Bioquímica, Departamento de Ciencias Básicas
CINETICA ENZIMATICA
Fernando Castillo Vania Cortes Aleander !i"arro #aren $a%areses Escuela de #inesiolo&ía, 'ni%ersidad $anto Tomás Docente a car&o( B)* +odri&o Caldern Fec-a reali"acin ./01102.13 Fec-a de entre&a 1201102.13
INTRODUCCIÓN Las enzimas son consideradas como las estructuras proteicas fundamentales para la regulación de las reacciones químicas en los distintos sistemas biológicos, que actúan como catalizadora, acelerando la reacción uniendo sus sustratos en el cent centro ro acti activo vo o cata catalílítitico co,, actu actuand ando o dism dismin inuy uyend endo o la ener energí gía a de acti activa vaci ción ón aumentando la velocidad de reacción, proporcionando un ambiente específico dentro del cual una reacción determinada puede transcurrir a mayor velocidad. Debido a su alto grado de especificidad respecto a su sustrato y al gran poder catal catalít ític ico o que que esta estass tiene tienen, n, las las enzi enzima mass son especí específificas cas para para cada cada tipo tipo de reacción. En la catálisis, las enzimas participan de distintas reacciones sin alterar el equilibrio equilibrio de las mismas y aceleran aceleran procesos biológicos biológicos que tienden tienden a ser muy lent lentos. os. Las Las enzi enzimas mas requ requie ieren ren de la part partic icip ipac ació ión n de otras otras mol molcu cula lass más más peque!as como las coenzimas "biotina, #$D%, entre otras& o iones metálicos llam llamad ados os cofac cofacto tores res.. $demás demás de pequ peque!a e!ass coen coenzi zima mass que ayuda ayudan n en los los procesos metabólicos, los factores que influyen el funcionamiento de las enzimas son el p%, tempera temperatur tura, a, in'ibi in'ibidore dores(a s(acti ctivad vadores ores,, concent concentrac ración ión de enzima enzima y ")& sustrato . De esta esta mane manera ra 'ace 'ace comp compat atib ible less esta estass reac reacci cion ones es a las las velo veloci cidad dades es del organismo, de lo contrario las reacciones tardarían más de lo requerido por los organismos organismos biológicos. biológicos. Estas enzimas enzimas pueden perder su actividad actividad catalítica catalítica si se desnaturalizan o si se disocia una enzima en sus subunidades, su actividad tambin se puede ver modificada por factores como la concentración de enzima o sustrato, las condiciones de p%, la temperatura y la presencia de in'ibidores. Las Las enzi enzima mass se pued pueden en clasi clasififica carr segú según n su func funció ión n en* en* + +id idorr orred educ ucta tasa sas, s, trans transfe fera rasas sas,, 'idro 'idrola lasa sas, s, lias liasas, as, isom isomer eras asas as y liga ligasas sas.. -iend -iendo o la cin cintitica ca enzimática es la principal y más antiguo mtodo para estudiar el mecanismo de una reacción catalizada enzimáticamente. onsiste en determinar la velocidad de la reacción y el modo en que sta se modifica en respuesta a cambios en los parámetros eperimentales. /na de las enzimas con mayor importancia en el organismo es la catalasa, esta 'emo proteína que se encuentra en las clulas del torrente sanguíneo, 'ígado y ri!ó ri!ón. n. 0ose 0osee e una una activ activid idad ad de tipo tipo oido oidorre rredu duct ctada adasa. sa. La catal catalas asa a tien tiene e la 'abi 'abililida dad d de usar usar peró peróido ido de 'idró 'idróge geno no para para oid oidar ar toi toina nas, s, incl incluy uyen endo do el "1& metanol, etanol, formalde'ido y nitrito . -u función principal es catalizar la detoificación de las clulas de un compuesto formado por el metabolismo aeróbico el peróido de 'idrogeno. Esta reacción ocurre espontáneamente dentro del organismo pero gracias a esta enzima lo realiza con una mayor velocidad de reacción, oidándolo y descomponindolo a agua y oígeno. Este compuesto es altamente reactivo el que puede provocar da!o celular que proviene de la peroidación de lípidos que conducen a la rotura de la membrana eritrocitaria y la oidación de proteína y D#$.
