Determinación de La Actividad de La Catalasa

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA Felipe Mora Restrepo - [email protected] - Biología Brandom Camilo Mosquera Cadena - [email protected] - Biología UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Bogotá - 14 de Septiembre del 2015

1. Hipótesis Se llevarán a cabo procesos para determinar la actividad enzimática en función del pH, la concen concentra tració ción n de la enzim enzima, a, la concen concentra tració ción n del del sustr sustrato ato y respe respecto cto a la presen presencia cia de inhibidores, por tanto se espera obtener datos que correspondan con lo esperado según la literatura.

2. Datos y Resultados Se trabajaron los siguientes reactivos con sus respectivas concentraciones: Concentración de KMnO4: 0,005 M Concentración de H2O2: 0,05 M Concentración de NaCN: 0,05 nM

Tabla #1. Efecto del pH sobre la actividad enzimática Tubo

KMnO4 gastados (mL)

H2O2 mL

Micromoles de KMnO4 gastados

Micromoles H2O2 iniciales

Micromoles H2O2 Residuales

Micromoles H2O2 descompuestas

Micromoles descompuestas/ min/mL enzima

1

5,90

2,0

30

100

75

25

10,0

1

8,50

2,0

42

100

105

-

-

2

7,50

2,0

38

100

95

5

2,0

2

7,40

2,0

37

100

92

8

3,2

2

8,05

2,0 2,0

40

100

100

0

0,0

3

7,50

2,0

38

100

95

5

2,0

4

6,50

2,0

32

100

80

20

5,0

6

8,10

2,0

40

100

100

0

0,0

6

7,00

2,0

35

100

88

12

4,8

Gráfica #1. Actividad enzimática en función del pH

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Tabla #2. Efecto de la concentración del sustrato Tubo

KMnO4 gastados (mL)

Micromol es de KMnO4 gastados

H2O2 mL

Micromole s H2O2 iniciales


Micromoles H2O2 descompuesta s

Micromoles descompuesta s/min/mL enzima

1

2,10

10,50

0,5

25

26

-

-

2

4,65

23,25

1,0

50

58

-

-

3

6,70

33,50

1,5

75

84

-

-

4

7,30

36,50

2,0

100

91

9

0,9

Tabla #3. Efecto de la concentración de la enzima (Datos tomados del grupo 12) Tubo

KMnO4 gastados (mL)


H2O2 ml

Micromol es H2O2 iniciales


Micromoles H2O2 descompues tas

Micromoles descompuesta s/min/mL enzima

1

1,75

8,75

2,0

100

22

78

31,2

2

1,25

6,25

2,0

100

16

84

16,8

3

1,50

7,50

2,0

100

19

81

10,8

4

1,25

6,25

2,0

100

16

84

8,4





Tabla #4. Efecto de inhibidores sobre la actividad enzimática (Datos tomados del grupo 2) Tubo

KMnO4 gastados (mL)


H2O2 ml

Micromoles H2O2 iniciales


Micromoles H2O2 descompuestas

Micromoles descompuestas /min/mL enzima

1

1,70

8

2,0

100

20

80

8,0

2

1,00

5

2,0

100

12

88

8,8

3

2,70

14

2,0

100

35

65

6,5

Gráfica #3. Actividad enzimática en función de la cantidad de inhibidor





3.Cálculos Muestra de cálculos: ● Conversión Conversión de mL de reactivo reactivo a micromoles: micromoles: ((Cantidad del reactivo mL) * (1L/ 1000 mL)) * (concentración de reactivo M (moles/L)) = moles de reactivo moles de reactivo*(micromol / 1*10^-6 moles) = micromoles de reactivo Ejemplo: (KMnO4 gastados (mL) * (1L/ 1000mL))) * Concentración de KMnO4 = moles de KMnO4 moles de KMnO4 * (1 micromol/ 1*10^-6 moles) = micromoles de KMnO4 (5,90 mL KMnO4 * 1L/ 1000mL) * 0,005 M = 3*10^-5 mol 3*10^-5 mol KMnO4 * (1/ 1*10^-6) = 30 micromol KMnO4

