ó nbuffe re nl ac aj adee l e c t r o f o r e s i s . Co l o c amo sl ac ubae nl as ol uc i ó na nt e r i o r .
3)Vi sual i zaci ón del amuest r adeADN enelgel : Tomarbufferdescar gaconunami cr opi pe t a. Mez cl arconl amues t r adeADN enuneppendor f .
Tomarest amezc l aconl ami cr opi pet ayvol carenunacal l edel acuba. Tomarconl ami cr opi pet a( conot r ot i p)l osSt andarddet amaño. Co l o c are s t as ol uc i ó ne nl a2dac al l e .
4)Conexi óndel acor ri ent eel éct r i caycor ri dadelgel : Enc huf arl osc abl e sdel ac aj adee l e c t r o f o r e s i s . Enc e nde re lapar at o( s eapl i c aunadi f e r e nc i adepo t e nc i al ) .
5)Ti nci óndelgelyanál i si sdel osr esul tados: Sequi t ae lg e ldel ac uba. Sei nt r o duc ee lg e le nunr e c i pi e nt el l e nodebr o mur odee t i di o . -Lue g odeunt i e mpos er e t i r ae lg e lye x po near a di a c i ó nUV. Sea nal i z a nl o sr e s ul t ado s.
Re v e l adoyv i s ual i z a ci ón Cuando se ha compl e t ado l a el ec t r of or es i s,l as mol éc ul as más pequeñas han l l eg ado al ánodo. Ent once s se pueden ' r ev el ar 'medi ant el a adi ci ón de un col or ant e es pec í fico par a hacer l as vi si bl es . Se empl ean compues t os como el br omur o de e t i di o,p ar al o sá c i do s nuc l e i c o s ,o t i nc i ó n fluor es ce nt e,par al as pro t eí nas.Asi mi smo se empl ean ot r osmét odosparavi sual i zarl a separ aci ón del a mezc l a e ne lg e l .Sie lr e ac t i v oe sfluo r e s c e nt eba j ol al uzUV,se puedesi mpl ement ehacerunaf ot ogr af í a del apl aca baj o di cha l uz .T ambi én,sil as mol éc ul as cont i enen át omos r a di ac t i v os s ep ue dee f e c t ua runaaut o r r a di o gr af í a . Lasbandasen di f er ent escal l esqueseencuent r an al ami smaal t ur acont i enen mol éc ul asquehan at r ave sado elge la l a mi sma v el oci dad.Exi st en mar cadore s es peci al esque cont i enen una mez cl a de mol éc ul as de t amaño conoci do.Sise haceunael ect r of or esi sdeunamez cl adesc onoci dayseagr egaunacal l econ un det er mi nado mar cador ,l as bandas obser vadas en el mar cador pueden ser compar adas con l as obt eni das en l a mez cl a desc onoci da par a det er mi nar su t amañoopunt oi soel éct ri co.Sabi endoqueeldespl azami ent odel asmol écul ases
pr opor ci onalall ogarí t model amasa,sepuedees t i marelpesomol ecul ardeuna mol écul adei nt er éscomparandol aconelpat r óndemi gr aci óndel osmar cador es.
PROBABI LI DADESDEERROR La el ect r of or esi sesunat écni camuysensi bl eypuedeseraf ect adapormuchos er r or es experi ment al es,como l at emper at ur a dur ant el a pol i mer i zaci ón y l a c or r i dade lg e l ,v e l o ci dad del apo l i me r i z a c i ó n,ni v e l e sdec at al i z a do r ,pur e z ade l r e a c t i v o ,t i e mpodec o r r i daypr e pa r a c i ó ndel a smue s t r as .
