PRÁCTICA: ACTIVIDAD ENZIMÁTICA TIROSINASA Universidad de Antioquia; Facultad de Química Farmacéutica; Laoratorio de !ioquímica; "edellín# Antioquia; $%&' (eraldin (eraldin Fern)nde* Fern)nde* Ana+a , (essica (essica -atalia Pe.a Pére* RESUMEN: En esta práctica se logró determinar la actividad enzimática de la tirosinasa y la influencia de factores fisicoquímicos fisicoquímicos como la temperatura, la concentración y PH, este procedimiento se llevó a cabo mediante la utilización de un extracto de banano como fuente de la enzima, un sustrato ! "etil #opa, y un blanco de reacción$ El espectrofotómetro se calibro a %&' nm, primero se configuro el blanco y luego se adiciono a cada celda la mezcla del preparado procediendo a obtener las lecturas de las absorbancias cada &' segundos por tres minutos, tomando datos por triplicado$ PALABRAS CLAVES: espectrofotómetro, Tirosinasa, factores fisicoquímicos, actividad enzimática, L –Metil Dopa, 1. PROCEDIMIENTO:
Para Para prepar prepara a el extra extracto cto de anano anano tomamo tomamoss prime primeram rament ente e !" # de la fruta, fruta, lo macera maceramos mos en un mortero, le a#re#amos !" ml de uffer a P$ %&', para terminar el proceso se filtró para no de(ar residuos en la muestra& )ste procedimiento se repite con las mismas condiciones& Lue#o centrifu#amos durante !" minutos minutos a *+"" *+"" PM PM extraextra-end endo o el soren sorenada adant nte e para para diluir diluir la solución solución '.'" con la uffer uffer P$ P$ %&', es decir decir ' ml del extracto, !/ ml de uffer& Post Poster erio iorm rmen ente te se mide mide la infl influe uenc ncia ia de la concentración de la enzima sore la actividad enzimática0 se tomó ! ml de L –metildopa, 'ml de uffer - de extracto extracto fue: ! ml, !&+ ml, ' ml, '&+ ml un volumen volumen de extracto extracto para cada #rupo0 usamos el espectrofotómetro espectrofotómetro - despu1s de calirar la primera asorancia como tiempo cero se re#istrar re#istraron on las asoranci asorancias as cada '" se#undos se#undos 2asta lle#ar a !/" se#undos por cada volumen, mediante este procedimiento este procedimiento oservamos el camio de la velocidad de la reacción&
Para determinar la influencia del p$ sore la actividad enzimática se a#re#ó en un tuo de ensa-o ! ml de extracto, * ml de uffer p$ 3 - ! ml de L4metildopa, realiza izando el procedi edimiento anterior ior en el espectrofotómetro& )ste se repitió con un camio p$ en las soluciones uffer de %&' - !"&5& 6Datos otenidos de los compa7eros de laoratorio8 Post Poster erio iorm rmen ente te para para ose oserv rvar ar la infl influe uenc ncia ia de la temperatu temperatura ra en la actividad actividad enzimátic enzimática a se realizó realizó el mismo procedimiento pero a */9 - 59&, tami1n se tuvo en cuenta los datos tomados en la primera lectura -a que se 2izo a Temperatura amiente& 2. DATOS&
;l otener el resultado de las asorancias se realizan #ráficos de asorancia vs tiempo 6s8 correspondiente a cada uno de los parámetros - sus variaciones&
Los datos presentados en las talas son -a los promedios de los datos otenidos& ()*) ()*) +: resultados de la absorbancia a diferentes concentraciones$ Tiempo Tiempo - ml de extracto extracto y absorbancia absorbancia promedio (s (s) 1 ml 1.5 2 ml 2.5 ml ml 0 0.06 0.142 0.115 0.090 8 20 0.08 0.167 0.14 0.107 5 40 0.1 0.181 0.152 0.12 60 0.11 0.196 0.169 0.19 4 80 0.12 0.209 0.189 0.155 8 100 0.14 0.227 0.20 0.170 1 120 0.15 0.29 0.219 0.186 5 140 0.16 0.251 0.27 0.201 8 160 0.18 0.26 0.266 0.218 1 180 0.19 0.276 0.269 0.21
igura +$ )bsorbancia vs$ vs$ (iempo$ #iferentes #iferentes -oncentraciones$
absorbancia 11 &$'*+ 0.
,inear (absorbancia 1)
0.25
!(x) !(x) " " 0x 0x # # 0.15 0.12 'bsorbancia 1.5 $% " 0.99 $% " 0.99
0.25
0.2
!(x) " 0x # 0.09 $%,inear " 1 ('bso rbancia 1. !(x) " 0x # 0.07 $% " 1 ,inear ('bso rbancia 1.
0.2
'bsorbancia 0.15 0.1
'bsorbancia 04
!(x) " 0x # 0.07 $% " 1
0.1
0 0
,inear ('bsob ancia 2.
