Practica Nº4 DETERMINACIÓN DE BACTERIAS AEROBIOS MESÓFILOS VIABLES I.
Introducción: El análisis de los alimentos está catalogado por diversas técnicas y métodos para determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya sean sólidos como las carnes, verduras y frutas, o líquidos ya sea leche y jugos de frutas; entre estos métodos tenemos la numeración de microorganismos aerobios mesófilos, la cual nos permite determinar cuántos microorganismos contaminantes presenta un alimento sobre su superficie o en su interior. Según la norma técnica Peruana para la leche cruda (NTP 202.086:2001) y la norma técnica Peruana para jugos de frutas (NTP 203.002:1979) establecen que el numero de microorganismos aerobios mesófilos y facultativos deben ser hasta un máximo de 1000000 ufc/ml, para que puedan ser consumidos por la población. Por otro lado las técnicas para poder encontrar la numeración de aerobios mesófilos viables son: el recuento de colonias en placa por profundidad, superficie o por goteo; otro el Método del número más probable (MPN) de gérmenes como
cálculo estadístico del número de células viables. El recuento total de bacterias en placa es un método útil para obtener una idea del grado de frescura o pronta alteración de los alimentos, dependiendo de la cantidad de bacterias presentes. La mayoría de los alimentos deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran número de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como patógenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolépticos del alimento. (Thatcher y Clark, 1973) La presencia de microorganismos aerobios mesófilos en los alimentos puede ser relacionada directamente con la manipulación, el estado de frescura o de descomposición del producto y la temperatura de conservación del producto. Un número relativamente bajo de estas bacterias no es sinónimo de buena calidad bacteriológica del alimento, ya que puede contener microorganismos que producen enterotoxinas o son patógenos. (Venegas y col., 1990).
Microbiología de los Alimento I
Practica Nº4 La aplicación de este método se basa fundamentalmente en que, si el recuento es efectuado luego de un profundo conocimiento de la manipulación antes del muestreo (temperatura, empaque y otros), puede proporcionar una medida comparativa del grado general de contaminación bacteriana e higiene aplicada (FAO, 1998). En el grupo de los mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar: Excesiva contaminación de la materia prima. Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración. La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos. La inmediata alteración del producto. El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.
II.
Objetivos:
Conocer el número de microorganismos aerobios mesófilos que contiene un alimento
Familiarizarse con métodos directos para la obtención de microorganismos utilizando el método de recuento de colonias en placa.
Determinar si el producto alimenticio que se analiza está en condiciones aptas para el consumo humano.
III.
Determinar cuántos microorganismos presenta la muestra que analizamos.
Materiales: Material Biológico – muestra líquida: Microbiología de los Alimento I
Practica Nº4
Jugo de Soya.
Material de laboratorio:
Medio de cultivo: Agar Plate Count
Diluyente: Agua peptonada 0.1 %
Pipetas: (1ml y 10 ml). Micropipeta. 11 Placas Petri. Ansa calibrada Mechero. Balanza. Estufa (29º - 31 ºC). Tubo de dilución. Espátula de Drigalsky
IV.
Procedimiento: a) Preparación de la muestra: i) Si es muestra liquida se deberá guardar en refrigeración antes de el análisis correspondiente, para disminuir el metabolismos bacteriano. Y se deberá medir en mililitros. ii) Si a muestra es solida o semisólida y está congelada, debemos esperar a que se descongele a medio ambiente. iii) Si la muestra solida o semisólida se encuentra a Tº ambiente, se procederá con el análisis. iv) Para diluir las muestras solidas es necesario licuarlas, tal es el caso de las verduras. Y luego se pesara.
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Practica Nº4 v) Las diluciones se deberán preparar de la siguiente manera: Para muestras liquidas:
De la muestra madre sacar 3 ml y diluirlos en 27 ml de agua Peptonada.
Luego pasar un 1 ml a cada tubo con 9 ml de agua Peptonada, hacer progresivamente hasta llegar a la dilución 10
-6.
b) Técnicas empleadas: i) Método de placa vertida - Profundidad: Primero se diluye la muestra a analizar. Luego se saca con una pipeta 1 ml de todas las diluciones y se vierten en dos placas por dilución. Después de esto rápidamente agregamos el Agar Plate Caunt, homogenizamos con 5 movimientos lentos de arriba hacia abajo y de derecha – izquierda. Para fines de la práctica solo trabajaremos con la dilución 10
-3.
Por lo
que solo utilizaremos 6 placas.
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Practica Nº4
1mL
1mL
9 ml DAP
9 ml DAP
10-3
10-2 10-1 1mL
1mL
3 ml de jugo de soya + 27 ml de Agua Peptonada al 0.1%
A 10-1
B 10-1
A 10-2
B 10-2
A 10-3
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B 10-3
Practica Nº4 Procedimiento del método a Profundidad
3 ml de jugo de soya + 27 ml de Agua Peptonada al 0.1%
Agregamos el Agar Plate Count, sobre el mililitro y homogenizamos
Placas con Agar Plate Count, con las diluciones de 10-1 has 10 a la10-6.
A 10-1
B 10-1
A 10-2
B 10-2
A 10-3
B 10-3
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Practica Nº4 ii) Método de Superficie: De la dilución 10-¹, sacamos 1 ml y hacemos las diluciones hasta 10-6. Luego en una placa servida con Agar Plate Count, agregamos 1 ml sobre la superficie. Inmediatamente procedemos a expandir el mililitro sobre la superficie con la espátula de Drigalsky. Con fines de la practica solo se trabaja hasta la dilución 10-3 y con tan solo 1 placa por dilución
9 ml DAP
9 ml DAP
10-2
10-3
10-1 1mL
1mL
3 ml de jugo de soya + 27 ml de Agua Peptonada al 0.1%
Se extiende el mililitro sobre la superficie de la placa con la espátula de Drigalsky
B 10-2 A 10-1
C 10-3
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Practica Nº4 Procedimiento del método a Profundidad Hasta la dilución 10--3
De la dilución 10-¹ sacamos 1 ml y lo pasamos al tubo siguiente
Del tubo con la dilución 10--2 sacamos 1 ml y lo pasamos al tubo siguiente
Agregamos 1ml de cada dilución a sus respectivas placas coma Agar plate count.
