Determinación de La Actividad Catalítica de La Actividad Catalítica de La Peroxidasa

| UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE

INGENIERIA AMBIENTAL

I.

Determinación de la actividad catalítica de la actividad catalítica de la peroxidasa

PAJARES CHAVEZ, SEGUNDO JESUS II.

MESA N0 2

RESUMEN

Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar reacciones biológicas. Igual que los catalizadores inorgánicos, aumentan la velocidad para alcanzar el equilibrio de la reacción. El mecanismo por el cual las enzimas incrementan la velocidad de la reacción es reduciendo la energía libre de activación requerida para la transformar un sustrato al producto correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio. Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913, propusieron pr opusieron un modelo clásico para el estudio de la cinética enzimática. Este modelo consiste en graficar la velocidad de la actividad enzimática y la concentración del sustrato. . La catalasa Es una enzima antioxidantes presente en la mayoría de los organismos aerobios. Cataliza la disminución del peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno. La mayoría de estas enzimas son homotetrameros con un grupo memo en cada sub unidad. Función de la catalasa . La Catalasa es una enzima presente en muchos muchos tipos de células. Su función función es proteger a las células células del efecto tóxico del peróxido de hidrógeno hidrógeno (agua oxigenada). . Los principales objetivos de este laboratorio fueron: Diferenciar un catalizador de un biocatalizador por el desprendimiento de oxigeno molecular; Demostrar cómo se evalúa la actividad catalítica de la peroxidasa. Demostrar la pr esencia de peroxidasas en los diferentes tipos de células. Se procedió a determinar la actividad catalítica de la peroxidasa armando un sistema como lo indica en la guía de laboratorio; obteniendo resultados como cambio de color burbujeo y efervescencia en algunos tubos de ensayo. En esta práctica se obtuvo nuevos conocimientos de como la catalasa realiza el metabolismo de H2O2, se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas. CAT contiene moléculas de NADPH y se caracteriza caracteriza por su alta capacidad de reacción pero poca afinidad al sustrato. En conclusión de esta práctica concluyo que aprendí: que en la reacción de la catalasa ocurre la transferencia de dos electrones entre dos moléculas de peróxido de hidrógeno hidrógeno en la cual funciona como donador y otro como aceptor aceptor de electrones, cuyo mecanismo se lleva a realizar en dos pasos. El primero la catalasa se oxida por una molécula de peróxido formando un intermediario intermediario llamado compuesto. compuesto.

III.

INTRODUCCION

Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar reacciones biológicas. Igual que los catalizadores inorgánicos, aumentan la velocidad para alcanzar el equilibrio de la reacción. El mecanismo por el cual las enzimas incrementan la velocidad de la reacción es reduciendo la energía libre de activación requerida para la transformar un sustrato al producto correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio. La actividad de una enzima se evalúa en función de la velocidad de la reacción. La cinética enzimática estudia la velocidad de la reacción, los factores que la modifican y el mecanismo de la misma. Los factores fisicoquímicos que modifican la actividad de la enzima son: concentración del sustrato, concentración de la enzima, pH, temperatura, fuerza iónica, inhibidores. Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913, propusieron un modelo clásico para el estudio de la cinética enzimática. Este modelo consiste en graficar la velocidad de la actividad enzimática y la concentración del sustrato. Esta representación gráfica permite determinar la constante de Michaelis-Menten (KM) al interpolar la mitad de la velocidad máxima . En esta práctica se empleará la enzima catalasa catalasa para analizar algunos algunos aspectos de la cinética enzimática. La catalasa utiliza una molécula de peróxido de hidrógeno (H2O2) como sustrato donador de electrones y otra molécula de H2O2 como oxidante o aceptor de electrones; dónde: A y B = Sustratos C y D = Productos v1 =


INGENIERIA AMBIENTAL Velocidad de reacción para formar productos v2 = Velocidad de reacción para formar reactivos v1 v2 CATALASA 2 H2O2 2 H2O + O2 La catalasa está contenida en los peroxisomas de eritrocitos, médula ósea, mucosas, riñón e hígado. Su función es la descomposición del H2O2 formado por acción de las oxidasas. La catalasa Es una enzima antioxidantes presente en la mayoría de los organismos aerobios. Cataliza la disminución del peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno. La mayoría de estas enzimas son homotetrameros con un grupo memo en cada sub unidad. Se ha determinado la estructura cristalográfica de nueve catalasas. Entre esos dos tipos de catalasas, existen diferencias estructurales importantes. Las catalasas pequeñas son menos resistentes a la desnaturalización, unen NADPH, tienen hemo b y se inhiben e inactivan por sustrato. En cambio las catalas grandes tienen un dominio extra en el C-terminal que es semejante ha la flavodoxina, son muy resistentes a la desnaturalización, tienen hemo d. presentan enlaces covalentes inusuales cercanos al sitio activo y son resistentes ha concentraciones molares de H2O

