Determinación de la Actividad Enzimática La velocidad de una reacción catalizada por una determinada enzima es la medida de la llamada actividad enzimática, que puede ser equiparada en la práct ica a la cantidad de enzima. La actividad de una enzima se determina por medición de la velocidad de transformación del correspondiente sustrato. Esto puede hacerse midiendo la disminución de la concentración del sustrato, o midiendo el incremento de la concentración del producto de reacción (Díaz et al, 1997). Cada uno de los dos procedimientos permite, a su vez, otros dos procedimientos de medición: 1.
Medida en dos puntos, “reacción a punto final”. En ella todos los participante s en la reacción son incubados con el suero conteniendo las enzimas durante un periodo fijo, al cabo del cual se interrumpe la reacción enzimática, midiéndose bien la cantidad de sustrato no transformado, bien la cantidad de producto formado (Díaz et al, 1997).
2.
Medición continua, “método cinético”. La muestra conteniendo conten iendo las enzimas se incuba con todos los participantes de la reacción, midiéndose en intervalos de tiempo regulares la cantidad de sustrato no transformado o la cantidad de producto formado. En este caso la velocidad de reacción se determina con diversas técnicas y según diversos principios (Díaz et al, 1997).
El curso de una reacción enzimática en función del tiempo se observa en la figura 1. La velocidad de reacción (pendiente de la curva)
va
disminuyendo
asintóticamente y para las medidas enzimática
de se
actividad toma
la
velocidad inicial o la media en
Figura 1. Curso de una reacción enzimática
un tiempo corto de
reacción (velocidad media inicial). En el primer caso hay que trazar la curva y en el segundo basta con tomar dos puntos. Para una cantidad de sustrato en exceso, la velocidad inicial es proporcional a la concentración de la enzima (Primo, 1995) . El pH influye decisivamente decisivamente en la actividad enzimática; hay un valor óptimo y a mayor o menor pH la actividad decrece rápidamente, puesto que la enzima se puede desnaturalizar. Por eso, en los ensayos de actividad, el medio debe tamponarse cuidadosamente al pH óptimo, mismo que varía mucho de unas proteínas a otras (Primo, 1995). La temperatura influye de modo análogo en la actividad enzimática, y también hay una temperatura óptima. Esto se debe a que, en el tramo inferior, la velocidad de reacción aumenta con la temperatura (rama ascendente) pero, a partir de cierto punto, la enzima comienza a desnaturalizarse (rama descendente) (Primo, 1995).
Para medir la actividad enzimática se disuelve una cantidad conocida de la enzima pura, o de una preparación enzimática bruta en el tampón adecuado, junto con el sustrato en exceso y a pH y temperatura óptimas; el tiempo se empieza a contar cuando se juntan la enzima y los reactivos, y se termina en el momento en que se desnaturaliza aquélla por calentamiento rápido o por precipitación con TCA. Ahora es necesario disponer de un método analítico preciso para determinar el sustrato desaparecido o el producto formado; para ello hay técnicas variadas que frecuentemente aprovechan una reacción coloreada y una medida fotométrica, o utilizan un reactivo marcado con un átomo radiactivo. En la tabla 1 se dan unos pocos ejemplos de los métodos descritos (Primo, 1995). Tabla 1. Ejemplos de métodos para determinar actividades enzimáticas
Bibliografía Díaz, J., Fernández, M. y Paredes, F. (1997). Aspectos básicos de bioquímica clínica. Madrid: Díaz de Santos. Primo, E. (1995). Química orgánica básica y aplicada: de la molécula a la industria. Barcelona: Reverté.