OBJETIVOS +b2etivos generales* • •
3ealizar la obtención de la enzima catalasa +bservar como los distintos factores afectan e inciden en la actividad de la reacción en la enzima
+b2etivos específicos*
•
•
$nalizar el comportamiento de la catalasa con distintos factores "0%, temperatura, concentración de la enzima e in'ibidor& Determ Determina inarr las veloci velocidad dades, es, porcent porcenta2e a2ess de in'ibi in'ibició ción n de la enzima enzima ya epuesta a los factores que modifican su actividad.
HIPÓTESIS El p%, la temperatura, la concentración de enzima y la presencia de un in'ibidor "#4&, producen que la actividad catalítica de la enzima se vea disminuida por efecto de aquellos factores. 0or ello suponemos que la catalasa reaccionará me2or a 0% fisi fisiol ológ ógic ico o que que a 0% etr etremo emo,, dism dismin inuy uyend endo o su rendi rendimi mien ento to.. $ mayor mayor concentración de sustrato a una temperatura corporal de 567 y el in'ibidor aumentará eponencialmente.
MATERIALES Y MÉTODOS -e traba2ó con cuatro eperiencias que fueron* efectos de la concentración de enzimas, efectos de la temperatura, efectos del p% y efectos del in'ibidor %#.
Materiales:
Lanceta estril,
0ipeta graduada,
Mét!s:
0ipeta 0asteur,
9ureta graduada,
8atraz Erlenmeyer,
En primer lugar se debe enfriar 1: ml agua destilada destilada en un tubo de ensayo. ensayo. 0ara obte obtene nerr la cata catala lasa sa se debe debe 'ace 'acerr una una pequ peque! e!a a punc punció ión n con con una una lanc lancet eta a esterilizada en el dedo índice, la primera gota se des'ec'a y posteriormente "apro :.;ml& se recolecta el resto en la pipeta 0asteur en el tubo de ensayo con agua destilada fría.
"# E$e%t E$e%t !e !e la %&%e& %&%e&tr tra%i a%i'& '& !e e&(i) e&(i)a# a# -e procede a enumerar los matraces de Erlenmeyer del ) al ;, se les agregaron ;mL de %1+1 a cada uno, el n7) fue el matraz de control por lo tanto no llevo enzima. $ los demás "14;& se le agregó :.)< :.1< :.5< :.= mL respectivamente de la prepa preparac ració ión n de enzi enzima ma obten obtenid ida a de la sang sangre. re. Lueg Luego o de un minu minuto to de 'abe 'aber r agregado la enzima se adicionan ; mL de % 1-+= 18 para detener la reacción enzimática. $l finalizar esto, se titularon los matraces con >8n+= :,:;8 y se concluyó la eperiencia.
*# E$e%t E$e%t !e la te)+er te)+erat, at,ra# ra# En esta eperiencia se necesitó de ? matraces de Erlenmeyer los cuales se enumeraron en series de dos "$49&, en cada uno se colocó ;mL de sustrato % 1+1, todos los matraces poseen enzima, siendo la serie @$A los controles, luego se epusieron a diferentes casos< -erie )* a B7 "en 'ielo&, -erie 1* Cemperatura ambiente de );7, -erie 5* a 5B7, -erie =* a ;:7.v0osterior a esto a la serie @9A se le agregó :.;mL sin ser epuesto al medio, al 'aber pasado un minuto de 'aber agregado la enzima se adiciona ; mL % 1-+= 18. Los matraces van a ser retirados de la temperatura en la que se encuentran y serán titularlos con solución >8n+ = :,:; 8.