Función de la catalasa. La Catalasa es una enzima presente en muchos tipos de células. Su función es proteger a las células del efecto tóxico del peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) Cataliza la reacción: 2 H2O2 -----------> 2 H20 + O Fue una de las primeras enzimas purificadas y ha sido muy estudiada. Es una de las enzimas más eficientes con una velocidad de aproximadamente 200,000 transformaciones/segundo/subunidad. La proteína es un tetrámero formado por cuatro subunidades idénticas (350,000 kD). Cada monómero contiene un grupo prostético Hemo en el centro activo. En algunas especies también contiene una molécula de NADP por subunidad cuya función es proteger a la enzima de la oxidación por su sustrato H2O2. Ha diferencia de otras enzimas que requieren de un sustrato reducido las catalasas dismutan el peróxido de hidrogeno.se identificado tres grupos de catalasas.

A. Catalasas mono funcionales. B. Las Mn- catalasas. C. Las catalasas peroxidasas. La mayoría de de organismos aeróbicos tienen catalasas mono funcionales. Las catalasas catalizan la dismutacion del peróxido de hidrogeno en agua y dióxido evitando así que se forme el radical hidroxilo y el oxígeno singulete especies de oxigeno que son muy reactivas. En el hombre la catalasa pro tege la hemoglobina del peróxido de hidrogeno que se genera en los eritrocitos.

IV. OBJETIVOS. Los principales objetivos de este laboratorio fueron: Generales: 

Diferenciar un catalizador de un biocatalizador por el desprendimiento de oxigeno molecular.



Demostrar cómo se evalúa la actividad catalítica de la peroxidasa. Demostrar la presencia de peroxidasas en los diferentes tipos de células. Demostrar el efecto oxidante del O2 sobre el alcohol etílico mediante el reactivo de shiff

Específicos:  

.


INGENIERIA AMBIENTAL V.

METODO Se procedió a determinar la actividad catalítica de la peroxidasa armando un sistema como lo indica en la guía de laboratorio.

Materiales:

-

Gradilla Papa Carne Hígado de pollo Tubos de ensayo(6) Cocina eléctrica.

Reactivos: - buffer fosfato - Limaduras de hierro - enzima al 1% - reactivos de schiff - alcohol etílico.

Pipetas



Procedimiento experimental: Se arma la siguiente tabla. componentes Buffer fosfato ph7.2 Agua destilada

I 1ml 2ml

II 1ml 1ml

Limaduras de hierro Trozos de papa Trozos de zanahoria Trozos de carne o hígado Levadura de panificación Agua oxigenada Observar x 15 minutos Alcohol etílico Reactivo de schiff

VI.

III 1ml

sistema IV 1ml

V 1m

VI 1ml

0.5g 0.5g 0,5g 0.5g

2ml 1ml

3ml

3ml

3ml

3ml

3ml

0.5g 3ml

2ml 1ml

2ml 1ml

2ml 1ml

2ml 1ml

2ml 1ml

2ml 1ml

RESULTADO.       

VII 1ml

Tubo de ensayo A1: no se observó ningún cambio solo queda un líquido transparente. Tubo de ensayo A2: pequeñas burbujas y leve cambio de color. Tubo de ensayo A3: se observa un precipitado de color negro con bastantes partículas flotantes. Tubo de ensayo A4: leve efervescencia con flotación de muestra Tubo de ensayo A5: pequeñas burbujas Tubo de ensayo A6: burbujeo constante. Tubo de ensayo A7:efervesencia controlada.


INGENIERIA AMBIENTAL 

Luego de quince minutos:



B1. ..Sedimentación y leve cambio de color B2…alteración de color a rosado claro B3…cambio de colora rosado oscuro B4…sedimentación y burbujas marcadas B5…cambio de color y aumento de peso de los trozos de muestra B6…Exagerado burbujeo



B7…color morado oscuro

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La catalasa realiza el metabolismo de H2O2, se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas. CAT contiene moléculas de NADPH y se caracteriza por su alta capacidad de reacción pero poca afinidad al sustrato. Tiene dos funciones, una catalítica y una peroxidativa. En la reacción catalítica utiliza como donadores a otras moléculas de H2O2. En la reacción peroxidativa la enzima utiliza como donadores de Hidrógeno al metanol, etanol, ácido fórmico, fenol, y formaldehido. Una molécula de catalasa es capaz de catalizar la transformación de alrededor de 1x107 moléculas de sustrato por segundo, la primera reacción tanto del mecanismo catalítico como peroxidativo es la heterólisis o rompimiento de los enlaces oxígenooxígeno, en la reacción catalítica se transfieren dos electrones de la enzima a un oxígeno y forma agua.


INGENIERIA AMBIENTAL VII.

DISCUSIÓN

En esta práctica se obtuvo nuevos conocimientos de como la catalasa realiza el metabolismo de H2O2, se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas. CAT contiene moléculas de NADPH y se caracteriza por su alta capacidad de reacción pero poca afinidad al sustrato. Tiene dos funciones, una catalítica y una peroxidativa. También es importante agradecer al Ing. tutor el método utilizado de esta práctica que se basa en dejar desenvolverse a cada alumno en las diferentes mesas para lograr el objetivo trazado en la práctica; rectificando los errores que se cometen.

