DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA Felipe Mora Restrepo -
[email protected] - Biología Brandom Camilo Mosquera Cadena -
[email protected] - Biología UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Bogotá - 14 de Septiembre del 2015
1. Hipótesis Se llevarán a cabo procesos para determinar la actividad enzimática en función del pH, la concen concentra tració ción n de la enzim enzima, a, la concen concentra tració ción n del del sustr sustrato ato y respe respecto cto a la presen presencia cia de inhibidores, por tanto se espera obtener datos que correspondan con lo esperado según la literatura.
2. Datos y Resultados Se trabajaron los siguientes reactivos con sus respectivas concentraciones: Concentración de KMnO4: 0,005 M Concentración de H2O2: 0,05 M Concentración de NaCN: 0,05 nM
Tabla #1. Efecto del pH sobre la actividad enzimática Tubo
KMnO4 gastados (mL)
H2O2 mL
Micromoles de KMnO4 gastados
Micromoles H2O2 iniciales
Micromoles H2O2 Residuales
Micromoles H2O2 descompuestas
Micromoles descompuestas/ min/mL enzima
1
5,90
2,0
30
100
75
25
10,0
1
8,50
2,0
42
100
105
-
-
2
7,50
2,0
38
100
95
5
2,0
2
7,40
2,0
37
100
92
8
3,2
2
8,05
2,0 2,0
40
100
100
0
0,0
3
7,50
2,0
38
100
95
5
2,0
4
6,50
2,0
32
100
80
20
5,0
6
8,10
2,0
40
100
100
0
0,0
6
7,00
2,0
35
100
88
12
4,8
Gráfica #1. Actividad enzimática en función del pH
Tabla #2. Efecto de la concentración del sustrato Tubo
KMnO4 gastados (mL)
Micromol es de KMnO4 gastados
H2O2 mL
Micromole s H2O2 iniciales
Micromoles H2O2 Residuales
Micromoles H2O2 descompuesta s
Micromoles descompuesta s/min/mL enzima
1
2,10
10,50
0,5
25
26
-
-
2
4,65
23,25
1,0
50
58
-
-
3
6,70
33,50
1,5
75
84
-
-
4
7,30
36,50
2,0
100
91
9
0,9
Tabla #3. Efecto de la concentración de la enzima (Datos tomados del grupo 12) Tubo
KMnO4 gastados (mL)
Micromoles de KMnO4 gastados
H2O2 ml
Micromol es H2O2 iniciales
Micromoles H2O2 Residuales
Micromoles H2O2 descompues tas
Micromoles descompuesta s/min/mL enzima
1
1,75
8,75
2,0
100
22
78
31,2
2
1,25
6,25
2,0
100
16
84
16,8
3
1,50
7,50
2,0
100
19
81
10,8
4
1,25
6,25
2,0
100
16
84
8,4
5
8,25
41,25
2,0
100
103
-
-
Gráfica #2. Actividad enzimática en función de la concentración de la enzima
Tabla #4. Efecto de inhibidores sobre la actividad enzimática (Datos tomados del grupo 2) Tubo
KMnO4 gastados (mL)
Micromoles de KMnO4 gastados
H2O2 ml
Micromoles H2O2 iniciales
Micromoles H2O2 Residuales
Micromoles H2O2 descompuestas
Micromoles descompuestas /min/mL enzima
1
1,70
8
2,0
100
20
80
8,0
2
1,00
5
2,0
100
12
88
8,8
3
2,70
14
2,0
100
35
65
6,5
Gráfica #3. Actividad enzimática en función de la cantidad de inhibidor
3.Cálculos Muestra de cálculos: ● Conversión de mL de reactivo a micromoles: ((Cantidad del reactivo mL) * (1L/ 1000 mL)) * (concentración de reactivo M (moles/L)) = moles de reactivo moles de reactivo*(micromol / 1*10^-6 moles) = micromoles de reactivo Ejemplo: (KMnO4 gastados (mL) * (1L/ 1000mL))) * Concentración de KMnO4 = moles de KMnO4 moles de KMnO4 * (1 micromol/ 1*10^-6 moles) = micromoles de KMnO4 (5,90 mL KMnO4 * 1L/ 1000mL) * 0,005 M = 3*10^-5 mol 3*10^-5 mol KMnO4 * (1/ 1*10^-6) = 30 micromol KMnO4
● Hallar la cantidad de H2O2 residual Teniendo en cuenta que la reacción que se lleva a cabo en la titulación es:
Por lo cual para calcular cuántas micromoles de H2O2 se descompusieron, se realiza el siguiente cálculo Micromoles de KMnO4 gastados * (5*10^-6 micromoles de H2O2 / 2*10^-6 micromoles de KMno4) = Micromoles de H2O2 Ejemplo: 30 micromol KMnO4 *(5*10^-6 micromoles de H2O2 / 2*10^-6 micromoles de KMno4) = 75
● Hallar la cantidad de H2O2 descompuesto Cantidad inicial de H2O2 - Cantidad residual de H2O2 = cantidad de H2O2 decompuesto Ejemplo: 100 micromol KMnO4 - 75 micromol KMnO4 = 25 micromol KMnO4
● Hallar Micromoles descompuestas/min/mL enzima (Micromoles descompuestas/tiempo transcurrido) / mL de enzima = Micromoles descompuestas/min/mL
Ejemplo: (25 micromol H2O2/ 5 minutos) / 0,5 mL enzima = 10 micromol / (min mL)
4. Discusión de resultados Según la gráfica de la actividad enzimática en función del pH, se observa como a un ph cercano a 4, trabaja con más eficiencia la enzima. Sin embargo la gráfica correspondiente debería poseer forma de una campana, en la cual se debería observar claramente el pH óptimo, que no necesariamente debe ser igual al pH intracelular. En nuestro caso la actividad enzimática de la catalasa no presenta un patrón claro, ya que su su pH óptimo es el mismo en el cual se comenzó la prueba y no nos permite ver que pasa con la enzima a pH inferiores. [1] [3] En la prueba de efecto de la concentración del sustrato en la actividad enzimática, los datos no permitieron elaborar una gráfica para ver el comportamiento de la enzima, ya que al momento de realizar los cálculos, los resultados mostraron incoherencias al dar más micromoles de sustrato que lo que se tenía inicialmente. De todas formas, según la literatura, las enzimas en función de la concentración del sustrato deben presentar una gráfica con comportamiento hiperbólico, donde la velocidad aumenta a medida que aumenta el sustrato y luego la velocidad se mantiene estable a pesar de que se aumente el sustrato.