-# E$e% E$e%t tss !el !el +H# +H# En el caso del p% se utilizó ): matraces de Erlenmeyer, fueron enumerados en par del ) al ; "$49&, se puso en cada uno ;mL de % 1+1 :,1=, con diferentes p%* -erie )* p% 5, -erie 1* p% ;, -erie 5* p% 6, -erie =* p% , -erie ;* p% )) Los matraz @$A fueron los de control por lo tanto lo llevaron enzima y se les agregó ; mL de % 1-+= 1 8. $ los matraces matraces @9A :,; mL del sustrato "catalasa&, "catalasa&, un minuto minuto despus eactamente se le agregó ; mL de % 1-+= 1 8 para detener la reacción enzimática, finalmente los matraces se titularon con >8n+ =.
.# E$e%t E$e%t !el i&/i0i i&/i0i!r !r 1CN# 1CN# En este caso fueron enumerados ; matraces matraces de Erlenmeyer, Erlenmeyer, siendo< 8atraz n7)* ont ontro rol. l. 8at 8atraz raz n71* n71* ont ontrol rol sin sin in'i in'ibi bido dorr. 8at 8atraz raz n75, 75, =, ;* lleva levaro ron n conce concent ntra raci cion ones es creci crecien ente tess del del in'i in'ibi bido dorr "># :,:: :,:::)8 :)8,, :,:: :,::)8 )8 y :,:) :,:)8 8 respectivame respectivamente&. nte&. $l matraz n7) se le adicionó adicionó inmediatamente inmediatamente ; mL de % 1-+= 18, y a los matraces 1,5 ,= y ; se les agregó :,; mL de enzima, luego luego se detiene la reacción al minuto con ; mL de % 1-+= 18. Finalmente se titulan los matraz con solución >8n+= :,:; 8.
0ara 'acer el cálculo cálculo de las velocidades velocidades tenemos los mL de todos los matraces y tenemos los moles remanentes del primer matraz que eran 5;:, se 'ace una regla de tres simples, donde los 5;: moles van a equivaler a los primeros mL gastados y los mL gastados del segundo matraz van a equivaler a los moles remanentes del segundo matraz, y a'í nos da moles remanentes y con eso se puede sacar la velocidad restándole los moles iniciales menos los moles remanentes de cada matraz y con eso se obtiene la velocidad. 0ara calcular el porcenta2e de in'ibición se saca primero la velocidad igual que en el paso anterior, el primer valor de velocidad equivale al ):: de actividad enzimática, por lo que el segundo valor de velocidad equivale a el valor de actividad del segundo matraz y para sacar el porcenta2e de in'ibición se resta a ):: el porcenta2e de actividad que daba como resultado de la regla de tres simples.
RESULTADOS
E4ecto de concetracion
omo muestra la figura número ), a medida que aumenta la concentración de sustrato, la velocidad enzimática aumenta 'asta llegar a su Gma.
Fi&ur i&ura a n5me n5merro 1, e4ec e4ecto to de la concen concentra traci cin n o6teni o6tenidos dos en el