● Hallar la cantidad cantidad de H2O2 residual residual Teniendo en cuenta que la reacción que se lleva a cabo en la titulación es:

Por lo cual para calcular cuántas micromoles de H2O2 se descompusieron, se realiza el siguiente cálculo Micromoles de KMnO4 gastados * (5*10^-6 micromoles de H2O2 / 2*10^-6 micromoles de KMno4) = Micromoles de H2O2 Ejemplo: 30 micromol KMnO4 *(5*10^-6 micromoles de H2O2 / 2*10^-6 micromoles de KMno4) = 75

● Hallar la cantid cantidad ad de H2O2 descompuest descompuesto o Cantidad inicial de H2O2 - Cantidad residual de H2O2 = cantidad de H2O2 decompuesto Ejemplo: 100 micromol KMnO4 - 75 micromol KMnO4 = 25 micromol KMnO4





Ejemplo: (25 micromol H2O2/ 5 minutos) / 0,5 mL enzima = 10 micromol / (min mL)

4. Discusión de resultados Según la gráfica de la actividad enzimática en función del pH, se observa como a un ph cercano a 4, trabaja con más eficiencia la enzima. Sin embargo la gráfica correspondiente debería poseer forma de una campana, en la cual se debería observar claramente el pH óptim óptimo, o, que no neces necesari ariam ament ente e debe debe ser igual igual al pH intra intracel celul ular. ar. En nuest nuestro ro caso caso la actividad enzimática de la catalasa no presenta un patrón claro, ya que su su pH óptimo es el mismo en el cual se comenzó la prueba y no nos permite ver que pasa con la enzima a pH inferiores. [1] [3] En la prueba de efecto de la concentración del sustrato en la actividad enzimática, los datos no permi permitie tiero ron n elabor elaborar ar una una gráfic gráfica a para para ver ver el compo comporta rtamie miento nto de la enzima, enzima, ya que que al momen momento to de realiz realizar ar los cálcu cálculo los, s, los resul resultad tados os mostr mostrar aron on incohe incoheren rencia cias s al dar más más micr microm omol oles es de sust sustra rato to que que lo que que se tení tenía a inic inicia ialm lmen ente te.. De toda todas s form formas as,, segú según n la literatu literatura, ra, las enzimas en función función de la concentr concentració ación n del sustrato deben presentar presentar una gráfica con comportamiento hiperbólico, donde la velocidad aumenta a medida que aumenta el sustrato y luego la velocidad velocidad se mantiene mantiene estable a pesar de que se aumente aumente el sustrato. sustrato.

[1] En la gráfica correspondiente a la actividad enzimática en función de la concentración de la enzima, se ve un comportamiento inversamente proporcional, sin embargo este resultado es ilógico, ya que a mayor cantidad de enzima, debería aumentar su velocidad enzimática, lo cual debe verse representado como una función lineal, es decir, directamente proporcional.

[1] La actividad enzimática en función de la cantidad de inhibidor presenta un comportamiento ligeramente inverso, por lo cual a mayor cantidad de inhibidor, menor actividad enzimática. Sin embargo el comportamiento debería ser mucho más marcado y no una pequeña curva, sino una línea recta con pendiente negativa [1]

5. Cuestionario ● En la prácti práctica ca usted usted estudi estudió ó alguno algunoss factor factores es que afect afectan an la activid actividad ad de la enzima, ¿qué otros factores tendría que evaluar para completar el estudio cinético de la catalasa?





La presencia adecuada de cofactores enzimáticos ayuda también a que se lleve a cabo la reacción, pues la enzima sin estos no puede funcionar. [2]

● Reali Realice ce una comp compar araci ación ón entre entre la acci acción ón de la catala catalasa sa con con la acci acción ón de la peroxidasa Tanto la catalasa como la peroxidasa tienen un comportamiento similar en cuanto a la forma del crecimiento de actividad enzimática. Cuando la concentración del sustrato es variable, ambas ambas presen presentan tan un crecim crecimien iento to aparen aparentem temen ente te parab parabóli ólico co y llega llegan n a un máximo máximo de actividad enzimática, pero hay una diferencia significativa y es que el máximo de actividad enzimática de la catalasa (40 mM) es superior al de la peroxidasa (10mM). [3]