0
0.15
0.05
'bsobancia 2.5
0.05 0
&$'*+ 2
!(x) !(x) " " 0x 0x # # 0.0 0.02 $% " "1 0.99
%$ Tiempo
'bsorbancia 2 20 40 60 80 100120
Tiempo ,inear ('bso rbancia 2)
50 100 150 200
6 ,inear ( 6) p 7.2 ,inear (p 7.2) p 10.4 ,inear (p 10.4)
(aba &$ .esultado de la medición de absorbancia a #iferentes PH$ '+$'/*' T3+ 6 () 0 0.02 20 0.026 40 0.029 60 0.02 80 0.05 100 0.07 120 0.040 140 0.042 160 0.045 180 0.047
7.2 0.068 0.085 0.1 0.114 0.128 0.141 0.155 0.168 0.181 0.19
10.4 0.027 0.01 0.04 0.04 0.08 0.041 0.044 0.046 0.049 0.052
igura &$ )bsorbancia vs$ (iempo /s0 para diferentes valores de pH
(abla 1: .esultados de la medición de absorbancia con diferentes (emperaturas T3+ '+$'/*' T3$'T$' () 4 * T 'mb 8c 0 0.08 0.068 0.054 20 0.040 0.085 0.054 40 0.04 0.1 0.061 60 0.045 0.114 0.06 80 0.048 0.128 0.065 100 0.051 0.141 0.068 120 0.05 0.155 0.070 140 0.055 0.168 0.072 160 0.056 0.181 0.075 180 0.057 0.19 0.077
igura 1$)bsorbancia vs$ (iempo /s0 para diferentes valores de temperatura
&$'*+ 0. 0.2
'bsorbancia T
0.1 0
!(x) " 0x # 0.07 $% " 1 !(x) !(x) " " 0x 0x # # 0.05 0.04 $% " 0.99 " 0.98 0 $% 50 100 150 200
Tiempo 4 * ,inear (4 *) T amb ,inear (T amb) 8 * ,inear (8 *)
•
3 .
La pendiente ma-or que me indica cual es la que tiene me(or actividad enzimática es la de el volumen de ' ml&
ANÁLISIS DE RESULTADOS
; partir de los resultados otenidos se realizaron Diferentes #ráficos, donde se evidencia como
estructura de los aminoácidos - por tanto la actividad enzimática& Teóricamente la concentración de la enzima aumenta proporcionalmente la actividad enzimática para concentraciones constantes de sustrato, es decir, La velocidad inicial se duplica al duplicar la concentración de enzima& omo la concentración de sustrato es la misma, la concentración final de producto al alcanzar el equilirio será la misma para todos los casos& =in emar#o, el equilirio será alcanzado más lentamente cuanto menor sea la cantidad de enzima& )n cuanto a la temperatura, esta aumenta la ncremento de la temperatura& =in emar#o lle#ando a una determinada Temperatura pueden aparecer los fenómenos De desnaturalización de una enzima como es el aso de la T a 59c la #ráfica denota una in2iición& )xperimentalmente al#unos traa(os 2an reportado que los camios físicos com?nmente utilizados para una in2iición son la reducción de la temperatura, el oxí#eno, el uso de atmósferas modificadas o a#entes quelantes que pueden unirse coordinadamente a los centros activos de core que tiene la enzima& La temperatura crítica es característica de cada enzima oscila #eneralmente entre +" - 3"@& por lo tanto la velocidad máxima de las reacciones catalizadas enzimáticamente se consi#uen mu- por dea(o de la temperatura critica de la enzima& )studios recientes demuestran que en el anano /"usa cavendis2ii0, la temperatura óptima para evaluar su actividad es de *"9 a un p$ de %&", )n nuestro caso podemos ver que esto n o se umple del todo, -a que temperaturas por dea(o 59c la #ráfica nos modela una recta donde la ;sorancia es prácticamente constante en )n el tiempo, lo que interpretamos como una inactivación de la enzima o loqueo de sus Aunciones catalítica impidiendo que se una ;l sustrato& La peque7a ma#nitud de la pendiente Bos permite afirmar que su actividad enzimática )stá mu- limitada, aunque la pendiente en la curva que nos muestra un comportamiento de C */9
)xperimentalmente no podemos determinar cuáles serían los valores óptimos para estos parámetros, -a que los resultados no coinciden con los reportes teóricos, esto se puede deer a que experimentalmente se tienen m?ltiples errores asociados al tiempo en que cada equipo de traa(o se tomó en medir las primeras concentraciones de producto& )l error experimental se ve fuertemente asociado deido a que los datos fueron tomados por diferentes personas, en espectrofotómetros diferentes, sumado a ello las interferencias del equipo como partículas o suciedades en las celdas&
=e determinó que el de ma-or actividad enzimática es el del volumen de ' ml, porque su pendiente es la ma-or de todas i#ual a ","""& 5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS&
!& in1tica enzimática& ;vailale from: 2ttp:..EEE&a#ro&unlpam&edu&ar.catedras4pdf."5inetica4 enzimatica&pdf '& Díaz Portillo, María Teresa Aernández del Farrio AP salido& ;spectos Fásicos de Fioquímica línica G>nternetH& ;vailale Aromm: 2ttp:..ooIs&#oo#le&com&co.ooIsJ idK!m"nm;tsNp#KP;NdqKactividadOenzimatica OfactoresOqueOinflu-enN2lKesNsaKNeiK$t!'QRlP>ec/
#T*Io$ENvedK"D#3;)E;#SvKonepa#eNqKactivi dad enzimática factores que influ-enKfalse *& Fifásicos =, on ;, cido >& Bo Title>B$>F>>UB D) L; ;T><>D;D )BV>MT>; D) L; PUL> A)BUL U>D;=; )T;WD; D)L F;B;BU 6avendis2 valer-8 M)D>;BT) =>=T)M;= F>A=>U= ;QU=U= UB >=U)=P>BT;BUL >DU ;=XF>U G>nternetH& Qniversidad Bacional0 '""& p& !–!& ;vailale from: 2ttp:..EEE&di#ital&unal&edu&co.!/'".!./*/"3%5&'""&pdf