Ta0la Ta0la !e !ats !e %&%e&tra%i'& N2
)L !e H*O* +H 3 45*.6
"
;
7)les i&i%iales !e H*O* 5;:
)L !e e&(i)a
)L !e H*SO. *N
:
;
)L !e 1M&O. 8asta!s
12,3
7)les !e H*O* re)a&e&tes 5;:
7)les !e H*O* 9,e rea%%i& HHH
Vel%i!a! 7)les H*O* ;)i&< ;)i&< HHH
* . =
; ; ; ;
5;: 5;: 5;: 5;:
:,) :,1 :,= :,;
; ; ; ;
5),1 1B,? 1;:,B 111,B
11,7 1.,8 9,:3 ;,:3
Fi&ura n5mero 2, e4ecto de la temperatura o6tenidos de los
5:,? ;5,1 ,= )16,=
5:,? ;5,1 ,= )16,=
Fi&ura n5mero /, e4ecto de la temp temper erat atur ura a opti optima ma se&5 se&5n n
E4ecto temperatura
Ta0la Ta0la !e !ats !e te)+erat,ra N2
)L !e H*O* +H 3 45*.6
"> "B *>
; ; ;
7)les i&i%iales !e H*O* 5;: 5;: 5;:
)L !e e&(i)a
)L !e H*SO. *N
: :,; :
; ; ;
)L !e 1M&O. 8asta!s )= ,5 )5,B55
7)les !e H*O* re)a&e&tes 5;: 151,; 5;:
7)les !e H*O* 9,e rea%%i& HHH ))6,; HHH
Vel%i!a! 7)les H*O* ;)i&< ;)i&< HHH ))6,; HHH
*B -A -B .A .B
; ; ; ; ;
5;: 5;: 5;: 5;: 5;:
:,; : :,; : :,;
; ; ; ; ;
6,?; )1,?55 6,= )5,1
1:),;55:=; 5;: 1:),?15=1= 5;: 15?,B5B5B=
)=?,=BB;; HHH )=?,)6B;6B HHH ))),5B5B5B
)=?,=BB;; HHH )=?,)6B;6B HHH ))),5B5B5B
@El p% óptimo o intervalo de p% de cada enzima es diferente y cuando varía, la conformación de la enzima se altera, producindose un cambio en el estado de ionización de grupos del sitio activo y llegando a no ser funciona
E4ecto de p=
A "=& "Le'ninger, 1::B&
Ta0la !e !ats !e +H N2 "A "B *A *B -A -B .> .B => =B
)L !e H*O* +H 3 45*.6 ;.4 p%I5 ;.4 p%I5 ;.4 p%I; ;.4 p%I; ;.4 p%I6 ;.4 p%I6 ;.4 p%I ;.4 p%I ;.4 p%I)) ;.4 p%I))
7)les i&i%iales !e H*O* 5;: 5;: 5;: 5;: 5;: 5;: 5;: 5;: 5;: 5;:
)L !e e&(i)a
)L !e H*SO. *N
: :,; : :,; : :,; : :,; : :,;
; ; ; ; ; ; ; ; ; ;
)L !e 1M&O. 8asta!s )5,) )1,) )) 6,15 )5 ?,; )),65 6,; :, :,B
7)les !e H*O* re)a&e&tes 5;: 515,1?1==16 5;: 15:,:=;=;=; 5;: 11?,?=B);5? 5;: 115,6?;)BB1 5;: 155,5555555
7)les !e H*O* 9,e rea%%i& HHH 1B,6)6;;65 HHH )),;=;=; HHH )1),);5?=B HHH )1B,1)=?5= HHH ))B,BBBBB6
Vel%i!a! 7)les H*O* ;)i&< ;)i&< HHH 1B,6)6;;65 HHH )),;=;=; HHH )1),);5?=B HHH )1B,1)=?5= HHH ))B,BBBBB6
$l aumentar la concentración de in'ibidor dor la velocidad dismi isminu nuyye alca alcanz nzan ando do su punto de in'ibidor competitivo.
E4ecto E4ec to In In-i6id -i6idor or
Ta0la Ta0la !e !ats !e i&/i0i!r N2
)L !e 1CN 45444" M 4 4
)L !e 1CN 4544" M
)L !e 1CN 454" M
)L !e e&(i)a
)L !e H*SO. *N
" *
)L !e H*O* 45*.6 p%I6 ; ;
)L !e 1M&O. 8asta! s
7)les H*O* re)a&e&te
Vel%i!a! 7)les H*O* ;)i&< ;)i&<
6 !e i&/i0i%i'&
4 4
4 4
: :,;
; ;
1/,73 ;,.3
;
:,33
4
:,;
;
12
HHH )BB,;=16; ) ):), ):),=? =?B B? ? 56,6515=1
HHH :
:,;
5;: )?5,=;61= 1=?,; =?,;)5 )5:) :)) )
-
;
:,;
4
4
.