2. -ELECTROFORESI SEN PAPEL Esl at écni caenl aqueseempl eaelpapel comomedi odedi f us i ón.Es t at é c ni c a es t ál i mi t ada casit ot al ment e a se par aci onesde pequeñas mol éc ul as como l os ami noáci dos, pé pt i do s y nuc l e ó t i do s, y cas i si empr e se usan v ol t aj e s r e l at i v ame nt ea l t os . Es muy út i len l os l abor at ori os cl í ni cos por su f áci lmani pul aci ón y su f áci l desarr ol l o.Puedenhacers een t i r asdeacet at oocel ul osa,queson quí mi cament e máshomogé neasymást r anspar ent es . ElAc e t a t odeCe l ul o s as eut i l i z at a mbi é npa r as e pa r a rl i po pr o t e í na s .
PROCESO CONELECTROLI SI SDEPAPEL. Lamues t r aseapl i casobr eunat i r adepapeldefil t r o.Humedeci doconunasdos sol uci onest ampón,bi en en elcent r ooen cual qui er adel osext r emosdelpapel , dependi endo de l as sust anci as a se par arydel PH delt ampón.Los e xt r emos de l as t i r as se sumer gen en dos r eci pi ent es separ ados que cont i enen l a di sol uci ón t ampón yen l os cual es seconect an l osel ect r odos.Losi onesmi gr an al e l e c t r o dodec a r g ao pue s t a .
Est at ecni capuedeserc ombi nadaconl acr omat ogr af í aenpapel ,separándol osde acuer doasucargayasupol ari dad.Tambi énsepueder eal i zarunael ect r of or esi s en dos di mensi ones en l a cualse usan buffer co n di f er ent e pH par a cada di mensi ón.
NOTA: Un t a me z cl a en ampón, buffer, sol uci ón amort i guadora o sol uci ón r egul ador a es l concent r aci onesre l at i vament eel evadasdeun áci do débi ly su bas e conj ugada, e s de c i r ,s a l e s hi dr o l í t i c ame nt e act i vas.Ti enenl apr opi edaddemant enerest abl eelpH deunadi s ol uc i ó nf r e nt ea l a adi ci ón de cant i dadesre l at i vament epequeñasde áci dos o basesf uer t es.Cada si st ema buffer t i e nes upr o p i or a ng oe f e c t i v odepH,e lc ua lde pe nde r ád el ac ons t a nt edee qui l i br i o deláci doobase empl eado.Soni mport ant esenell aborat ori oyenl ai ndust ri a,yt ambi énenl aquí mi cadel avi da
Se conec t al os el ec t r odos a una f uent e de t ensi ón cont i nua y se apl i ca una di f e r e nc i apo t e nc i aldur ant ee lt i e mpoade c uado .Alapl i c arunac or r i e nt edi r e c t a, l asmol écul as car gadas del a mez cl a emi gr an haci al osel ect r odosdepol ari dad opues t as f or mando bandas de papel . La v el oc i dad de emi gr ac i ón de una mol écul a,dependepr ef er ent ement edesucar ga. Desvent aj as: •
Sie lpa pe le sfinos epue dede s g a r r a rc o nf a c i l i da d.
•
Sie lpa pe le sg r ue s ol a sba nda ss edi s t r o r s i o na n.
•
Sepr oducen i nt er acci on ent r el as pr ot ei nasy l os grupos hi dr oxi l os del a c e l ul o sadepape l ,po rl ot ant ol ami g r a c c i o ns ef r e na.
ELECTROFORESIS LIBRE
Si nl ug aradudas ,l af o r mamáss e nc i l l ader e al i z a runael e c t r o f o r e s i sc ons i s t ee n un t uboenf or made“ U”dondesei nt r oduceun el ec t r ol i t oyl amues t r aademás porsupuest o,del osdosel ect r odos.Alconect arelsi st ema l as macromol écul as comenzar án ami gr arporelt ubohaci aelpol oopuest oyasíi r án di f er enci ándose segúnsucarg a.Unodel osi nconveni ent esquepr esent aest at écni caesl aflui dez delmedi o,osea,l af aci l i dad con l aquel aspart í cul asdi f unden,demodoqueal
c or t arl ac o r r i e nt eno senc o nt r a r í amo sc o nl at e nde nc i anat ur a lale qui l i br i o ,c on l oquenohabr í amosl ogr adonada