VIII.

CONCLUCION

De esta práctica concluyo que aprendí: que en la reacción de la catalasa ocurre la transferencia de dos electrones entre dos moléculas de peróxido de hidrógeno en la cual funciona como donador y otro como aceptor de electrones, cuyo mecanismo se lleva a realizar en dos pasos. El primero la catalasa se oxida por una molécula de peróxido formando un intermediario llamado compuesto. Luego en el segundo paso de la reacción el compuesto uno es por otra molécula de peróxido regresando la catalasa a su estado inicial produciendo agua y dioxigeno Lo aprendido es de mucha importancia en nuestra formación profesional como ingenieros ambientales pues la usaremos en el desempeño de trabajos de campo y de laboratorio.

IX.

CUESTIONARIO 1. mencione Ud. en que organelos se encuentra la peroxidasa?

- peroxisomas y mitocondrias 2. ¿C uál es la función de la peroxidasa en la célula?

-Existen peroxidasas con una función predominantemente defensiva en l a saliva, la leche o los leucocitos, donde se aprovecha el carácter oxidante con fines germicidas y bactericidas del peróxido que se genera de forma endógena mediante otras reacciones (glucosa oxidasa, amino ácido oxidasa etc.). No todas las peroxidasas son defensivas, y por ejemplo una peroxidasa (yoduro peroxidasa) es también la responsable de la síntesis de las hormonas tiroideas, oxidando en este caso el yoduro a yodo para que éste se adicione a algunos de los anillos fenólicos de los residuos d e tirosina de la tiro globulina. Otras peroxidasas, como la glutationa peroxidasa, están ampliamente distribuida en diversos tejidos con fines diferentes, pero relacionados con una función antioxidante 3. ¿Qué diferencia hay entre catalasa y peroxidasa?

- Catalasa es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua. El peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos, pero dada su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos menos peligrosos. Para ello se usa con frecuencia esta enzima que cataliza su descomposición en agua y oxígeno. Además la catalasa se usa en la industria textil para la eliminación del peróxido de hidrógeno, así como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de contacto que se han esterilizado en una solución de peróxido de hidrógeno. Peroxidasa


INGENIERIA AMBIENTAL Las peroxidasas son un tipo de enzimas muy extendidas en toda la escala filogenética. Catalizan reacciones bisustrato de carácter redox, utilizando un peróxido como oxidante (a lo que deben su nombre) y un segundo sustrato de características reductoras que es oxidado. En vegetales, es de destacar a la peroxidasa de rábano (horseradish peroxidase o HRP), que tiene grandes aplicaciones en técnicas inmunoquímicas y de diagnóstico clínico debido a su gran estabilidad, facilidad de conjugación con las Ig y sencillez para detectarla por métodos colorimétricos utilizando un gran número de reactivos. En animales, existen peroxidasas con una función predominantemente defensiva en la saliva, la leche o los leucocitos, donde se aprovecha el carácter oxidante con fines germicidas y bactericidas el peróxido que se genera de forma endógena mediante otras reacciones (glucosa oxidasa, amino ácido oxidasa etc.). No todas las peroxidasas son defensivas, y por ejemplo una peroxidasa es también la responsable de la síntesis de las hormonas tiroideas, oxidando en este caso el yoduro a yodo para que éste se adicione a algunos de los anillos fenólicos de los residuos de tirosina de la tiroglobulina. Otras peroxidasas, como la glutatión peroxidasa, están ampliamente distribuida en diversos tejidos con fines diferentes, pero relacionados con una función antioxidante 4. ¿E xplique ud como en la célula se forman los peróxidos (H 2O2) y que acción tienen?

Las células tienen unos complejos enzimáticos llamados PEROXISOMAS, que usan o crean el Peróxido de Hidrogeno para poder degradar ácidos grasos de largas cadenas, u otras moléculas complejas. Cuando se ingiere Etanol (bebidas alcohólicas), este no puede ser oxidado en la mitocondria, por lo que los Peroxisomas cumplen esa función liberando Peróxido de hidrogeno. 5. ¿C ómo interviene la catalasa en la oxidación del alcohol?

Al añadirle el alcohol, la catalasa utiliza el agua oxigenada como agente oxidante ya que el hígado produce una mayor cantidad de enzima (alcohol hidrogenasa) que descompone el alcohol, pero cuando hay un alto nivel de alcohol se convierte en sustancia toxica por el aumento de trabajo, puesto que ya no hay las mismas cantidades que sintetizan la mayor cantidad del sustrato.

6. REFERENCIAS  

Guillermo Goyenola (2007) Química del agua. MARTÍNEZ, Alma. Métodos de análisis bioquímicos- Tecnología en Marcha. 2002-Vol. 19-2.







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