;
4
:,;
=
;
4
4
:,;
:,;
;
12,;3
5)1,1B6B; ? 55),6?=5? 6
)?,1);B)5 =
DISCUSIÓN Las enzimas tienden a funcionar dependiendo el medio en el que se encuentren, además del tipo de reacción que deban catalizar. La concentración de sustrato, se determinó que mientras más alta sea la concentración de esta, la velocidad de reacción será mayor y la enzima funcionará de manera más efectiva, pero a medida que la concentración de sustrato sea mayor, la enzima tardará más tiempo en reaccionar, ya que al 'aber una mayor cantidad de sustrato, tiene que tener
5,:6 66,5= ?,:B
una mayor capacidad de catalizar esta, el punto máimo a alcanzar seria en teoría su Gma en donde el sitio activo estaría completo con sustrato. En el caso de la catala catalasa, sa, al ser una enzima enzima present presente e en la sangre, sangre, se pensaría que su p% óptimo alcanzaría un rango de 6, pero la realidad es que su p% óptimo estaría rodeando los 6 a , no obstante, en los valores de p' restantes la actividad disminuyo siendo 5 y )) en donde la curva cayo totalmente, que fue en donde la la enzima perdió su estructura 5D, , la velocidad de reacción que se 'alló a p% 6 fue de )),;=;=; umoles% 1+1(min< Dando así a conocer que nuestra 'ipótesis era orrecta, y la actividad enzimática de la catalasa es más efectiva a p% fisiológico, La estabilidad que presenta el peróido frente a p% )) se debe que las soluciones sin contaminar de peróido de 'idrógeno, son lo más estables a p% ligera ligeramen mente te más ácido ácido que el valor de p% natural natural 6 según según -later* -later* ”Estudió los datos relativos a la velocidad de descomposición de la solución de peróxido de hidrógeno al 3%, viendo que aumentaba cuando se la volvía más alcalina con hidróxido sódico, si bien luego mostró cómo este efec fecto disminuía cons consid ider erab able leme ment nte e si se le añad añadía ía de form forma a simi simila larr sili silica cato to sódi sódico co Este Este comp compor orta tami mien ento to se expl explic ica a debi debido do a la acci acción ón esta estabi bili li!a !ant nte e del del sili silica cato to,, probablemente e"ercida e"ercida frente al agente catalítico responsable de de dicho aumento de descomposición” #$(E. Trabal 2004)
En cuanto a los resultados resultados obtenidos obtenidos en los porcenta2es porcenta2es de in'ibición in'ibición están acorde a nuestros conocimientos y referencias. $l aumentar la concentración de in'ibidores es correcto que aumente el porcenta2e de in'ibición de la enzima. Esto se eplica en el caso de la enzima catalasa y su in'ibidor el ># porque el # actúa como in'ibidor competitivo unindose al 'ierro presente en los grupos 'emo de esta 'emoproteJna in'ibindola así de forma competitiva en su sitio activo, 'asta alcanzar su la saturación del mismo. /n dato importante a discutir es donde los resultados obtenidos en el practico sobre la actividad del efecto de la temperatura en donde el grafico representado "Fig. 1& no presenta datos posibles a discutir según la literatura, según a nuestro criterio esto se debe a la calidad de los reactivos y el mal mane2o de los procedimientos en laboratorio lo que conllevaría a tal error, pero según la literatura podemos emplear el grafico de acción de una literatura "Fig5& en donde según Len' Len'in inge gerr est esto se exp explica &'ad &'ada a en!i en!ima ma tien tiene e una una temp temper erat atur ura a ópti óptima ma de actuación (or deba"o ) por encima de esta temperatura, la en!ima ralenti!a la veloci velocidad dad de la reacci reacción ón en!imá en!imátic tica a *e observ observa a que que mucha muchas s de las en!ima en!imas, s, dupl duplic ican an la velo veloci cida dad d de una una reac reacci ción ón en!i en!imá máti tica ca cuan cuando do se aume aument nta a la temperatura de unos +- ' aproximadamente ) luego cae mu) rápidamente por encima de los $- '” #3 #.ehninger, /0
CONCLUSIÓN La actividad catalítica es bastante comple2a y se pudo evidenciar en la eperiencia que fue realizada en el laboratorio, donde las variaciones de las condiciones óptimas van a influir de manera significativa en los resultados de su desempe!o catalítico.
abe destacar el importante rol que cumple la catalasa y lo indispensable que son las enzimas a nivel biológico, ya que eisten mínimas condiciones que van a cambiar su acción como el p%, temperatura, concentración de enzimas e in'ibición enzimática, stas producen un efecto llamado velocidad catalítica la cual va a aumentar, disminuir o mantenerse la actividad catalítica dependiendo del factor que se está modificando.