● ¿Cúal ¿Cúal es el papel del H2SO4 H2SO4 en esta práctic práctica?¿ a?¿Por Por qué qué no se aplica aplica al al tiemp tiempo o con los demás reactivos? - El H2SO4 se utiliza para desnaturalizar la enzima alterando el sitio activo de la enzima. Esto se logra bajando el pH por acción del ácido sulfúrico. [4] ● ¿Se podría podría sustituir sustituir el áci ácido do sulfúrico sulfúrico por otro reacti reactivo vo como como el hidróxi hidróxido do de sodio (NaOH)? Justifique su respuesta - Si se podría sustituir ya que generalmente las enzimas se desnaturalizan a pH extremos, por lo cual al agregar agregar NaOH, NaOH, el pH aumenta aumentaría ría drásticamen drásticamente te logrando logrando desnatur desnaturaliz alizar ar la enzima haciendo que detenga su actividad enzimática. [5]

● ¿Qué ¿Qué pruebas pruebas adicion adicionale aless tendrí tendríaa que realizar realizar para determ determinar inar si si esta es una una enzima michaeliana o alostérica? Justifique su respuesta ● No se requiere requieren n de más pruebas pruebas además de la de actividad actividad enzimática enzimática en función de la concen concentra tració ción n del sustra sustrato. to. Esto Esto se debe debe a que las enzima enzimas s michae michaelia lianas nas siguen siguen un crecimie crecimiento nto hiperból hiperbólico ico en el cual las moléculas moléculas se modifican modifican en mayor mayor o menor menor medida según sea la concentración del sustrato, mientras que las alostéricas siguen un crecimiento sigmoidal (en forma de S) a causa de sus interacciones con sus múltiples subunidades y sitios activos. [6]

6. Conclusiones Desafortunada nadament mente e los resultad resultados os no fueron los esperado esperados s en ninguna prueba, prueba, ● Desafortu esto esto pudo pudo ser resul resultad tado o de errore errores s experi experime menta ntale les s ya que tocaba tocaba tener tener mucho mucho cuidado con las condiciones en las que se debía mantener la enzima (principalmente en frio), ademas de que en la prueba para ver la velocidad de la enzima en función







7. Bibliografía 1. Acad Academ emia ia,, Efec Efecto to del del pH y la temp temper erat atur ura a sobr sobre e la acti activi vida dad d de la cata catala lasa sa,, consultado a través de: http://www.academia.edu/7135676/EFECTO_DEL_PH_Y_TEMPERATURA_SOBRE_LA_A CTIVIDAD_DE_LA_CATALASA 2. Univ Univer ersi sida dad d Naci Nacion onal al Abie Abiert rta a y a Dist Distan anci cia, a, Fact Factor ores es que que afec afecta tan n la acti activi vida dad d enzimática, consultado a través de: http://datateca.unad.edu.co/contenidos/200002/MODULO%20SISTEMAS%20METABOLIC OS%20NUTRICIONALES/leccin_8_factores_que_afectan_la_cintica_enzimtica.html 3. Castro Castro JA, Baquero LE, Narváez Narváez CE, Catalasa Catalasa,, Peroxidasa Peroxidasa y Polifeno Polifenoloxi loxidasa dasa de pitaya amarilla (Acanthocereus pitajaya), consultado a través de: http://www.redalyc.org/pdf/3090/309026667004.pdf 4. Portafolio electronico electronico Biología, Biología, Catálisis Catálisis de Enzimas, Enzimas, consultado consultado a través de: de: https://sites.google.com/site https://sites.goo gle.com/site/portafolioel /portafolioelectronicob ectronicobiologia/ho iologia/home/laborato me/laboratorio-2-catali rio-2-catalisis-de-enz sis-de-enz imas 5. Curso Curso de Biomolé Biomolécula culas, s, Regulac Regulación ión de la actividad actividad enzimáti enzimática, ca, consultad consultado o a través través de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#ph 6. Curso de Biomoléculas, Biomoléculas, Actividad Actividad enzimática, enzimática, consultado consultado a través través de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#e

Determinación de La Actividad de La Catalasa

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