[1] En la gráfica correspondiente a la actividad enzimática en función de la concentración de la enzima, se ve un comportamiento inversamente proporcional, sin embargo este resultado es ilógico, ya que a mayor cantidad de enzima, debería aumentar su velocidad enzimática, lo cual debe verse representado como una función lineal, es decir, directamente proporcional.
[1] La actividad enzimática en función de la cantidad de inhibidor presenta un comportamiento ligeramente inverso, por lo cual a mayor cantidad de inhibidor, menor actividad enzimática. Sin embargo el comportamiento debería ser mucho más marcado y no una pequeña curva, sino una línea recta con pendiente negativa [1]
5. Cuestionario ● En la práctica usted estudió algunos factores que afectan la actividad de la enzima, ¿qué otros factores tendría que evaluar para completar el estudio cinético de la catalasa? La temperatura y la presencia de cofactores enzimáticos. Las temperaturas extremas afectan la velocidad de la reacción debido a la naturaleza de las proteínas, aunque se puede hablar de temperaturas donde la actividad de la enzima es máxima.
La presencia adecuada de cofactores enzimáticos ayuda también a que se lleve a cabo la reacción, pues la enzima sin estos no puede funcionar. [2]
● Realice una comparación entre la acción de la catalasa con la acción de la peroxidasa Tanto la catalasa como la peroxidasa tienen un comportamiento similar en cuanto a la forma del crecimiento de actividad enzimática. Cuando la concentración del sustrato es variable, ambas presentan un crecimiento aparentemente parabólico y llegan a un máximo de actividad enzimática, pero hay una diferencia significativa y es que el máximo de actividad enzimática de la catalasa (40 mM) es superior al de la peroxidasa (10mM). [3]
● ¿Cúal es el papel del H2SO4 en esta práctica?¿Por qué no se aplica al tiempo con los demás reactivos? - El H2SO4 se utiliza para desnaturalizar la enzima alterando el sitio activo de la enzima. Esto se logra bajando el pH por acción del ácido sulfúrico. [4] ● ¿Se podría sustituir el ácido sulfúrico por otro reactivo como el hidróxido de sodio (NaOH)? Justifique su respuesta - Si se podría sustituir ya que generalmente las enzimas se desnaturalizan a pH extremos, por lo cual al agregar NaOH, el pH aumentaría drásticamente logrando desnaturalizar la enzima haciendo que detenga su actividad enzimática. [5]
● ¿Qué pruebas adicionales tendría que realizar para determinar si esta es una enzima michaeliana o alostérica? Justifique su respuesta ● No se requieren de más pruebas además de la de actividad enzimática en función de la concentración del sustrato. Esto se debe a que las enzimas michaelianas siguen un crecimiento hiperbólico en el cual las moléculas se modifican en mayor o menor medida según sea la concentración del sustrato, mientras que las alostéricas siguen un crecimiento sigmoidal (en forma de S) a causa de sus interacciones con sus múltiples subunidades y sitios activos. [6]
6. Conclusiones ● Desafortunadamente los resultados no fueron los esperados en ninguna prueba, esto pudo ser resultado de errores experimentales ya que tocaba tener mucho cuidado con las condiciones en las que se debía mantener la enzima (principalmente en frio), ademas de que en la prueba para ver la velocidad de la enzima en función del pH, cada grupo manejó una muestra de catalasa diferente, lo que significaba que cada parte de la prueba presentaba condiciones diferentes para cada tubo y no permitió realizar comparaciones precisas.
7. Bibliografía 1. Academia, Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de la catalasa, consultado a través de: http://www.academia.edu/7135676/EFECTO_DEL_PH_Y_TEMPERATURA_SOBRE_LA_A CTIVIDAD_DE_LA_CATALASA 2. Universidad Nacional Abierta y a Distancia, Factores que afectan la actividad enzimática, consultado a través de: http://datateca.unad.edu.co/contenidos/200002/MODULO%20SISTEMAS%20METABOLIC OS%20NUTRICIONALES/leccin_8_factores_que_afectan_la_cintica_enzimtica.html 3. Castro JA, Baquero LE, Narváez CE, Catalasa, Peroxidasa y Polifenoloxidasa de pitaya amarilla (Acanthocereus pitajaya), consultado a través de: http://www.redalyc.org/pdf/3090/309026667004.pdf 4. Portafolio electronico Biología, Catálisis de Enzimas, consultado a través de: https://sites.google.com/site/portafolioelectronicobiologia/home/laboratorio-2-catalisis-de-enz imas 5. Curso de Biomoléculas, Regulación de la actividad enzimática, consultado a través de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#ph 6. Curso de Biomoléculas, Actividad enzimática, consultado a través de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#e