CUESTIONARIO "# ?Pr ?Pr 9,é 9,é se +,e! +,e!ee 0te 0te&e &err %a %ata tala lasa sa al a8re a8re8a 8arr sa&8r sa&8ree s0r s0ree a8,a a8,a !estila!a@ La cata catala lasa sa se encu encuen entr tra a dent dentro ro de los los erit eritro roci cito tos, s, al some somete terr una una pequ peque! e!a a muestra de sangre sobre agua destilada, estos glóbulos ro2os producen 'emolisis debido a la diferencia de las concentraciones intra y etra celulares en un medio 'ipotónico lo que produce la liberación de la enzima catalasa en el medio, es decir, las clulas al eponerse al agua destilada @eplotanA y liberan su contenido celular al medio.
*# ?C,l es la i)+rta&%ia !e la +rese&%ia !e %atalasa e& las %él,las@ La catalasa es la enzima responsable de la descomposición del peróido de 'idrógeno, el cual es un compuesto tóico "en oígeno y agua&. atalasa participa en la prot protec ecci ción ón y mant manten enim imie ient nto o del del bala balanc nce e oid oidan ante te(a (ant ntio ioi ida dant nte e del del metabolismo celular. Descompone el peróido de 'idrógeno y % 1+1, obteniendo agua. Debido a que el peróido de 'idrogeno es fuertemente oidante. 0or esta razón la sangre y el 'ígado de los mamíferos contienen la enzima catalasa que cataliza la descomposición de compuestos oidantes.
-# ?,é +asara si & /,0iera %atalasa %atalasa +rese&te e& las %él,las@ I&esti8,e si eiste& %&!i%i&es as%ia!as a ,&a !e$i%ie&%ia !e %atalasa La catalasa tiene un efecto antioidante, por lo cual disminuye los radicales libres y la deficiencia de esta, se denomina $catalasia o acatalasemia. 0or lo cual, cuando se presenta la $catalasia se caracteriza por la ausencia de actividad de la cata catala lasa sa en los los erit eritro roci cito tos, s, lo cual cual está está asoc asocia iado do con con las las lesi lesion ones es oral orales es ulce ulcera rant ntes es(g (gan angre greno nosas sas,, pudi pudien endo do prod produc ucir ir la prd prdid ida a de dient dientes es y grav graves es destrucciones de los mailares y regiones blandas que los cubren.
.# ?C,l es el e$e%t 9,e tie&e el %ia&,r CN< e& la a%tii!a! !e la %atalasa@ ?E& 9,é se $,&!a)e&te esta a%%i'&@ El cianuro corresponde a un in'ibidor competitivo de la catalasa. Este in'ibidor se une a l Fe K1 presentes en la molcula de la catalasa, lo que causa la in'ibición completa de esta es decir, la actividad enzimática se bloquea por completo desde su sitio sitio activo activo.. 0or consecue consecuenci ncia a impide impide la activi actividad dad enzimá enzimátic tica. a. $demá $demás, s, el cianuro in'ibe la cadena transportadora de electrones en la mitocondria, ya que al unirse al citocromo $5, bloque el metabolismo aeróbico de ella que lo lleva finalmente a la asfiia.
BIBLIOFRAGA ")& 0rincipios de 9ioquímica, Le'ninger, 1::;. "1& 9ioquímica. Fundamentos para 8edicina y iencias de la Gida , erner 8Mller4 Esterl "5& LE%#N#OE3, $., #EL-+#, D., +H, 8., 0rincipios de 9ioquímica, =P Edición, Ed. +mega, 9arcelona, 1::B, p. 1)1. "=& E, C. "1::=&. upcommons. +btenido de 'ttp*((upcommons.upc.edu(bitstream('andle(1:(B:=)($rticle:5.pdfQsequenceI)