Con la espátula de Drigalsky extendemos la muestra sobre toda la superficie de la placa
Dilución 10--3
B 10-2 A 10
-1
C 10-3
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Practica Nº4 iii) Método de Goteo: Con una micropipeta sacamos 20 ul, y dejamos caer a manera de gota sobre un lado de la placa con Agar Plate Caunt. Este procesdimiento se realiza dos veces en la misma placa en lados opuestos. Para fines del curso solo otilizaremos las soluciones 10-2 y 10-3.
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Practica Nº4 V.
Resultados:
CONTEO x TIEMPO 24 H
MÉTODO Total
48 H
Promedio
Total
Promedio
En Profundidad 10-1 A
Incontable
Incontable ------
------
-1
10 B
Incontable
Incontable
10-2 A
Incontable
Incontable ------
-2
10 B
Incontable
10-3 A
154
138
-----Incontable
146
198
170
184
135 -3
10 B
140
105
123
189 220
165
193
Por Goteo 10-2
160
160
198
198
10-3
140
140
188
188
Por superficie 10-1 10
-2
10-3
Incontable
Incontable ----------
Incontable 111
118
---------Incontable
115
143
150
147
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Practica Nº4 De los resultados obtenidos se interpretó de la siguiente. manera: Para el método de conteo por profundidad: Como se puede observar en el cuadro solo se pudo realizar el conteo en la dilucion10-3, de las diluciones se sacó el promedio por horas y cuadrantes. En la dilución 10-3 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 135 colonias y a las 48 h. 189 colonias. Ufc/gr de
=
muestra Ufc/gr de
Nº de
x
colonias =
Factor de dilución
189
x
103
19 x 104
=
muestra
ufc/gr
El recuento de bacterias aerobias mesófilas viables es igual de 19 x 104ufc/gr en la muestra liquida de jugo de soya. Para el método de conteo por Goteo. Se realizo el conteo en las dos diluciones 10-2 y 10-3, de los cuales se obtuvo el promedio por horas. En la dilución 10-2 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 160 colonias y a las 48h. 198 colonias. En la dilución 10-3 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 140 colonias y a las 48 h. 188 colonias. Para que los resultados de las diluciones estén bien la dilución menor debe contener a la mayor en 2 veces, así que dividimos: A las 24 h. 160 10-2 → -3 10 → 140
=
1.15
A las 48 h. 10-2 → 198 -3 10 → 188
=
1.05
La solución más cercana a 2 es la de 24h, y se tomaría la dilución más alta (10-2 ). Entonces el número de UfC/ ml de muestra es: 160 x 10-2 = 16 x 10-3. ufc/ml
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Practica Nº4 Por lo tanto el número de M.O aerobios mesófilos viables de jugo de soya es: 16 x 10-3.ufc/ml. Para el método de Superficie: En este método se obtuvo que a las 24 horas se contaron un promedio de 115 colonias y a las 48 h un promedio de 147. El promedio de ambos conteos es de 131. Entonces el numero de UFC/ml de 4
muestra es 13 x 10- . ufc/ml. Por lo tanto el número de microorganismos aerobios mesófilos obtenidos por 4
este método equivale a 13 x 10- . ufc/ml de muestra de jugo de soya adquirida en el Mercado Modelo de Chiclayo.
VI.
Conclusiones:
VII. Cuestionario: a. ¿Qué otras sustancias se utilizan como diluyentes para realizar los análisis microbiológicos en alimentos? Además del Agua de Peptona Tamponada (BPW), es muy común el uso del Diluyente Agua de Triptona (Tryptone Water: TW) y la Solución Tinger ¼, cuyas composiciones son las siguientes:
Tryptone Water Triptona Cloruro de
Solución Tánger ¼ 10 g
Cloruro sódico
9g
5g
Cloruro cálcico
0.42 g
Cloruro sódico
5g
Peptona
0.20 g
Fosfato sódico
9g
10 g
anhidro
sodio Agua destilada
BPW
1 000 mL
Hidrógeno carbonato sódico Agua destilada
1 000 mL
Fosfato potásico Agua destilada
1.5 g 1
000 mL
También se podría usar el Solución Salina Fisiológica (SSF) como diluyente, esta solo contiene 0.900 g de cloruro de sodio para 100 mL de agua destilada. Microbiología de los Alimento I
Practica Nº4 b. ¿Por cuánto tiempo y a cuántas revoluciones por minuto se debe tratar una muestra sólida para ser homogenizada? Para tratar una muestra sólida hay que licuarla o triturarla en un vaso esterilizado de licuadora a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos. c. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los tres métodos usados? Ventajas: Se obtienen resultados rápidos de un día para otro. Hace un recuento “total” que incluye todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30 ºC en las condiciones establecidas, además refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación y las condiciones higiénicas de la materia prima. Se puede aplicar para productos sólidos como carnes, verduras, mariscos. Desventajas solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas, además se estima la microflora total sin especificar los tipos de microorganismos y por último, si tener un recuento bajo de aerobios mesófilos eso no nos asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas; de la misma manera que un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. No diferencia microorganismos patógenos de la flora común. El procedimiento está sujeto a error.
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