Determinación de actividad enzimática de la tirosinasa por método espectrofotométrico.
Resumen
El objetivo principal de la practica fue la determinación de la actividad enzimatica de la tirosinasa, para la determinación de esta se utilizo el método de espectrofotometria, por medio de este fue posible determinar la absorbancia de la tirosinasa a distintas concentraciones. Ya teniendo la absorbancia de estos se pudo llegar a determinar el comportamiento de la enzima tirosinasa, a partir de la gráfica se puede llegar a determinar la actividad de esta enzima. Para llevar acabo la experimentación de utilizo _DOPA como sustrato, ya que el dopacromo posee un máximo de absorción de 475nm, por lo que la absorción a esta longitud de onda se utilizo para medir la actividad enzimatica. Las enzimas se caracterizan por sen especificas por el tipo de reacción y el sustrato. Algunos de los factores que las influyen son la presencia de inhibidores, activadores, temperatura pH y concentración del sustrato. Introducción La tirosinasa es una enzima catecoloxidasa, según la moderna nomenclatura moderna y clasificación de enzimas es EC 1.14.18.1, también es llamada monofenol monooxigenasa. Esta enzima cataliza la oxidación de los orto-difenoles en orto-quinonas utilizando como su cofactor el DOPA (dihidroxifenilalanina), mediante la actividad cresolasa, que consiste en la hidroxilación de monofenoles en la posición orto para obtener odifenoles, o la actividad catecolasa, que consiste en la oxidación de ofenoles a sus respectivas o-quinonas. La tirosinasa se encuentra en los tejidos vegetales, principalmente en las mitocondrias y cloroplastos de las células, también se encuentra en las vacuolas como parte soluble. Esta enzima es la responsable del pardeamiento enzimático, la cual es una reacción de oxidación en la cual actúa como sustrato el oxígeno molecular.1
La actividad de una enzima determina la capacidad de dicha enzima para provocar una reacción química determinada, y se expresa en moles o unidades de actividad enzimática. La velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente es directamente proporcional a la concentración del sustrato que interactúa en la reacción, por lo tanto la velocidad de una reacción puede ser medida, mediante la disminución de concentración de sustrato en un determinado tiempo, o el aumento de la concentración del producto, midiendo dichas concentraciones por el método espectrofotométrico. La actividad enzimática también puede expresarse como cierta cantidad de sustrato convertido en un determinado tiempo y volumen, utilizando también para calcular la cantidad de sustrato reaccionado la Ley de Beer-Lambert.2 Las enzimas se clasifican bajo una secuencia numérica conformada por 4 secciones en específico bajo el sistema EC. El primer número hace
referencia al tipo de reacción química que desempeña la enzima, el segundo número se refiere a la subclase de la enzima, el tercero determina la subclase con información sobre el sustrato afín a la enzima y el cuarto indica el numero serial de la enzima en el grupo correspondiente. 1 Esta numeración permite clasificar a las enzimas en cinco grupos: 1 1. Oxidorreductoras 2. Transferasas 3. Hidrolasas 4. Liasas 5. Isomerasas El cambio de color producido en los vegetales al cortarlos se produce por medio del oscurecimiento o pardeamiento enzimático. Esto se debe a una disrupción a nivel celular en donde se exponen los sustratos tipo fenólico al oxigeno del aire.2 Metodología
Para llevar a cabo el análisis de la enzima primero fue necesario primero la extracción de la enzima, la cual fue posible pesando 20g de muestra y luego se trituro, ya triturado se le añade 10ml de buffer de fosfato de sodio. Esto se lleva a la centrifugadora. Ya teniendo lo centrifugado se preparo una dilución de 1:10 con buffer de fosfato de sodio 0.1M, en un tubo de ensayo se añadió 0.1ml del extracto diluido, se le agrego 3.9ml de buffer de fosfato y 1ml de DOPA, esto se llevo a una cubeta del espectrofotometro y se midió la absorbancia a 420nm cada 5 minutos por 25 minutos. Este mismo procedimiento se llevo a cabo con un extracto diluido de 0.2, 0.5 y 1.0ml y
con 3.8, 3.5 y 3.0ml del solución buffer con 1ml de DOPA.
Resultados En base a los resultados obtenidos, se pudo observar el distinto comportamiento de la enzima en las distintas concentraciones en el mismo intervalo de tiempo, en el cual los datos obtenidos no fueron del comportamiento lineal inicial de la enzima esperada, deduciendo así varios factores que pudieron afectar en base a los cálculos obtenidos. Gráfica no. 1 Actividad enzimática de tirosinasa 0.1mL Linear.(0.1mL) 0.2mL Linear.(0.2mL) 0.5mL Linear.(0.5mL) 1.0 mL Linear.(1.0 mL)
y = 0.60 0.0022x + 0.1532 y = 0.0051x + 0.2159 y = 0.45 0.008x + 0.1806 y = 0.0212x + 0.4812 0.30 0.15 0 1
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Discusión El objetivo principal de la practica fue el análisis de la enzima tirosina, la cual se extrajo de una manzana, esta enzima es la proteína básica de la pigmentación, se encuentra clasificada como una enzima oxido reductora y tienen como función la oxidacion de fenoles. Este análisis se llevo a cabo a partir de un análisis espectrofotometrico, el cual nos mostró la absorbancia de la tirosinasa, en la gráfica No. 1 se puede observar el comportamiento de la absorbancia de la enzima, cuando se encuentra a distintas concentraciones. En la gráfica se puede observar que entre un incremento en la absorbancia, esta nos indica que entre mayor es el tiempo de reacción de la oxidación mayor es su capacidad de absorber luz.
momento que la temperatura va subiendo la enzima se inhibe, de igual manera otro factor pudo haber sido factores contaminantes presentes en la cristalería que intervinieron en la precisión y exactitud de nuestros resultados.
La determinación de la actividad dopa oxidada de la tirosinasa, se baso como producto de oxidación de la LDopa este siguió su formación hasta 475nm. La unidad de actividad dopa oxidasa se definió como la cantidad de enzima que cataliza en la formación de micromol de dopacromo por minuto.
Referencias 1. Koolman, J. 2005. Bioquímica. Ed. Médica Panamericana. Madrid, España. 488pp 2. Ferscht, A. 1980. Estructura y Mecanismo de Enzimas Ed. Reverté. Barcelona, 370pp. 3. Práctica 7. 2013. Enzima, Tirosinasa. Manual de
La actividad de la dopa oxidasa se puedo llegar a medir a partir de la formación de dopacromo con respecto a su tiempo, esto se puede observar en la gráfica. En este ocurrieron diversos factores que pudieron intervenir en nuestros resultados, un factor pudo haber sido la temperatura del ambiente, al
Para la elaboración de esta practica se recomienda una manipulación cuidadosa de la enzima, ya que un mal manejo de esta se pude llegar a ver afectados nuestros resultados cuantitativos y cualitativos. Conclusión En base a los resultados obtenidos se puede concluir que es posible la determinación de la actividad enzimática a partir de la absorbancia de esta y que la absorbancia se ve directamente afectada por la reacción de oxidación de la tirosinasa.
